Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU I.1 Đặt vấn đề Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) biết đến trồng từ lâu đời Năm 1994 diện tích đậu tương giới khoảng 61571000 với suất bình quân đạt 2078 kg/ha Sản lượng đạt 10 triệu tấn/năm Điều khẳng định đậu tương trồng quan trọng nông nghiệp.[2] Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành loại họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm hạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giầu giá dinh dưỡng thực phẩm có vai trị quan trọng cho người gia súc Từ hạt đậu tương chế biến nhiều sản phẩm khác như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn, đậu phụ, tào phớ, sữa đậu nành,… sản phẩm công nghiệp chế biến từ đậu tương có lợi cho sức khoẻ người, góp phần chống suy dinh dưỡngvà bệnh thần kinh, tim mạch Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein hạt đậu tương có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể 12-24% Bên cạnh đó, có khả cố định đạm tự nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương trồng bảo vệ đất chống xói mịn Cuối đậu tương cịn góp phần giải công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người nông dân [2] Nền nông nghiệp nước ta phát triển với văn minh lúa nước, tất nhiên khơng mà đậu tương chỗ đứng Đậu tương nằm trồng quan trọng việc phát triển đậu tương trọng Tuy nhiên, suất đậu tương thường thấp bị ảnh hưởng hạn hán dịch bệnh Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng suất đậu tương Bên cạnh cịn có phá hoại năm loại dịch bệnh phổ biến cơng đậu tương, bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử, tàn lụi vi khuẩn, đốm [1, 3] Các loại bệnh hại hạn hán gây tổn thất không nhỏ suất đậu tương Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học chi phí sản xuất cao gây ảnh hưởng đến môi trường Rõ ràng, đậu tương thực phẩm thiết yếu, suất giống đậu tương lại bị ảnh hưởng hạn hán sâu bệnh hại Chính lẽ cần có biện pháp cải tạo giống nhằm đem lại hiệu cao nông nghiệp Với phát triển mạnh mẽ khoa học, đặc biệt lĩnh vực cơng nghệ sinh học có lẽ phương pháp chuyển gene lựa chọn tối ưu phù hợp với tình hình Có nhiều phương pháp chuyển gene vào thực vật, phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro nhằm tạo trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ thành công cao Tuy nhiên, đậu tương (glycine max L) khó tái sinh nuôi cấy invitro, đặc biệt việc tái sinh callus có nguồn gốc từ chồi, mầm phơi… Đã có nhiều nghiên cứu việc tái sinh đậu tương thông qua quan như: mầm, mắt thật (Barwale Cs 1986, Kim Cs 1990), thật non (Wright Cs 1987), phôi soma (Lazzeri Cs 1985, Rouch Cs, 1985) [3]… Để phục vụ cho công tác nhân invitro bảo tồn nguồn gen đặc biệt chọn giống thông qua chuyển gen, tạo giống có khả kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… Chúng tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống đậu tương” I.2 Mục đích, ý nghĩa, yêu cầu I.2.1 Mục đích Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống đậu tương kỹ thuật nuôi cấy in vitro với cơng đoạn chính: ni cấy, tái sinh để phục vụ nghiên cứu chuyển gen, nhân giống, bảo tồn in vitro… I.2.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu nhằm tìm mơi trường phù hợp để tái sinh đậu tương in vitro nuôi cấy mơ số giống đậu tương Từ xây dựng quy trình ni cấy mơ đậu tương từ đỉnh sinh trưởng hai giống đậu tương DT84 DT2001 - Ý nghĩa thực tiễn: Tạo đậu tương nuôi cấy mô thành công ứng dụng việc nhân giống đậu tương bệnh tạo đậu tương biến đổi gen, góp phần vào phát triển Nông nghiệp bền vững I.2.3 Yêu cầu (1) Xác định quy trình khử trùng mẫu để tạo mẫu mơi trường ni cấy thích hợp (2) Xác định nồng độ BAP lên khả tạo thể protocorm giống cao (3) Xác định nồng độ Zeatin lên khả tái sinh chồi từ thể protocorm hai giống lớn I.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu I.