Nghiên cứu khả năng tái sinh cây tỏi lý sơn allium sativum l từ phôi vô tính

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG HỒ CHUNG ANH QUÝ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.) TỪ PHƠI VƠ TÍNH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng, tháng năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.) TỪ PHƠI VƠ TÍNH Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : TS Võ Châu Tuấn Sinh viên thực : Hồ Chung Anh Quý Lớp : 15CNSH Đà Nẵng, tháng năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, ngày 24 tháng năm 2019 Sinh viên Hồ Chung Anh Quý LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sự Phạm, khoa Sinh – Môi trường, môn công nghệ sinh học, q thầy cơ, gia đình bạn bè tạo điều kiện thuận lợi vật chất tinh thần để em hồn thành để tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, thầy giáo trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em từ nhận đề tài hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Minh Lý, giúp đỡ em nhiều việc trau dồi kiến thức, kĩ thí nghiệm theo sát em suốt trình em thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 24 tháng năm 2019 Sinh viên Hồ Chung Anh Quý MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa tính 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Giới thiệu tỏi 10 1.1.1 Đặc điểm phân loại 10 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 10 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 10 1.1.4 Quy mô sản xuất giá trị kinh tế 11 1.2 Nhân giống kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.2.1 Cơ sở khoa học 11 1.2.2 Ưu, nhược điểm nhân giống vơ tính kỹ thuật ni cấy mô tế bào 12 1.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro 13 1.3 Giới thiệu phơi vơ tính thực vật 15 1.3.1 Lịch sử 15 1.3.2 Khái niệm 15 1.3.3 Sự phát sinh hình thái phơi vơ tính 16 1.3.4 Những điều kiện ảnh hưởng tới hình thành phơi vơ tính 18 1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro tỏi 21 1.4.1 Nhân giống in vitro tỏi đường phát sinh quan trực tiếp 21 1.4.2 Nhân giống in vitro tỏi đường phát sinh quan gián tiếp 22 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp vô trùng mẫu 24 2.2.2 Phương pháp tạo tỏi in vitro 25 2.2.3 Phương pháp cảm ứng tạo phôi gián tiếp 25 2.2.4 Tái sinh chồi 25 2.2.5 Ra rễ 25 2.2.6 Xử lý số liệu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả tạo callus 26 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D để khả phát sinh phôi 27 3.4 Ảnh hưởng 2,4-D, KIN NAA đến khả sinh phơi vơ tính 30 3.5 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi 32 3.6 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi 33 3.7 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D BAP B5 IAA IBA Kin MS NAA SH TDZ Cs ĐHST : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid : - benzyl amino purine : Gamborg (1968) : indole-3-acetic acid : indole - butyric acid : kinetin : Murashige Skoog (1962) : α-naphthalen acetic acid : Schenk Hildebrandt (1972) : thidiazuron : cộng : điều hòa sinh trưởng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 1.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Tổng quan nghiên cứu in vitro tái sinh quan trực tiếp Allium sativum L Tổng quan nghiên cứu in vitro tái sinh quan gián tiếp Allium sativum L Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả tạo callus Ảnh hưởng 2,4-D để khả phát sinh phôi soma Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả sinh phôi soma Ảnh hưởng 2,4-D, KIN NAA đến khả sinh phôi soma Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Trang 23 24 27 28 30 31 33 34 35 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.2 1.