Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của giống đậu tương DT84 và DT2001 thông qua nuôi cấy mô
MỤC LỤC
Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô cây đậu tương
Một trong những phương pháp hiệu quả nhất để tái sinh cây đậu tương là thông qua phôi vô tính từ các mô nuôi đậu tương. Năm 1983, Christinanson & Cs đã công bố công trình đầu tiên về nuôi cấy mô đậu tương. Hầu hết các mẫu nuôi cấy ban đầu là lá mầm, thân mầm, trụ dưới lá mầm, lá thật đầu tiên để tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô.
Các phôi nhanh chóng phân hoá thành các chồi hay bất cứ bộ phận nào cũng đều có ý nghĩa trong quy trình tái sinh cây [11]. Cây đậu tương được coi là cây trồng khó tái sinh trong quá trình nuôi cấy. Người ta cho rằng có hai yếu tố then chốt đẫn tới thành công trong quá trình nuôi cấy.
Tất cả hai yếu tố này đều ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến khả năng tái sinh cây đậu tương.
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Các giống đậu tương DT84 và DT2001 do Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai – Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chủ yếu là đỉnh sinh trưởng làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô. Hạt đậu tương sau khi nảy mầm 3-5 ngày được tách đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nghiên cứu.
Các giống đậu tương trên đều là giống năng suất cao, thời gian sinh trưởng trung bình hoặc ngắn ngày, có thể thâm canh tối đa 3 vụ/ năm. (1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu trước khi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy. (3) Ảnh hưởng của Zeatin tới khả năng tái sinh chồi từ protocorm và khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng.
Trước tiên, hạt đâụ tương được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi rửa sạch mẫu, tiến hành cấy vào môi trường cơ bản – môi trường Murashige Skoog (MS). Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô trong điều kiện chiếu sáng 10h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, ở nhiệt độ 28°C.
Hạt đậu tương sau khi vào mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS từ 5-7 ngày, chúng tôi cắt bỏ 2 lá mầm, trụ dưới lá mầm (cách lá mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh trưởng gắn liền với phần trụ dưới lá mầm khoảng 5-6 mm cấy trên môi trường có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau cấy chuyển vào môi trường MS đã chuẩn bị sẵn và được đưa vào phòng nuôi cấy mô. Để đỏnh giỏ mức độ phự hợp của mụi trường, chỳng tụi tiến hành theo dừi tỷ lệ phần trăm protocorm được tạo ra. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm.
Các chồi/ cụm protocorm được cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi để theo dừi ảnh hưởng của Zeatin tới sự hỡnh thành chồi của một số giống đậu tương. Để đánh giá sự phù hợp của môi trường tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành theo dừi hệ số nhõn chồi của hai giống. Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với phần mềm Excel và IRRISTAT trên máy vi tính.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xác định khử trùng mẫu
Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 28oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ ngày. Trong điều kiện phòng nuôi cấy mô, chúng tôi giữ ổn định về nhiệt độ, cường độ chiếu sáng và độ ẩm không khí để theo dừi khả năng khử trựng của hoỏ chất ở cỏc thời gian khỏc nhau đối với hai giống đậu tương nghiên cứu. Để đánh giá hiệu quả các công thức khử trùng đối với từng giống đậu tương chúng tôi dựa trên các chỉ tiêu sau: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ nảy mầm cao, mầm cây khoẻ, sức sống tốt được sử dụng.
Với mỗi giống đậu tương nghiêm cứu đều thử nghiệm cả hai loại hoá chất khử trùng để xác định được hiệu quả khử trùng của mỗi loại đối với từng giống đậu tương khác nhau. Những giống đậu tương khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau tuỳ thuộc vào từng hoá chất khử trùng. Hiệu quả khử trùng tốt nhất nếu có tỷ lệ nảy mầm cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp.
Mục đích chủ yếu của các phương pháp khử trùng là cho tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao, tuy nhiên bên cạnh đó chúng ta cũng cần quan tâm tới tỷ lệ nảy mầm để đảm bảo có đủ vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình nuôi cấy mô. Nếu sử dụng H2O2 để khử trùng thì cách tiến hành sẽ đơn giản hơn, ít tốn kém và không độc hại cho con người cũng như môi trường. Chính vì vậy, trong quy trình nuôi cấy mô đậu tương chúng tôi sử dụng phương pháp khử trùng mẫu bằng H2O2 để đem lại hiệu quả hơn và phù hợp với thực tiễn.
Như đã trình bày ở trên, với mỗi giống đậu tương khác nhau sẽ có phản ứng không giống nhau đối với từng phương pháp khử trùng được áp dụng. So sánh tỷ lệ nảy mầm của các giống đậu tương khác nhau khhi sử dụng hai loại hoá chất khử trùng là HgCl2 và H2O2 (biểu đồ 3 và biểu đồ 4) cho thấy hhiệu quả khử trùng của các hoá chất khác nhau tới hai giống đậu tương nghiên cứu. Với cùng một loại hoá chất khử trùng (HgCl2 và H2O2): tỷ lệ mẫu nhiễm ở giống đậu tương DT84 cao hơn so với giống đậu tương DT2001.
Đối với hai giống đậu tương ta thấy: Nếu dùng HgCl2 để khử trùng thì luôn cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tức là có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao. Tuy nhiên, nếu dùng H2O2 để khử trùng tuy không tốt bằng hóa chất HgCl2, nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức chấp nhận được. Mặt khác đối với hai giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng hạt đậu tương được xử lý qua H2O2 thường có tỷ lệ nảy mầm cao hơn so với hạt đậu tương qua xử lý bằng HgCl2 (biểu đồ 4).
Kết quả xác định ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo protocorm
Với mỗi loại môi trường nhất định thì khả năng tạo protocorm của các giống khác nhau là không giống nhau. Ở hầu hết các môi trường nghiên cứu giống DT2001 có tỷ lệ tạo protocorm cao nhất; trong khi giống DT84 cho tỷ lệ tạo protocorm thấp hơn. Rừ ràng, cỏc giống khỏc nhau sẽ cú nguồn gốc, đặc tớnh di truyền khụng giống nhau.
Vì vậy, chúng sẽ có những phản ứng khác nhau (thể hiện bằng tỷ lệ tạo thể.
Kết quả xác định ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm
Biểu đồ 8: Tỷ lệ tái sinh chồi từ thể protocorm sau 5 tuần nuôi cấy của giống DT2001.