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu giống đậu tương DT84, DT2001 I.3.2 Phạm vi nghiên cứu * Địa điểm: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp (Km Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội) * Thời gian: từ 23/2/2011 đến 22/5/2011 * Điều kiện nghiên cứu: - Phịng ni cấy: Nhiệt độ: 250C Cường độ ánh sáng 2000 lux - Thời gian chiếu sáng: 10giờ/ ngày - Các dụng cụ, buồng cấy khử trùng cồn nhiệt * Các hóa chất dùng để pha mơi trường ni cấy - Các muối khống đa lượng, vi lượng, vitamin B5, phytagel, MES, chất điều hòa sinh trưởng: BAP, Zeatin, GA3, Glutamin, Asparagin Nguồn cacbon: Đường saccaroza PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Lịch sử phát triển, sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật II.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô thực vật (hay cịn gọi ni cấy thực vật in vitro) q trình nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất kỹ thuật nuôi cấy phận khác (tế bào, mô, quan) thực vật môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng (15, 22, 29) II.1.2 Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật II.1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1965, Robert Hooke quan sát kính hiển vi lát cát miếng lạc thấy phần mô thực vật cấu tạo nhiều tập hợp đưa khái niệm “tế bào – cell” Anten Vanleuwen Hock (1632 – 1723) thiết kế kính hiển vi khuếch đại 270 lần, lần đầu đưa vào quan sát thấy vi khuẩn, tế bào dịch người hay động vật Năm 1965, phát thấy tế bào động vật gồm nhiều tế bào động Năm 1838 - 1839 Natthias Schleiden Theodore Schwann đề xướng học thuyết sinh học gọi học thuyết tế bào, khẳng định: + Mọi thể sống cấu tạo nhiều tế bào + Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, hình thức nhỏ sống + Tế bào cấu tạo từ tế bào tồn trước (và mang đầy đủ thơng tin di truyền từ tế bào sinh nó) Năm 1875 Oscar Hertw’g quan sát kính hiển vi cho thụ thai hợp tinh trùng trứng Sau Hermann P, Butschili Schneider FA mơ tả xác q trình phân chia tế bào Năm 1902, Haberlandt người đưa giả thu.yết tính tồn tế bào vào thực nghiệm Theo ơng, tất tế bào thực vật có tính tồn năng, tế bào mang lượng thơng tin di truyền đầy đủ thể gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành thể hoàn chỉnh Năm 1922, Kotte người Mỹ học trò Haberlandt Robbins lặp lại thực nghiệm Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ hịa thảo Trong mơi trường lỏng gồm có muối khoáng glucose, đầu rễ sinh trưởng mạnh, tạo nên hệ thống có rễ phụ Giai đoạn làm sở cho việc chọn mẫu cấy nghiên cứu thành phần môi trường giai đoạn sau Năm 1929 - 1933 Bchumuker, Scheitter, Pfcifer Lance thành công việc nuôi cấy đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai lịch sử nuôi cấy mô thực vật, White (Hoa Kỳ) nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) thời gian dài muối khoáng, glucose nước chiết nấm men Sau đó, nước chiết nấm men thay loại vitamin nhóm B: thiamin (B1), pyridoxine (B6) nicotinic acid Từ đó, việc ni cấy đầu rễ thời gian vô hạn tiến hành nhiều khác Cũng năm 1934, Kogl lần xác định vai trò IAA (Indol Acetic Acid), hoocmon thực vật thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trưởng phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) cà rốt thuốc lá, mơ sẹo có khả sinh trưởng liên tục Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo nghiên cứu tổng hợp thành công, Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy với nước dừa, NAA 2,4 D giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công nhiều đối tượng thực vật mà trước khó nuôi cấy Năm 1955, Miller cộng phát minh cấu trúc sinh tổng hợp kinetin – cytokinin đóng vai trị quan trọng phân bào phân hố chồi mơ ni cấy Năm 1957, Skoog Miler công bố kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ chất auxin/ cytokinin môi trường phát sinh quan (rễ chồi) mô sẹo thuốc Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin < mơ có xu hướng hình thành chồi Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin > mơ sẹo có khuynh hướng phát triển rễ Tỷ lệ auxin/ cytokinin thích hợp kích thích phân hóa chồi rễ, tạo hoàn chỉnh Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào đơn phát triển Muir, Hildebrandt Riker tách tế bào mô sẹo thành tế bào đơn cách sử dụng máy lắc Năm 1960, Morel thực bước ngoặt cách mạng sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhân nhanh loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật Cũng năm này, Bergman cơng bố dùng phương pháp lọc đơn giản để thu hầu hết tế bào đơn mà khơng dính cụm Cùng với kỹ thuật gieo tế bào Bergman, nhiều tác giả thành công việc tạo hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh tính tồn tế bào Năm 1964, Guha Maheshwari lần thành công tạo đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt Đầu năm 1970, Nagata Takebe (Nhật) thành công việc làm cho protoplast tách từ mô thuốc tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên quần thể tế bào môi trường lỏng Năm 1972 Carlson cộng lần thực lai tế bào soma loài, tạo từ dung hợp tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfi Năm 1978, Melcher cộng tạo lai soma cà chua – thuốc dung hợp tế bào trần Năm 1979, Marton cộng xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần đồng nuôi cấy tế bào trần Agrobacterium Từ năm 1980 đến 1992, nhiều thành công lĩnh vực công nghệ gen thực vật công bố, hàng loạt cơng trình chuyển gen ngoại lai vào nhiều họ thực vật Khả nhân giống phục tráng trồng thể rõ rệt ứng dụng nuôi cấy mô thực vật Morel (1960) nhận thấy đỉnh sinh trưởng loài địa lan (Cymbidium) đem ni cấy hình thành protocorm Khi chia cắt protocorm ni cấy tiếp thu protocorm Khi nuôi điều kiện định protocorm phát triển thành lan con, tạo dịng vơ tính khơng bị nhiễm virus Kỹ thuật đặc biệt có giá trị như: khoai tây, ăn nhiều nhân giống vơ tính khác Năm 1993, Kranz Lorz thực thụ tinh invitro tạo nuôi cấy phơi hợp tử ngơ Các q trình phát triển phân hố phơi sau quan sát kính hiển vi phân tích biểu gen nhằm xác định gen tham gia giai đoạn phát triển phôi Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật ứng dụng mạnh mẽ việc nhân giống, chọn tạo giống, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Nuôi cấy mô thực vật đưa vào chương trình chọn giống, nhân giống đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8] II 1.2.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật năm 1975 Phịng ni cấy mơ xây dựng Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam Tiến Sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Nhận thức triển vọng to lớn nuôi cấy mô chọn giống nhân giống trồng nông nghiệp, sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tự nhiên Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiên cứu Hạt Nhân xây dựng phịng ni cấy mơ thực vật, bước xây dựng tiềm lực khoa học đào tạo cán nghiên cứu vào ngành (Trần Văn Minh, 1999) [7] Theo Nguyễn Văn Uyển tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật Việt Nam đạt số thành tựu sau [8]: - Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L ) Viện Cơng Nghệ Sinh học - Nhân giống vơ tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển) - Nhân giống chuối (Mus a spp) - Nhân giống bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị Ái Thuyền - Nhân giống dứa Cayen Queen Long An - Ứng dụng ni cấy mơ nhân giống mía đường (Sacharum offciarum), nhân giống Vani (Vanilla sp) nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên) II.1.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng [6] Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Nuôi cấy non trưởng thành - Nuôi cấy quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn chưa thụ tinh - Ni cấy phơi: phôi non phôi trưởng thành - Nuôi cấy mô sẹo(callus) - Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào) - Nuôi cấy prôtplast: nuôi cấy tế bào trần Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính tồn tế bào dựa vào khả phân hoá – phản phân hố tế bào II.1.3.1 Tính tồn tế bào Năm 1902, Haberlandt quan niệm tế bào cở thể sinhvật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ phân hố mang tồn lượng thơng tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh tính tồn tế bào [6] Như vậy, tính tồn tế bào thực vật khả tế bào biệt hoá (trừ số tế bào biệt hoá sâu ống mạch, mao dẫn) có khả thể tồn hệ thống di truyền có khả phát triển thành hồn chỉnh II.1.3.2 Sự phân hố phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành nhóm thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh chưa mang chức riêng biệt (chun hố) Sau từ tế bào phôi sinh chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc biệt cho mơ, quan có chức khác Sự phân hố tế bào chuyển tế bào phơi sinh thành tế bào mơ chun hố, đảm nhận chức khác Ví dụ: Mơ dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mơ bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức dẫn nước dẫn dinh dưỡng Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành tế bào có chức chun, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phơi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hoá tế bào, ngược lại với phân hố tế bào Qúa trình phân hóa phản phân hóa tế bào biểu diễn sơ đồ sau: Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Trong đó: + Tế bào hợp tử tế bào ban đầu + Tế bào phôi sinh tế bào chưa có chức riêng biệt +Tế bào chuyên hóa tế bào mang chức riêng biệt [15] Về chất phân hố phản phân hố q trình hoạt hố, ức chế gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gene hoạt hoá (mà vốn trước bị ức chế) tính trạng mới, cịn số gene khác lại bị đình hoạt động Điều theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử DNA tế bào khiến trình sinh trưởng phát triển thể thực vật ln hài hồ Mặt khác, tế bào nằm khối mơ thể bình thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào giảm kích thước khối mô tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt hố gen tế bào Q trình phát sinh hình thái ni cấy mơ tế bào thực vật thực chất kết trình phân hố phản phân hố Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào xét kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) cách định hướng dựa vào phân hoá phản phân hoá tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật auxin cytokinin * Các giai đoạn trình nhân giống in vitro +Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị tạo mẹ bệnh nuôi cấy khởi động + Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh Khử mô nuôi cấy sau xác định mẫu cấy (HgCl2, NaOCl, H2O2) Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định phơi vơ tính + Giai đoạn 3: Nhân nhanh + Giai đoạn 4: Tạo hoàn chỉnh + Giai đoạn 5: Đưa vườn ươm II.1.4 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro * Nuôi cấy phôi Năm 1921 Dieterich đưa kết luận phơi ni cấy invitro hồn tồn nảy mầm khơng qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa sở nghiên cứu Nhưng môi trường dinh dưỡng cho tạo phôi trưởng thành phôi non khác nhau, phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng * Nuôi cấy mô quan tách rời Năm 1946 Wetmare chứng minh phận nuôi cấy gặp điều kiện thuận lợi Với phận khác nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy khác Muốn trì sinh trưởng phát triển mơ quan ni cấy sau khoảng thời gian định ta phải cấy chuyển sang môi trường Ứng dụng: Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phù hợp với phận khác cây, tạo mô sẹo nhân in vitro * Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh Thường sử dụng mô đỉnh chồi đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến 1,0 mm Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Khi sử dụng mô phân sinh cần phải cân chất điều hòa sinh trưởng Ứng dụng: Tạo virus, nhân giống in vitro tạo đa bội thông qua xử lý Conxixin [16] * Nuôi cấy bao phấn Đã có nhiều kết nghiên cứu cho thấy hạt phấn ni cấy phát triển thành đơn bội hồn chỉnh điều kiện ni cấy in vitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp trung gian qua mô sẹo tạo quan 10 diện tích từ 203,6 nghìn giảm xuống cịn 185,6 nghìn sản lượng giảm từ 290,6 nghìn xuống cịn 186,9 nghìn năm 2006 Tuy nhiên, đánh giá tình hình sản xuất phát triển đậu tương nước thời gian qua (niên giám thống kê năm 2008) cho thấy: Tổng diện tích đậu tương đạt 204100 ha, sản lượng đạt 292000 tấn, suất đạt 1,43 tỉ /ha (năng suất cao khối Asean 58% so với bình quân giới) Thực tế, sản lượng đậu tương nước ta đáp ứng khoảng 15% nhu cầu chỗ Mặt khác, nhu cầu đậu tương giới ngày tăng, tính riêng Trung Quốc nhu cầu hàng năm 25-30 triệu tấn/ năm Do vậy, việc