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên hình Những giai đoạn phát sinh phơi vơ tính mầm Những giai đoạn phát sinh phôi vô tính hai mầm Callus tỏi phát sinh từ lát cắt gốc thân Phơi hình cầu mơi trường 2,4-D Phôi phát sinh môi trường 2,4-D Kin Những giai đoạn phát sinh phôi môi trường MS bổ sung 2,4D, KIN NAA Chồi tái sinh môi trường MS bổ sung BAP Chồi tái sinh từ môi trường MS bổ sung BAP NAA Rễ phát sinh q trình ni cấy Trang 16 16 27 29 30 32 33 34 36 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Tỏi có tên khoa học Allium sativum L., có nguồn gốc từ Trung Á chủ yếu vùng Địa Trung Hải Châu Á, Châu Âu Châu Phi Từ lâu tỏi người biết đến sử dụng loại thảo dược quý dùng để điều trị bệnh loại gia thông dụng trình chế biến thực phẩm Đã có nhiều kết nghiên cứu cho thấy tỏi chứa kháng chất Allicin có khả ngăn ngừa phát triển vi khuẩn, ngồi chất allicin – kháng sinh thảo mộc mạnh, tỏi chứa hợp chất sulphur polyphenol có nhiều tác dụng sinh học khác 100 loại hợp chất chứa lưu huỳnh có giá trị y học cao, chất đóng vai trò chống ung thư thể người [1][10][12][13] Hiện Việt Nam có nhiều giống tỏi nhiều vùng chuyên canh trồng tỏi khác nhau, đặc biệt có tỏi Lý Sơn người tiêu dùng ưa chuộng với nhiều mặt hàng khác tỏi tươi, nước ép tỏi, tỏi lên men Tỏi Lý Sơn khác so với loại tỏi khác có mùi vị thơm ngon đặc trưng hàm lượng dược liệu có cao Trong hàm lượng allicin tỏi Lý Sơn chiếm 0,767% cao so với tỏi khác nước ta (0,67%) tỏi Trung Quốc (0,712%)[8] Do có đặc tính ưu việt nên tỏi Lý Sơn Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học Cơng nghệ thương hiệu nhãn hiệu tập thể Mặc dù có nhiều đặc tính tốt lượng tỏi Lý Sơn cung cấp cho thị trường hạn hẹp, việc canh tác tỏi Lý Sơn chịu tác động từ nhiều yếu tố khác điều kiện tự nhiên yếu tố ảnh hưởng lớn nhất, phương pháp canh tác chất lượng nguồn giống chi phối lớn đến sản lượng vùng chuyên canh tỏi Trong canh tác theo pháp truyền thống dẫn đến chất lượng suất ngày xuống, người nông dân thường lấy trực tiếp củ tỏi sản xuất để làm giống cho mùa vụ tiếp theo, hình thức sinh sản vơ tính tỏi từ làm cho giống tỏi ngày bị thối hóa [23] Giống bị suy thoái xuất nhiều bệnh biến dị di truyền khó kiểm sốt khắc phục, dẫn đến đặc tính ban đầu bị thay đổi, hàm lượng dược tính thấp, phát triển yếu, củ nhỏ, bị dị dạng [24] Ảnh hưởng lớn đến kinh tế thương hiệu tỏi Lý Sơn Để khắc phục vấn đề giống, nhiều nông dân chuyển vùng sản xuất tỏi để tránh sâu bệnh, sử dụng tép tỏi Lý Sơn trồng vùng khác để làm giống nhiên cách làm chẳng mang lại hiệu quả, mà làm ảnh hưởng tới đặc trưng riêng giống tỏi Lý Sơn Năm 2009, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp duyên hải Nam Trung Lý sơn để thực để tài “Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn” nhằm đưa giống tỏi Lý Sơn trở đặc tính ban đầu Đến lần, sau khử trùng tiếp dung dịch NaOCl 2% khoảng thời gian 10 phút cuối rửa mẫu vật nước cất lần [2] 2.2.2 Phương pháp tạo tỏi in vitro Mẫu sau khử trùng cắt bỏ mô bị tổn thương tiếp xúc với chất khử trùng , sau cấy vào mơi trường MS bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar để tạo tỏi in vitro, sau tuần sử dụng làm nguồn mẫu cho thí nghiệm 2.2.3 Phương pháp cảm ứng tạo phôi gián tiếp +Phương pháp