Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Bùi Xuân Nguyên TS Nguyễn Việt Linh Hà Nội, 2021 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xn Ngun, Ngun Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Công nghệ sinh học TS Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo, hỗ trợ kĩ thuật tạo điều kiện tốt giúp tơi thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn ơn thầy cô giáo, cán Học viện Khoa học Công nghệ bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu hoàn thành thủ tục liên quan đến luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc TS Nguyễn Thị Ước, Phịng cơng nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học bảo, hướng dẫn kĩ thuật giúp đỡ từ ngày đầu làm việc nay, giúp đỡ TS Nguyễn Thị Ước góp phần lớn không kết luận án mà cịn suốt thời gian làm việc tơi Tơi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên Phịng nghiên cứu sinh sản chăn nuôi, Viện chăn nuôi khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ để thực luận án Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học cán Phịng cơng nghệ Phơi, Viện cơng nghệ sinh học có góp ý để tơi hồn chỉnh luận án Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh tận tình hướng dẫn ii tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập làm nghiên cứu sinh học viện Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng hỗ trợ tạo điểu kiện tốt cho tơi chun tâm làm việc hồn thành luận án Cuối cùng, xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp ủng hộ, cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để hồn thành tốt luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn./ Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS Nguyễn Thị Nhung iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS Nguyễn Thị Nhung iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cấu tạo buồng trứng, thành thục trứng, q trình thụ tinh phát triển phơi in vivo lợn 1.1.1 Cấu tạo buồng trứng thành thục in vivo trứng lợn 1.1.2 Sự thụ tinh phát triển phôi lợn in vivo 1.1.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến hoạt động sinh sản lợn 12 1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phơi lợn in vitro 1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng nguồn nguyên 15 liệu trứng điều kiện nuôi thành thục 15 Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi bảo quản phôi 19 1.2.3 Tạo phôi lợn kĩ thuật NBVT 26 1.3 Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro 32 1.3.1 Một số đặc điểm hình thái sinh sản lợn Bản 32 1.3.2 Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo phôi lợn Bản Việt Nam 33 1.2.2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Vật liệu, hoá chất nghiên cứu 35 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 35 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36 v 2.1.3 Hóa chất thiết bị 36 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 36 2.1.5 Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Phân loại tháng theo mùa 37 2.2.2 Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 37 2.2.3 Phương pháp đo kích thước khối lượng buồng trứng 2.2.4 Phương pháp phân chia nhóm nang 37 2.2.5 Phương pháp thu trứng 2.2.6 Phương pháp phân loại chất lượng trứng 38 2.2.7 Phương pháp đo kích thước trứng lợn 39 2.2.8 Phương pháp nuôi trứng 39 2.2.9 Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 40 2.2.10 Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 40 2.2.11 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước sau đông lạnh 42 2.2.12 Phương pháp TTON 2.2.13 Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 44 2.2.14 Phương pháp đông lạnh phôi 44 2.2.15 Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 45 2.2.16 Phương pháp nhân nuôi tế bào 45 2.2.17 Phương pháp đông lạnh tế bào 46 2.2.18 Phương pháp NBVT (NBVT) 2.2.19 Phương pháp nuôi phôi 49 2.2.20 Phương pháp nhuộm Hoechst 49 2.2.21 Phương pháp nhuộm Orcein 50 2.2.22 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 50 37 38 43 46 vi CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Đặc điểm hình thái buồng trứng tiềm khai thác trứng 54 lợn Bản theo mùa 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54 3.1.2 Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản 56 3.1.3 Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa kích thước trứng 59 lợn Bản 3.2 Kết nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản 3.2.1 Ảnh hưởng mùa vụ lên kết nuôi thành thục trứng lợn Bản 65 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết nuôi thành thục 65 68 trứng lợn Bản 3.3 Kết tạo phôi lợn Bản TTON 72 3.3.1 Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản 73 3.3.2 Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 3.