tăng sản lượng đậu tương vấn đề chiến lược Nơng nghiệp nước ta, cơng tác cải tạo giống đóng vai trị quan trọng tình hình [1] II.3 Lịch sử nghiên cứu ni cấy mơ đậu tương Đã có nhiều nghiên cứu việc tái sinh đậu tương thông qua nuôi cấy quan như: Lá mầm, mắt thật (Barwale Cs 1986, Kim Cs 1990), thật non (Wright Cs 1987), phôi soma (Lazzeri Cs 1985, Rouch Cs, 1985) Một phương pháp hiệu để tái sinh đậu tương thơng qua phơi vơ tính từ mô nuôi đậu tương Năm 1983, Christinanson & Cs cơng bố cơng trình ni cấy mơ đậu tương Sau có nhiều báo công bố (Lippmann, 1984; Lazzeri et al, 1985; Ranch et al, 1986; Parrott et al, 1988) [10] Hầu hết mẫu nuôi cấy ban đầu mầm, thân mầm, trụ mầm, thật để tạo phơi vơ tính ni cấy mơ Các phơi nhanh chóng phân hố thành chồi hay phận có ý nghĩa quy trình tái sinh [11] Cây đậu tương coi trồng khó tái sinh q trình ni cấy Đặc biệt callus có nguồn gốc từ mầm, từ chồi, phơi,… Và khơng tái sinh từ callus (Hu and Wang, 1999) Người ta cho có hai yếu tố then chốt đẫn tới thành cơng q trình ni cấy Một là, phản ứng kiểu gen môi trường nuôi cấy Hai là, tuổi thọ phận đem vào nuôi cấy Tất hai yếu tố ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp đến khả tái sinh đậu tương PHẦN BA: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 III.1 Vật liệu nghiên cứu: * Các giống đậu tương DT84 DT2001 Bộ môn Đột biến Ưu lai – Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp * Bộ phận lấy mẫu: Trong nghiên cứu sử dụng chủ yếu đỉnh sinh trưởng làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô Hạt đậu tương sau nảy mầm 3-5 ngày tách đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nghiên cứu Các giống đậu tương giống suất cao, thời gian sinh trưởng trung bình ngắn ngày, thâm canh tối đa vụ/ năm III.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu đề tài là: (1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu trước đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy (2) Ảnh hưởng BAP tới khả tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng (3) Ảnh hưởng Zeatin tới khả tái sinh chồi từ protocorm khả tái sinh chồi trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng III.3 Phương pháp nghiên cứu III.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng chủ yếu hố chất là: HgCl2, H2O2, cồn 70° Trước tiên, hạt đâụ tương rửa cồn 70° 30 giây để sơ loại mầm bệnh tăng hiệu khử trùng Sau ngâm 30 giây, đổ bỏ cồn rửa lại nước cất vô trùng lần Sau mẫu ngâm dung dịch HgCl2 0,1% H2O2 20% 10 phút Cuối cùng, rửa lại mẫu lần nước cất vô trùng Sau rửa mẫu, tiến hành cấy vào môi trường – mơi trường Murashige Skoog (MS) 23 Các bình ni cấy chuyển vào phịng ni cấy mơ điều kiện chiếu sáng 10h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 28°C Các thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hồn tồn, nhắc lại lần Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu sống Tổng số mẫu Tổng số mẫu chết Tổng số mẫu Tổng số mẫu nhiễm Tổng số mẫu x 100% x 100% x 100% III.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng BAP lên khả tạo thể protocorm Chúng tơi tiến hành thí nghiệm môi trường sau: MSP1: MS – B5+ 1,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP2: MS – B5+ 1,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP3: MS – B5+ 2,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP4: MS – B5+ 2,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel Hạt đậu tương sau vào mẫu nuôi cấy môi trường MS từ 5-7 ngày, cắt bỏ mầm, trụ mầm (cách mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh trưởng gắn liền với phần trụ mầm khoảng 5-6 mm cấy mơi trường có bổ sung BAP với nồng độ khác cấy chuyển vào môi trường MS chuẩn bị sẵn đưa vào phịng ni cấy mơ Để đánh giá mức độ phù hợp môi trường, tiến hành theo dõi tỷ lệ phần trăm protocorm tạo 24 Số protocorm tạo Tỷ lệ protocorm tạo = x 100% Tổng số đỉnh sinh trưởng cấy vào III.