tạo callus từ nguồn mẫu vật tỏi in vitro Lát cắt mẫu gốc thân nuôi cấy môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar, bổ sung (1-2) mg/L 2,4-D (0,5-2) mg/L Kin.Theo dõi đánh giá số lượng chất lượng callus sau tuần nuôi cấy Đánh giá khả phát sinh callus theo tiêu : số lượng, màu sắc, trạng thái +Phương pháp cảm ứng tạo phơi vơ tính từ callus Chọn dịng callus rắn có màu vàng tách thành khối có đường kính 0,2-0,3cm, ni cấy mơi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar, bổ sung riêng lẽ 2,4-D (0,251 mg/L),bổ sung kết hợp Kin (0,5-2mg/L) + 2,4-D (0,25-1 mg/L) kết hợp Kin (0 2mg/L) + 2,4-D (0,25-1 mg/L) + NAA (0-2 mg/L) Ghi nhận kết sau 4-5 tuần nuôi cấy Đánh giá khả phát sinh phôi vơ tính sau tuần ni cấy thơng qua : tỉ lệ phát sinh phơi vơ tính (mẫu phát sinh/ tổng số mẫu), số phơi (phơi/ mẫu) hình thái phôi 2.2.4 Tái sinh chồi Phôi trưởng thành phân lập sau tuần nuôi cấy cấy chuyển sang môi trường nầy mầm Môi trường nảy mầm chứa bao gồm MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung nhiều nồng độ BAP khác ( 0,25-2 mg/L) Hoặc bổ sung kết hợp BAP (0,252 mg/L) NAA (0-1 mg/L) Đánh giá khả tái sinh chồi sau tuần nuôi cấy thông qua tiêu: tỉ lệ tái sinh chồi (%), chiều cao chồi (cm), số (lá/ chồi) 2.2.5 Ra rễ Chồi tái sinh sau tuần chuyển sang môi trường rễ Môi trường rễ bao gồm MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung nhiều nồng độ NAA khác ( 0,5-3 mg/L) Đánh giá khả phát sinh rễ sau tuần nuôi cấy thông qua tiêu: Tỉ lệ phát sinh rễ (%), số lượng rễ chiều dài (cm) 2.2.6 Xử lý số liệu Thí nghiệm phát sinh callus tiến hành 30 mẫu, thí nghiệm phát sinh phôi, tái sinh chồi rễ tiến hành 20 mẫu, tất thí nghiệm bố trí lặp lại lần Số liệu xử lí thống kê xử lí cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS 22 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả tạo callus Mẫu lát cắt gốc thân chuyển sang môi trường MS bổ sung 2,4-D KIN để thăm dò khả tạo callus Kết sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả tạo callus Nồng độ chất ĐHST (mg/l) 2,4-D KIN 1,0 0,5 1,0 1,0 1,0 1,5 1,0 2,0 1,5 0,5 1,5 1,0 1,5 1,5 1,5 2,0 2,0 0,5 2,0 1,0 2,0 1,5 2,0 2,0 Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) 80,5 ± 0,5 50 ± 1,0 45,5 ± 1,5 40 ± 1,0 30 ± 1,0 33,5 ± 0,5 40,5 ± 0,5 43 ± 1,0 96 ± 2,0 60,5 ± 1,5 53 ± 1,0 46 ± 1,0 Hình thái callus Vàng nhạt, xốp Vàng nhạt, xốp Trắng, xốp Vàng, xốp Vàng nhạt, xốp Trắng, xốp Vàng nhạt, rắn Vàng nhạt, rắn Vàng tươi, rắn Vàng tươi, rắn Vàng, rắn Vàng, rắn Hình 3.1 Callus tỏi phát sinh từ lát cắt gốc thân A: Lát cắt gốc thân; B: callus phát sinh sau tuần nuôi cấy 26 Kết cho thấy bảng 3.1 cho thấy, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D thay đổi nồng độ KIN (0,5-2 mg/l) tỉ lệ tạo callus giảm dần theo nồng độ KIN, nồng độ 0,5 mg/l KIN cho tỉ lệ tạo callus 80%, hình thái callus có màu vàng nhạt xốp Khi nồng độ 2,4-D tăng lên 1,5 mg/l nồng độ KIN thay đổi từ 0,5 đến 2,0 mg/l, có xuất callus có màu vàng tươi, rắn nhiên tỉ lệ mẫu tạo thành callus mức thấp (30-43%) Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 2,0 mg/l bổ sung thay đổi nồng độ KIN, kết callus hình thành có tỉ lệ cao chất lượng tốt Đặc biệt nồng độ 2,0 mg/l 2,4-D 0,5mg/l KIN cho tỉ lệ phát sinh callus đạt 96% callus có màu vàng tươi, rắn chắc, đạt yêu cầu cho thí nghiệm Nghiên cứu Nguyễn Khắc Hưng cs (2017) kết hợp 2,4-D KIN (1,5 mg/l 2,4-D 0,5 mg/l KIN) cho cảm ứng phát sinh callus tốt Tỏi tỉnh