Đưa mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Vì vậy, mô thực vật trước khi đưa vào nuôi cấy cần phải trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng trong nuôi cấy mô, tránh để nấm, khuẩn làm hỏng mô cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Như vậy, có thể thấy giai đoạn khử trùng có ý nghĩa quyết định và nâng cao hiệu quả kinh tế của kỹ thuật nuôi cấy. Các hoá chất thường được sử dụng để khử trùng mô nuôi cấy là: Ca(OCl)2, HgCl2 và H2O2.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các loại hoá chất khử trùng: - HgCl2 nồng độ 0,1%
- H2O2 nồng độ 20% - Cồn nồng độ 700
Chúng tôi đã sử dụng hai giống đậu tương: DT84, DT2001. Hạt đậu tương được rửa bằng cồn 700 trong 30 giây để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi ngâm trong 30 giây, đổ bỏ cồn và rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 lần.
Sau đó mẫu được ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% hoặc dung dịch H2O2 trong 10 phút.
Cuối cùng, rửa lại mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Các dụng cụ như panh, kẹp đều được khử trùng bằng ngọn lửa đèn cồn và toàn bộ quá trình khử trùng được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
Sau khi rửa bằng nước cất các hạt giống được cấy vào môi trường Murashige Skoog (MS). Tất nhiên, môi trường MS đã chuẩn bị trước và được loại bỏ mầm bệnh bằng nồi khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 28oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ ngày. Trong điều kiện phòng nuôi cấy mô, chúng tôi giữ ổn định về nhiệt độ, cường độ chiếu sáng và độ ẩm không khí để theo dõi khả năng khử trùng của hoá chất ở các thời gian khác nhau đối với hai giống đậu tương nghiên cứu. Kết quả khử trùng được thể hiện ở bảng 1:
Bảng 1:
So sánh hiệu quả khử trùng hạt đậu tương bằng hoá chất ở thời gian khác nhau:
Giống Hoá chất Số mẫu đưa vào Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ nảy mầm (%)
DT84 HgCl2 100 2,3 92,3
H2O2 100 4,7 94,7
DT2001 HgCl2 100 1,7 94,3
H2O2 100 3,3 97
Để đánh giá hiệu quả các công thức khử trùng đối với từng giống đậu tương chúng tôi dựa trên các chỉ tiêu sau: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ nảy mầm cao, mầm cây khoẻ, sức sống tốt được sử dụng.
Với mỗi giống đậu tương nghiêm cứu đều thử nghiệm cả hai loại hoá chất khử trùng để xác định được hiệu quả khử trùng của mỗi loại đối với từng giống đậu tương khác nhau.
Những giống đậu tương khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau tuỳ thuộc vào từng hoá chất khử trùng. Hiệu quả khử trùng tốt nhất nếu có tỷ lệ nảy mầm cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp.
94.7 92.34.7 2.3 4.7 2.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 H2O2 HgCl2
Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Biểu đồ 1: Kết quả khử trùng giống DT84
97 94.3 3.3 1.7 0 20 40 60 80 100 120 H2O2 HgCl2
Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Biểu đồ 2: Kết quả khử trùng giống DT2001
Đối với giống đậu tương DT84: qua biểu đồ 1 ta thấy, sử dụng HgCl2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn (2,3%); tuy nhiên nếu sử dụng H2O2 để khử trùng thì lại có tỷ lệ nảy mầm rất cao (94,7%) trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm không cao (4,7%).
Tương tự, đối với giống DT2001 từ biểu đồ 2 cho thấy, sử dụng H2O2 để khử trùng sẽ cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao (97%); đồng thời có tỷ lệ mẫu nhiễm không đáng kể (4,3%).
Mục đích chủ yếu của các phương pháp khử trùng là cho tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao, tuy nhiên bên cạnh đó chúng ta cũng cần quan tâm tới tỷ lệ nảy mầm để đảm bảo có đủ vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình nuôi cấy mô. Nếu sử dụng H2O2 để khử trùng thì cách tiến hành sẽ đơn giản hơn, ít tốn kém và không độc hại cho con người cũng như môi trường.
Chính vì vậy, trong quy trình nuôi cấy mô đậu tương chúng tôi sử dụng phương pháp khử trùng mẫu bằng H2O2 để đem lại hiệu quả hơn và phù hợp với thực tiễn.
Như đã trình bày ở trên, với mỗi giống đậu tương khác nhau sẽ có phản ứng không giống nhau đối với từng phương pháp khử trùng được áp dụng. Sự phản ứng khác nhau thể hiện ở tỷ lệ hạt nảy mầm (%) và tỷ lệ mẫu nhiễm (%).
So sánh tỷ lệ nảy mầm của các giống đậu tương khác nhau khhi sử dụng hai loại hoá chất khử trùng là HgCl2 và H2O2 (biểu đồ 3 và biểu đồ 4) cho thấy hhiệu quả khử trùng của các hoá chất khác nhau tới hai giống đậu tương nghiên cứu.
2.3 1.7 1.7 4.7 3.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 DT2001 DT84 HgCl2 H2O2
92.3 94.7 94.7 94.3 97 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 DT2001 DT84 HgCl2 H2O2
Biểu đồ 4: Tỷ lệ nảy mầm (%) khi xử lý khử trùng bằng HgCl2 và H2O2 Về tỷ lệ mẫu nhiễm:
Với cùng một loại hoá chất khử trùng (HgCl2 và H2O2): tỷ lệ mẫu nhiễm ở giống đậu tương DT84 cao hơn so với giống đậu tương DT2001.
Đối với hai giống đậu tương ta thấy: Nếu dùng HgCl2 để khử trùng thì luôn cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tức là có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao.
Tuy nhiên, nếu dùng H2O2 để khử trùng tuy không tốt bằng hóa chất HgCl2, nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức chấp nhận được.
Về tỷ lệ nảy mầm:
Sử dụng hóa chất khử trùng là H2O2 tỷ lệ nảy mầm là cao nhất ở giống đậu tương DT2001 (97%), tỷ lệ nảy mầm thấp hơn ở giống đậu tương DT84 (94,7%). Tương tự như vậy, khử trùng bằng HgCl2 thì ở giống DT2001 có tỷ lệ nảy mầm cao hơn (94,3%) so với giống DT84 (92,3%)
Mặt khác đối với hai giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng hạt đậu tương được xử lý qua H2O2 thường có tỷ lệ nảy mầm cao hơn so với hạt đậu tương qua xử lý bằng HgCl2 (biểu đồ 4)
Nhận xét:
Rửa qua bằng cồn 700, sau đó ngâm hạt trong dung dịch H2O2 20% trong 10 phút là phương pháp khử trùng đem lại hiệu quả cao đối với hai giống đậu tương DT84 và DT2001.