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng Zeatin lên khả tái sinh chồi từ thể protocorm Chúng sử dụng công thức môi trường sau: MSZ1: MS – B5+ 0,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ2: MS – B5+ 1,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ3: MS – B5+ 1,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ4: MS – B5+ 2,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel Các chồi/ cụm protocorm cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi để theo dõi ảnh hưởng Zeatin tới hình thành chồi số giống đậu tương Để đánh giá phù hợp môi trường tái sinh chồi, tiến hành theo dõi hệ số nhân chồi hai giống Hệ số tạo chồi = Số protocorm có chồi tạo thành Tổng số protocorm cấy vào môi trường x 100% III.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với phần mềm Excel IRRISTAT máy vi tính Kết thống kê trình bày bảng 25 PHẦN BỐN: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết xác định khử trùng mẫu Đưa mẫu từ bên ngồi vào ni cấy vơ trùng phải đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao tốc độ sinh trưởng nhanh Vì vậy, mơ thực vật trước đưa vào nuôi cấy cần phải trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng nuôi cấy mô, tránh để nấm, khuẩn làm hỏng mô cấy Chọn phương pháp khử trùng đưa lại tỷ lệ sống cao môi trường dinh dưỡng thích hợp đạt tốc độ sinh trưởng nhanh Như vậy, thấy giai đoạn khử trùng có ý nghĩa định nâng cao hiệu kinh tế kỹ thuật nuôi cấy Các hố chất thường sử dụng để khử trùng mơ nuôi cấy là: Ca(OCl)2, HgCl2 H2O2 Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng loại hố chất khử trùng: - HgCl2 nồng độ 0,1% - H2O2 nồng độ 20% - Cồn nồng độ 700 Chúng sử dụng hai giống đậu tương: DT84, DT2001 Hạt đậu tương rửa cồn 700 30 giây để sơ loại mầm bệnh tăng hiệu khử trùng Sau ngâm 30 giây, đổ bỏ cồn rửa lại nước cất vô trùng lần Sau mẫu ngâm dung dịch HgCl2 0,1% dung dịch H2O2 10 phút Cuối cùng, rửa lại mẫu lần nước cất vô trùng Các dụng cụ panh, kẹp khử trùng lửa đèn cồn tồn q trình khử trùng tiến hành tủ cấy vô trùng Sau rửa nước cất hạt giống cấy vào môi trường Murashige Skoog (MS) Tất nhiên, môi trường MS chuẩn bị trước loại bỏ mầm bệnh nồi khử trùng 121°C 20 phút 26 Các bình ni cấy chuyển vào phịng ni cấy mô nhiệt độ 28oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ ngày Trong điều kiện phịng ni cấy mơ, chúng tơi giữ ổn định nhiệt độ, cường độ chiếu sáng độ ẩm khơng khí để theo dõi khả khử trùng hoá chất thời gian khác hai giống đậu tương nghiên cứu Kết khử trùng thể bảng 1: Bảng 1: So sánh hiệu khử trùng hạt đậu tương hoá chất thời gian khác nhau: Giống Hoá chất DT84 HgCl2 H2O2 HgCl2 H2O2 DT2001 Số mẫu đưa vào 100 100 100 100 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 2,3 4,7 1,7 3,3 Tỷ lệ nảy mầm (%) 92,3 94,7 94,3 97 Để đánh giá hiệu công thức khử trùng giống đậu tương dựa tiêu sau: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ nảy mầm cao, mầm khoẻ, sức sống tốt sử dụng Với giống đậu tương nghiêm cứu thử nghiệm hai loại hoá chất khử trùng để xác định hiệu khử trùng loại giống đậu tương khác Những giống đậu tương khác có phản ứng khác tuỳ thuộc vào hoá chất khử trùng Hiệu khử trùng tốt có tỷ lệ nảy mầm cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp Kết khử trùng minh hoạ cụ thể bảng biểu đồ 1, 2: 27 Tỷ lệ nảy mầm (%) 100 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 94.7 92.3 90 80 70 60 50 40 30 20 10 4.7 2.3 HgCl2 H2O2 Biểu đồ 1: Kết khử trùng giống DT84 Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 120 100 97 94.3 3.3 H2O2 1.7 HgCl2 80 60 40 20 Biểu đồ 2: Kết khử trùng giống DT2001 Đối với giống đậu tương DT84: qua biểu đồ ta thấy, sử dụng HgCl2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (2,3%); nhiên sử dụng H2O2 để khử trùng lại có tỷ lệ nảy mầm cao (94,7%) tỷ lệ mẫu nhiễm không cao (4,7%) Tương tự, giống DT2001 từ biểu đồ cho thấy, sử dụng H2O2 để khử trùng cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao (97%); đồng thời có tỷ lệ mẫu nhiễm khơng đáng kể (4,3%) 28 Mục đích chủ yếu phương pháp khử trùng cho tỷ lệ mẫu bệnh cao, nhiên bên cạnh cần quan tâm tới tỷ lệ nảy mầm để đảm bảo có đủ vật liệu cho thí nghiệm quy trình ni cấy mơ Nếu sử dụng H 2O2 để khử trùng cách tiến hành đơn giản hơn, tốn khơng độc hại cho người mơi trường Chính