Hà Giang với tỉ lệ 74,23% Bùi Thị Thơ cs đưa kết phát sinh callus tốt Tỏi cô đơn Lý Sơn với kết hợp 2,4-D KIN ( 2,0 mg/l 2,4-D 1,5 mg/l KIN) đạt tỉ lệ 86,67% sau 18-19 ngày nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D để khả phát sinh phơi Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng chất điều hịa sinh trưởng auxin đặc biệt 2,4-D để cảm ứng tạo phôi vô tính thực vật Vì nghiên cứu này, sử dụng 2,4-D để khảo sát khả phát sinh phôi Tỏi Mẫu callus nuôi cấy sau tuần, kết thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D để khả phát sinh phôi Nồng độ Tỷ lệ mẫu phát Số phơi/mẫu Hình thái phơi 2,4-D (mg/L) sinh phơi (%) 0,0 0,0 0,0b 0,25 0,0 0,0b ab 0,5 70 ± 1,0 1,9 ± 1,44 Phơi hình cầu ab 0,75 60,5 ± 0,5 1,2 ± 1,13 Phơi hình cầu 1,0 50 ± 1,0 0,9a ± 1,1 Phơi hình cầu Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Kết cho thấy mơi trường MS có bổ sung 2,4-D có ảnh hưởng đến phát triển phôi từ callus điều kiện in vitro Khi nồng độ tăng từ 0-0,25 mg/l, xuất callus màu vàng nhạt, mềm Tiếp tục tăng nồng độ 2,4-D lên 0,5 mg/l có cảm ứng hình thành phôi từ callus 7/10 mẫu tạo phôi sau tuần, số phôi phát sinh không cao (1,9 phôi/mẫu) Tiếp tục tăng nồng độ 2,4-D lên tới 1,0 mg/l số lượng mẫu hình thành phơi số lượng phôi mẫu giảm đáng kể Lần lượt số mẫu phát sinh phôi nồng độ 0,75 mg/l 2,4-D 6/10 mẫu 1,2 phôi/mẫu, tăng 27 nồng độ 2,4-D lên 1,0 mg/l số mẫu phát sinh phôi giảm cịn 5/10 mẫu 0,9 phơi/ mẫu Đặc biệt phôi phát sinh quan sát giai đoạn đầu tiên, khơng có xuất phơi trưởng thành 2,4-D chứng minh có mặt chúng, gen phiên mã tăng cường làm kích thích sinh ABA, enzyme biết tới có khăng cảm ứng phát sinh phơi tế bào sinh dưỡng, hình thành tế bào phân cực, kích thích tạo phơi Trong nghiên cứu Phạm Thị Tố Liên Võ Thị Bạch Mai [14] báo cáo phát sinh phôi Đinh lăng từ callus nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2,4-D Nhưng theo nhiều nghiên cứu 2,4-D kích thích phát sinh tế bào tiền phôi, ngăn cản phát triển phôi giai đoạn tiếp theo, nghiên cứu thực Ammirato cà rốt [18] Kết nghiên cứu Lê Thiên Thư Võ Thị Bạch Mai callus Đinh lăng sau tạo thành môi trường chưa 2,0 mg/l 2,4-D chuyển qua mơi trường khơng có chất ĐHST cho tỉ lệ phát sinh phôi đạt 100% [6] Kết nghiên cứu tỏi cho thấy, 2,4-D có ảnh hưởng tới trình tạo phơi hạn chế phát triển phơi giai đoạn Hình 3.2 Phơi hình cầu mơi trường 2,4-D (Mũi tên phát sinh phôi) 28 3.3 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả sinh phơi vơ tính Đã có thí nghiệm số lồi thực vật khác cho thấy kết hợp 2,4D KIN cho thấy ưu hình thành phơi Cho nên thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng 2,4-D KIN để khảo sát khả phát sinh phơi vơ tính Tỏi Mẫu callus ni cấy môi trường MS bổ sung 2,4-D nồng độ 0,5 mg/l thay đổi nồng độ KIN (0-2) mg/l, sau tuần nuôi cấy kết bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả sinh phơi vơ tính Nồng độ chất Tỷ lệ mẫu phát Số ĐHST (mg/l) Hình thái phơi sinh phôi (%) phôi/mẫu 2,4-D KIN 0,5 0,0 70,5 ± 0,5 1,9b ± 1,44 Hình cầu ab 0,5 0.5 70,5 ± 0,5 3,1 ± 2,28 Hình cầu ab 0,5 1,0 70 ± 1,0 3,4 ± 2,41 Hình cầu, phơi trưởng thành 0,5 1,5 70,5 ± 0,5 3,7ab ± 2,58 Hình cầu, phôi trưởng thành 0,5 2,0 90 ± 1,0 5,2a ± 1,93 Hình cầu, phơi trưởng thành Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Hình 3.3 Phôi phát sinh môi trường 2,4-D Kin A: Giai đoạn phơi hình cầu B: Giai đoạn phơi trưởng thành (Mũi tên phát sinh phôi) Trong thí nghiệm khảo sát, kết cho thấy giữ nghiên nồng độ 2,4-D 0,5 mg/l thay đổi nồng độ BAP số phơi hình thành lượng phơi mẫu có khác biệt Khi nồng độ BAP tăng từ mg/l 1,5 mg/l tỉ lệ phát mẫu phát sinh phơi khơng thay đổi số lượng phơi hình thành mẫu có gia tăng đáng 29 kể Tăng dần từ 1,9 đến 3,7 phôi/mẫu Khi nồng độ BAP đạt ng/l tỷ lệ phát sinh phơi đạt 90% 5,2 phơi/mẫu Trong thí nghiệm nầy quan sát tất giai đoạn hình thành phơi, có kích thước lớn phân biệt mắt thường Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng 2,4-D KIN lên phát sinh phơi vơ tính số lồi thực vật, có nghiên cứu Kakarla phát sinh phôi sơ cấp thứ cấp Rumex vesicarius L Với nồng độ 2,5 mg/l 2,4-D 0,5 mg/l KIN cho khả phát sinh phơi tỉ lệ cao Ngồi kết hợp sử dụng nghiên cứu phát sinh phôi lúa cải thực Verma Siong vào năm 2011 đưa kết luận kết hợp 2,4-D KIN ảnh hưởng tích cực đến khả phát sinh phơi vơ tính Kết bảng 3.3 cho kết tương tự khả phát sinh phôi Tỏi nhiên tỉ lệ phôi phát sinh mẫu chưa cao 3.4 Ảnh hưởng 2,4-D, KIN NAA đến khả sinh phơi vơ tính Tuy kết hợp 2,4-D KIN cho tỉ lệ phát sinh phôi cao số lượng phôi mẫu cịn thấp đạt 5,2 phơi/mẫu Có nhiều nghiên cứu cho thấy có kết hợp NAA tăng thỉ lệ phơi hình thành từ callus Vì thí nghiệm chung tơi kết hợp 2,4-D, KIN NAA để khảo sát khả phát sinh phơi callus Tỏi Thí nghiệm thực tuần, với nồng độ 0,5 mg/l 2,4-D, 2,0 mg/l KIN nồng độ NAA thay đổi (0-20) mg/l Kết thí nghiệm thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng 2,4-D, KIN NAA đến khả sinh phơi vơ tính Nồng độ chất ĐHST Tỷ lệ mẫu Số (mg/l) phát sinh Hình thái phôi phôi/mẫu 2,4-D KIN NAA phôi (%) 0,5 2,0 0,0 90 ± 1,0 5,2bc ± 1,93 Hình cầu, phơi trưởng thành 0,5 2,0 0,5 100 ± 0,0 6,1b ± 0,87 Hình cầu, phơi trưởng thành 0,5 2,0 1,0 100 ± 0,0 8,0a ± 1,05 Hình cầu, phơi trưởng thành bc 0,5 2,0 1,5 100 ± 0,0 5,4 ± 0,96 Hình cầu, phôi trưởng thành 0,5 2,0 2,0 100 ± 0,0 4,3c ± 0,94 Hình cầu, phơi trưởng thành Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thơng kê với p≤0,05 Kết bảng cho thấy kết hợp 2,4-D, KIN NAA có ảnh hưởng tới khả phát sinh phôi Tỏi Khi tăng nồng độ NAA số phơi mẫu tăng, tăng cao nồng độ 1,0 mg/l NAA với tỉ lệ phôi 100% phôi/mẫu Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ NAA số phơi mẫu lại giảm đáng kể, tăng NAA lên 2,0 mg/l cịn 4,3 phơi/mẫu Auxin kết hợp cytokinin tạo điều kiện thuận lợi cho phát sinh phơi đạt trạng thái tối đa nhiều lồi Mặc dù thực tế NAA khơng có tác dụng kích thích phân 30 bào 2,4-D mà thúc đẩy kéo dài tế bào Nhiều nghiên cứu NAA ức chế gen liên quan đến phát sinh phơi điều hịa chuyển vị sang trang thái sinh dưỡng rễ Tuy nghiên Ogas J vào năm 1999 kết hợp NAA nồng độ cytokinin cao có khả hình thành phơi phơi phát triển hồn chỉnh đạt tỉ lệ cao [26] Kết thu nghiên cứu tương tự, điều chứng minh hết hợp 2,4-D, KIN NAA cho tỉ lệ phát sinh phơi cao phơi hình thành nhiều Hình 3.4 Những giai đoạn phát sinh phôi môi trường MS bổ sung 2,4-D, Kin NAA A: Cụm phôi phát sinh từ callus; B: Giai đoạn phơi hình cầu; C: Giai đoạn bao mầm; D: Giai đoạn mầm (Mũi tên phát sinh phôi) 31 3.5 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BAP chất sử dụng để tái sinh chồi, kích thích phân hóa sinh trưởng chồi in vitro Trong nghiên cứu này, sử dụng BAP để khảo sát khả tái sinh chồi từ phôi vơ tính Tỏi Sau tuần ni cấy, kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Nồng độ BAP Tỷ lệ mẫu tái sinh Số chồi Chiều cao chồi (cm) (mg/L) chồi (%) 0,0 0,0b 0,0b 0,5 30 ± 1,0 