vậy, quy trình ni cấy mơ đậu tương sử dụng phương pháp khử trùng mẫu H2O2 để đem lại hiệu phù hợp với thực tiễn Như trình bày trên, với giống đậu tương khác có phản ứng khơng giống phương pháp khử trùng áp dụng Sự phản ứng khác thể tỷ lệ hạt nảy mầm (%) tỷ lệ mẫu nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nảy mầm giống đậu tương khác khhi sử dụng hai loại hoá chất khử trùng HgCl2 H2O2 (biểu đồ biểu đồ 4) cho thấy hhiệu khử trùng hoá chất khác tới hai giống đậu tương nghiên cứu HgCl2 H2O2 4.7 4.5 3.5 3.3 2.5 2.3 1.7 1.5 0.5 DT84 DT2001 Biểu đồ 3: Tỷ lệ nhiễm (%) xử lý khử trùng HgCl2 H2O2 29 HgCl2 H2O2 98 97 97 96 94.7 95 94 93 94.3 92.3 92 91 90 89 DT84 DT2001 Biểu đồ 4: Tỷ lệ nảy mầm (%) xử lý khử trùng HgCl2 H2O2 Về tỷ lệ mẫu nhiễm: Với loại hoá chất khử trùng (HgCl2 H2O2): tỷ lệ mẫu nhiễm giống đậu tương DT84 cao so với giống đậu tương DT2001 Đối với hai giống đậu tương ta thấy: Nếu dùng HgCl2 để khử trùng ln cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tức có tỷ lệ mẫu bệnh cao Tuy nhiên, dùng H2O2 để khử trùng không tốt hóa chất HgCl2, tỷ lệ mẫu nhiễm mức chấp nhận Về tỷ lệ nảy mầm: Sử dụng hóa chất khử trùng H2O2 tỷ lệ nảy mầm cao giống đậu tương DT2001 (97%), tỷ lệ nảy mầm thấp giống đậu tương DT84 (94,7%) Tương tự vậy, khử trùng HgCl2 giống DT2001 có tỷ lệ nảy mầm cao (94,3%) so với giống DT84 (92,3%) Mặt khác hai giống đậu tương nghiên cứu, thấy hạt đậu tương xử lý qua H2O2 thường có tỷ lệ nảy mầm cao so với hạt đậu tương qua xử lý HgCl2 (biểu đồ 4) 30 Nhận xét: Rửa qua cồn 700, sau ngâm hạt dung dịch H2O2 20% 10 phút phương pháp khử trùng đem lại hiệu cao hai giống đậu tương DT84 DT2001 Kết xác định ảnh hưởng BAP lên khả tạo protocorm Cytokinin nhóm chất điều hịa sinh trưởng có tác dụng kích thích phân chia ức chế già hóa tế bào Trong nhóm cytokinin, BAP chất sử dụng nhiều với mục đích khác Vì vậy, nghiên cứu sử dụng BAP để tạo thể protocorm Hạt đậu tương sau vào mẫu nuôi cấy môi trường MS từ 5-7 ngày, cắt bỏ mầm, trụ mầm (cách mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh trưởng gắn liền với phần trụ mầm khoảng 5-6 mm cấy mơi trường có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau, sau đưa vào phịng ni cấy mô Sau tuần nuôi cấy, kết thu bảng cho thấy: Bảng 2: Ảnh hưởng BAP lên khả tạo thể protocorm sau tuần Giống Số mẫu đưa vào Tỷ lệ tạo protocorm (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Ghi 0,5 45 100 Chồi đơn MSP2 1,0 45 21,5 79,3 Chồi đơn MSP3 1,5 45 83,7 18,5 Chồi đơn MSP4 2,0 45 61,5 39,3 Chồi đơn MSP1 DT2001 Nồng độ BAP (mg/ l) MSP1 DT84 Môi trường 0,5 45 100 Chồi đơn MSP2 1,0 45 23,7 76,3 Chồi đơn MSP3 1,5 45 87,4 12,6 Chồi đơn MSP4 2,0 45 65,1 34,9 Chồi đơn 31 Tỷ lệ protocorm (%) 83,7 90 DT84 80 70 61,5 60 50 40 30 21,5 20 10 0 0,5 1,5 Nồng độ Biểu đồ 5: Tỷ lệ protocorm sau tuần nuôi cấy giống DT84 Tỷ lệ protocorm (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 87,4 DT2001 65,1 23,7 0,5 1,5 Nồng độ Biểu đồ 6: Tỷ lệ protocorm sau tuần nuôi cấy giống DT2001 Như ta thấy hai giống đậu tương nghiên cứu, tỷ lệ tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng tăng nồng độ từ 0,5 mg/l tới 2,0 mg/l khả tạo thể protocorm cao hai giống DT84 DT2001 môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP) Cụ thể tỷ lệ tạo protocorm tối ưu giống DT84 83,7% (MSP3); giống DT2001 87,4% (MSP3) Với loại mơi trường định khả tạo protocorm giống khác không giống Ở hầu hết mơi trường nghiên cứu giống DT2001 có tỷ lệ tạo protocorm cao nhất; giống DT84 cho tỷ lệ tạo protocorm thấp 32 Với môi trường MSP1 (0,5 mg/l BAP) hai giống DT84 DT2001 không tạo protocorm mà phát triển thành chồi đơn Rõ ràng, giống khác có nguồn gốc, đặc tính di truyền khơng giống Vì vậy, chúng có phản ứng khác (thể tỷ lệ tạo thể protocorm) mơi trường khơng giống Điều hồn toàn hợp với quy luật sinh học Vấn đề cần nghiên cứu để tìm mơi trường phù hợp cho tỷ lệ tạo protocorm cao Nhận xét: Đối với hai giống đậu tương DT84 DT2001 sử dụng môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP) tốt để tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng Kết