0,8a ± 1,03 3,7a 1,0 20,5 ± 0,5 0,4ab ± 0,69 3,5a 1,5 0,0b 0,0b 2,0 0,0b 0,0b Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Hình 3.5 Chồi tái sinh môi trường MS bổ sung BAP Kết bảng 3.4 cho thấy tỉ lệ tái sinh chồi thấp Ở mơi trường có nồng độ BAP thấp 0,5 mg/l có tượng phát sinh chồi, số chồi đạt 0,9 chồi/mẫu Khi tăng nồng độ BAP tỷ lệ phát sinh chồi giảm khơng xuất Tuy có khả tái sinh chồi từ phơi vơ tính thấp số lượng chồi mẫu chưa cao Tuy nhiên chồi 32 tái sinh có sức sống tốt, chiều cao đạt 3-4 cm đáp ứng đủ tiêu chí để đưa vào giai đoạn rễ Đã có nhiều nghiên cứu BAP chất ĐHST tốt để thực trình tái sinh chồi từ phơi vơ tính Chẳng hạn nghiên cứu Raghu cs (2007) thuốc Aegle marmelos L thơng qua phát sinh protocom, chồi hình thành mạnh môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP đạt 6,2 chồi/mẫu số chồi tăng nhanh sau lần cấy chuyển Tuy nhiên, kết nghiên cứu sâm Ngọc Linh cho thấy môi trường MS không bổ sung chất ĐHST tỉ lệ tái sinh chồi đạt 100% Ở nghiên cứu nhận thấy môi trường MS bổ sung BAP có tác dụng cảm ứng tái sinh phơi nhiên tỉ lệ cịn thấp chưa đáp ứng yêu cầu mục tiêu nghiên cứu 3.6 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi Ngoài việc sử dụng đơn lẽ chất ĐHST số nghiên cứu cho thấy kết hợp auxin/cytokinin theo tỉ lệ thích hợp kích thích khả tái sinh chồi in vitro thực vật Trong nghiên cứu này, thực kết hợp 0,5 mg/l BAP NAA có nồng độ thay đổi (0-1 mg/l) Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi Nồng độ chất ĐHST Tỷ lệ mẫu tái Chiều cao chồi (mg/l) Số chồi/mẫu sinh chồi (%) (cm) BAP NAA 0,5 0,0 50 ± 2,0 0,8bc ± 1,03 3,7a 0,5 0,25 100 ± 0,0 4,0a ± 1,94 3,9a 0,5 0,5 100 ± 0,0 1,4b ± 0,51 3,5ab 0,5 0,75 20 ± 2,0 0,3bc ± 0,67 3,0b 0,5 1,0 0,0c 0,0c Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Sau tuần ni cấy, mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP (0-1,0) mg/l NAA Kết cho thấy nồng độ NAA từ 0-0,75 mg/l cho khả tái sinh chồi cao, đặc biệt nồng độ 0,25 0,5 mg/l NAA cho khả tái sinh 100% nhiên nồng độ 0,25 mg/l NAA cho số chồi mẫu cao đạt 4,0 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 3,9 cm Khi tiếp tục tăng nồng độ NAA tỷ lệ tái sinh chồi giảm dần số chồi mẫu giảm, đạt nồng độ 1,0 mg/l NAA không thấy xuất chồi Nhiều nghiên cứu cho thấy kết hợp BAP NAA mang lại kết khả quang cho việc tái sinh chồi in vitro thực vật Nghiên cứu Dhar cs (2000), vi nhân giống Pittosporum napaulensis- loài thuốc quý đặc hũu cho thấy tỉ lệ tạo chồi tốt đạt 83,1% ( 21 chồi/mẫu chiều dài chồi 5,5 cm) môi trường MS 33 bổ sung kết hợp 5,0 µM BAP 0,1 µM NAA Nghiên cứu Girijashankar (2011) nhân giống in vitro keo tràm, kết cho thấy môi trường MS bổ sung mg/l BAP 0,1 NAA cho kết tái sinh chồi tốt Kết thí nghiệm chúng tơi cho kết tương tự, khả tái sinh chồi tốt Tỏi in vitro kết hợp BAP NAA Hình 3.6 Chồi tái sinh từ môi trường MS bổ sung BAP NAA A: Chồi phát sinh sau tuần nuôi cấy; B: Chồi sau tuần nuôi cấy chuyển qua môi trường rễ (Mũi tên phát sinh phôi) 3.7 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Ở thí nghiệm chúng tơi chưa nghi nhận ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến khả phát sinh rễ chồi nẩy mầm từ phôi tỏi Lý Sơn Bảng 3.7 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Nồng độ NAA (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Tỉ lệ mẫu rễ (%) 1,0 ± 1,0 34 Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) 1,0 - 2,0 - Kết thí nghiệm bảng 3.7 cho thấy chưa ghi nhận ảnh hưởng rõ ràng chất ĐHST NAA đến khả phát sinh rễ Ở nồng độ 1,0 mg/l NAA có tượng rễ số lượng rễ thấp chiều dài đạt cm Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng auxin đến trình rễ lớn, đặc biệt NAA Trong nghiên cứu nuôi cấy rễ Đinh lăng, nghiên cứu tạo rễ nhân nhanh Đinh lăng từ chồi, nồng độ mg/l NAA cho hiệu tạo rễ tốt [28] Nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Phương cs (2011) đối tượng tỏi ta với nồng độ 0,5 mg/l NAA 0,5g than hoạt tính cho tỉ lệ rễ đạt 100% Tuy nhiên thí nghiệm chưa ghi nhận ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến khả phát sinh rễ chồi tái sinh từ phơi vơ tính Hình 3.7 Rễ phát sinh q trình ni cấy 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: - Mơi trường MS (có 3% sucrose; 0,8% agar) bổ sung mg/l 2,4-D 0,5mg/l KIN cho tỉ lệ phát sinh callus đạt 96% thời gian 17-18 ngày callus có màu vàng tươi, rắn - Mơi trường MS (có 3% sucrose; 0,8% agar) bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D, 2,0 mg/l KIN 1,0 mg/l NAA cho tỉ lệ phôi 100% phôi/mẫu, phôi phát triển đầy đủ theo giai đoạn sau tuần ni cấy - Mơi trường MS (có 3% sucrose; 0,8% agar) bổ sung 0,5 mg/l BAP 0,25 mg/l NAA cho tỉ lệ tái sinh chồi đạt 100% với 4,0 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 3,9 cm sau tuần ni cấy - Mơi trường MS (có 3% sucrose; 0,8% agar) bổ sung NAA khơng có ảnh hưởng tới khả tái sinh rễ Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện để tăng khả tái sinh chồi từ phơi vơ tính để tăng tỉ lệ chồi mẫu phôi nuôi cấy - Nghiên cứu mơi trường rễ để hồn thiện quy trình tái sinh hồn chỉnh từ phơi vơ tính - Nghiên cứu vấn đề liên quan để hướng đến mục đích cuối nghiên cứu sản xuất hạt giống nhân tạo 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt : [1] Bùi Thị Tho, Nguyễn Thị Thanh Hà (2009) Dược liệu học Thú y NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 77-81 [2] Bùi Thị Thơ, Võ Châu Tuấn, Đoàn Thị Hạnh (2014), Nghiên cứu khả tạo callus tái sinh in vitro tỏi cô đơn ( Allium Sativum L.) đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, Kỷ yếu hội thảo khoa học cán trẻ trường Đại học Sư phạm toàn quốc – Lần thứ IV, năm 2014 [3] Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội [4].Đào Đức Huấn, Lương Nhật Minh (2014) “Chỉ dẫn địa lý tỏi lý Sơn – Tiềm phát triển nông nghiệp xanh du lịch văn hóa”, Tham luận Hội thảo Quốc gia Định hướng phát triển chế sách đặc thù cho Huyện đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi 01/10/2014 [5] Hồ Huy Cường (2009), “Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn” Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam Mã số 05/2009/HĐ-ĐTKHCN [6] Lê Thiên Thư, Võ Thị Bạch Mai (2005), “The morphogenese in in vitro culture for Polyscias fructicosa [Nghiên cứu phát sinh hình thái ni cấy Invitro Đinh lăng (Polyscias fruticosa)]”, Tạp chí Phát triển khoa học cơng nghệ , Vol 8, tr 47-51 [7] Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 82 [8] Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Văn Long (2011) , Nghiên cứu thành phần hóa học tỏi Lý Sơn, Tạp chí Y dược học quân số [9] Nguyễn Phú Sơn, Nguyễn Thị Thu An (2014) “Nguyên cứu chuỗi giá trị sản phẩm tỏi tinh Ninh Thuân” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ: 35 (2014): 1623 [10] Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết tỏi E.coli gây bệnh E.coli kháng Ampicillin, Kanamycin Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 