xác định ảnh hưởng Zeatin lên khả tái sinh chồi từ thể protocorm Đã có số nghiên cứu thành cơng tái sinh chồi từ mầm non trục phôi non đậu tương (Samoylow & CS, 1988), đậu (Witfrikysely & Hans-jory Jacobsen, 1989), đậu mỏ két (Settu & Kanji thakumari, 1999) đậu đũa (Prem Anand & CS, 2001)… mơi trường có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BAP, NAA, Zeatin… Trong nghiên cứu này, sử dụng Zeatin nồng độ khác nhau, có bổ sung thêm GA3, Glutamin, Asparagin MES Zeatin thuộc nhóm cytokinin, dẫn xuất adenin Chúng có tác dụng kích thích phân bào tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy nói riêng, từ mơ chưa biệt hóa nói chung Vì đậu tương khó tái sinh nghiên cứu này, sử dụng Zeatin để kích thích hình thành chồi từ thể protocorm Các chồi/ cụm protocorm cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi với các nồng độ Zeatin khác để theo dõi ảnh hưởng Zeatin tới hình thành chồi hai giống đậu tương 33 Sau tuần nuôi cấy kết thu bảng 3: Bảng 3:Ảnh hưởng Zeatin lên khả tạo chồi thể protocorm Nồng độ zeatin (mg/ l) Số mẫu đưa vào Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/ cụm protocorm MSZ1 0,1 15 MSZ2 0,5 15 26,7 2,8 MSZ3 1,0 15 64,6 10,8 MSZ4 1,5 15 46,7 4,4 MSZ5 2,0 15 31,3 3,7 MSZ1 0,1 15 4,6 MSZ2 0,5 15 35,3 3,12 MSZ3 1,0 15 86,7 12,4 MSZ4 1,5 15 71,3 5,6 MSZ5 Giống Môi trường 2,0 15 44,4 4,2 DT84 DT2001 Ghi Chồi phát triển Chồi phát triển Chồi xanh, phát triển tốt Chồi phát triển Chồi phát triển Chồi phát triển Chồi phát triển Chồi xanh phát triển tốt Chồi phát triển Chồi phát triển Tỷ lệ tạo chồi (%) 80 64,6 60 46,7 40 20 DT84 31,3 26,7 0,1 0,5 1,5 Nồng độ Biểu đồ 7: Tỷ lệ tái sinh chồi từ thể protocorm sau tuần nuôi cấy giống DT84 34 Tỷ lệ tạo chồi (%) 100 86,7 60 44,4 35,3 40 20 DT2001 71,3 80 4,6 0,1 0,5 1,5 Nồng độ Biểu đồ 8: Tỷ lệ tái sinh chồi từ thể protocorm sau tuần nuôi cấy giống DT2001 Qua bảng số liệu ta thấy nồng độ 0,1 mg/l Zeatin, tỷ lệ tạo chồi cao giống DT2001 (86,7%) giống DT84 (64,6%), với số chồi/ cụm protocorm cao giống DT2001 12,4 giống DT84 10,8 chồi, chồi xanh, khoẻ, dài Và khả tái sinh chồi thấp nồng độ 0,1 mg/l Zeatin, đạt 4,6% giống DT2001 2% giống DT84, chồi phát triển có chồi đơn 35 PHẦN NĂM: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ klết nghiên cứu thu rút số kết luận sau: Đã tái sinh đậu tương từ mẫu cấy đỉnh sinh trưởng hai giống DT84 DT2001: Môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP) phù hợp để tạo protocorm từ đỉnh sinh trưởng hai giống DT84 DT2001 MSP3: MS – B5+ 2,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel Cho tỷ lệ tạo protocorm cao 83,7% giống DT84 87,4 giống DT2001 Tỷ lệ tái sinh chồi từ protocorm nguồn gốc đỉnh sinh trưởng giống đậu tương DT2001 cao so với giống đậu tương DT84 Tỷ lệ tạo chồi cao 84,6% giống DT2001 64,6% giống DT84 môi trường MS-B5 + 1mg/l zeatin + 0,2 mg/l GA3 + 30 mg/l Glutamin + 25 mg/ l Asparagin + 600 mg/l MES + 3% đường saccaroza + 0,3% phytagel, với số chồi/cụm protocorm 12,4 chồi giống DT2001 10,8 chồi giống DT84 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu khả tái sinh chồi từ callus Tiếp tục khảo sát khả tái sinh chồi từ thể protocorm số giống đậu tương khác Tiếp tục nghiên cứu môi trường rễ chồi tạo từ thể protocorm giống đậu tương Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô giống đậu tương khác để làm phong phú thêm nguyên liệu cho công tác nhân in vitro bảo tồn nguồn gen đặc biệt phục vụ cho công tác chuyển gen 36 ... Đề tài nghiên cứu nhằm tìm mơi trường phù hợp để tái sinh đậu tương in vitro nuôi cấy mô số giống đậu tương Từ xây dựng quy trình ni cấy mơ đậu tương từ đỉnh sinh trưởng hai giống đậu tương DT84... tục nghiên cứu khả tái sinh chồi từ callus Tiếp tục khảo sát khả tái sinh chồi từ thể protocorm số giống đậu tương khác Tiếp tục nghiên cứu môi trường rễ chồi tạo từ thể protocorm giống đậu tương. .. nhân invitro bảo tồn nguồn gen đặc biệt chọn giống thông qua chuyển gen, tạo giống có khả kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… Chúng tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống đậu tương? ??