6: 804-808 [11] Nguyễn Văn Uyển, 1989 Các chất sinh trưởng nơng nghiệp Nhà xuất TP Hồ Chí Minh [12] Nguyễn Như Khanh (2002), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội [13] Nguyễn Văn Uyển (1984), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng NXB Thành phố Hồ Chí Minh 37 [14] Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007), “Bước đầu nghiên cứu tạo dịch treo tế bào Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms”, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, Tập 10, số 07, tr 11 [15] Trần Thị Thùy Dung (2009), Khảo sát ảnh hưởng mơi trường SH, B5 ½MS đến tạo chồi hoa chng, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh [16] Trần Văn Minh, 2003 Công nghệ tế bào thực vật Giáo trình cao học-nghiên cứu sinh Viện sinh học nhiệt đới Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia [17] Vũ Xuân Quang (1993) Những thuốc nam chữa số bệnh viêm nhiễm NXB Y học Tài liệu tiếng Anh: [18] Ammirato, P.V (1983), “Embryogensis”, In: Handbook of Plant Cell Cuture, Vol 6, pp 82- 123, Macmillan Publishing Co, New York [19] E G WILLIAMS and G MAHESWARAN Annals of Botany.Vol 57, No (April 1986), pp 443-462 [20] Economou AS, Read PE (1987), “Light treatments to improve efficiency of in vitro propagation systems”, Hort Sci., 22: 751-754 [21] Fujimura T and Komamine A., 1979 Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture Plant Physiol 64:162-164 [22] "Garlic production in 2016: Crops/World Regions/Production Quantity (from pick lists)" Food and Agriculture Organization of the United Nations, Statistics Division (FAOSTAT) 2017 Retrieved March 20, 2018 [23] Masanori A, Kenji T& Shinichiro S 1995 Regenerationof whole plant from tissue-cultured shoot primodia of garlic (Allium sativum L.) Plant Cell Report 15: 1721 [24] Nagakubo T, Nahasaga A & Ohkawa H.1993 Micropropagation of garlic through in vitro bulblet formation.Plant Cell Tissue and Organ Culture 32: 175-183 [25] Nasim, S.A., A Mujib, R Kapoor, S Fatima, J Aslam and Mahmooduzzafar, 2010 Somatic embryogenesis in Allium sativum L (cv Yamuna Safed 3): Improving embryo maturation and germination with PGRs and carbohydrates Anales de Biologia, 32: 1-9 [26] Ogas J, Kaufmann S, Henderson J, Somerville C (1999), “PICKLE is CHD3 choromatin remodeling factor that regulates the transition from embryonic to vegetative development in Arabidopsis”, Proc Natl Acad Sci, USA, 96: 13839 -13844 [27] S Bhojwani, Sant (1980) In vitro propagation of garlic by shoot proliferation Scientia Horticulturae 13 47-52 10.1016/0304-4238(80)90021-7 38 [28] Saiqa Ilyas1, Shagufta Naz, Sumeera Javad, Kiran Shehzadi, Amna Tariq, Neelma Munir and Aamir Ali (2013), “ Influence of cytokinins, sucrose and pH on adventitious shoot regeneration of Polyscias balfouriana (Balfour aralia)” , Journal of medicinal plants reseach, Vol 7, no 42, pp 3098-3104 39 ... SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỎI L? ? SƠN (ALLIUM SATIVUM L. ) TỪ PHÔI VÔ TÍNH Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : TS Võ Châu Tuấn Sinh viên thực... basal medium (Nitsch,1969) 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu củ tỏi L? ? Sơn (Allium sativum L. ) thuộc họ hành (Alliaceae), hành (Liliales),... tỏi L? ? Sơn Vơ trùng mẫu Tạo tỏi in vitro từ củ Tạo callus Nhân nhanh callus Tạo phơi vơ tính Tái sinh chồi từ phơi vơ tính Tạo rễ in vitro Cây tỏi in vitro hoàn chỉnh 2.2 Phương pháp nghiên cứu