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi thành thục lên thụ tinh phát 84 triển phôi 3.3.4 Đông lạnh phôi TTON 89 3.4 Kết nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT 3.4.1 Kết nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace 91 3.4.2 Kết nuôi thành thục trứng lợn Landrace 3.4.3 Tạo nguồn tế bào cho nhân NBVT 96 3.4.4 Kết tạo phôi lợn Bản NBVT 78 91 94 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 54 Bảng 3.2 Số lượng nang trung bình theo kích thước .57 Bảng 3.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản………………… …60 Bảng 3.4 Kích thước trứng lợn Bản (µm) 62 Bảng 3.5 Sự thành thục trứng lợn Bản 66 Bảng 3.6 Kết nuôi thành thục trứng lợn Bản 67 Bảng 3.7 Chất lượng tinh sau thu 73 Bảng 3.8 Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh 74 Bảng 3.9 Thử nghiệm khả tạo phôi tinh trùng sau đông lạnh 77 Bảng 3.10 Đánh giá trạng thái thụ tinh trứng 79 Bảng 3.11 Ảnh hưởng lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh lợn Bản 80 Bảng 3.12 Trạng thái thụ tinh trứng môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác thời gian thụ tinh khác 81 Bảng 3.13 Sự thành thục khả thụ tinh trứng lợn Bản sau nuôi .85 Bảng 14 Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên phát triển phôi lợn Bản sau thụ tinh .86 Bảng 3.15 Ảnh hưởng môi trường nuôi phôi lên phát triển phôi lợn Bản sau thụ tinh .86 Bảng 3.16 Kết đông lạnh phôi TTON .89 Bảng 3.17 Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace .913 Bảng 3.18 Khả thành thục trứng lợn Landrace loại môi trường nuôi 94 Bảng 3.19 Ảnh hưởng loại tế bào cấy lên phát triển phôi lợn NBVT 96 Bảng 3.20 Sự phát triển phôi lợn Landrae phôi lợn Bản NBVT môi trường nuôi 97 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc buồng trứng phát triển nang, trứng động vật có vú Hình 1.2 Sự phát triển nang, tế bào trứng lợn thông qua trình giảm phân Hình 1.3 Quá trình thành thục trứng lợn Hình 1.4 Trứng lợn sau thụ tinh quan sát kính hiển vi với nhiều tinh trùng vùng màng sáng 10 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển phôi lợn 11 Hình 1.6 Sự phát triển phôi lợn từ ngày đến ngày 10 12 Hình 1.7 Sự phát triển nang, phát triển tế bào cận noãn thành thục trứng động vật có vú 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic 24 Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT 27 Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng 43 Hình 2.2 Bố trí dầu kim 47 Hình 2.3 Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng 47 Hình 2.4 Micro pipet trứng thao tác hút cấy nhân 47 Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng 48 Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân 49 Hình 3.1 Kích thước khối lượng buồng trứng lợn Bản: 55 Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa 57 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau thu phân loại A,B,C 59 Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu tách tế bào cận nỗn 62 Hình 3.5 Mối tương quan số lượng nang > mm số trứng 64 126 oocyte-cumulus complexes during maturation in vitro, Reproduction, 1994, 101.1: 159-165 163 J Peláez, E Breininger, B Alegre, F Pa, J Domínguez, In vitro evaluation of the quality and fertilizing capacity of boar semen frozen in 0.25 ml straws, Reproduction in Domestic Animals, 2006, 41.2: 153-161 164 N Anh, Báo cáo kết thực đề tài nghiên cứu triển khai công nghệ bảo quản tinh đông lạnh lợn Ỉ nhằm bảo tồn nguồn gen quý Việt Nam, Viện công nghệ sinh học, 2005 165 P Coy, E Martinez, S Ruiz, J Vazquez, J Roca, C.J.T Matas, Sperm concentration influences fertilization and male pronuclear formation in vitro in pigs, Theriogenology, 1993, 40.3: 539-546 166 K Kikuchi, T Nagai, J Motlik, Y Shioya, Y Izaike, Effect of follicle cells on in vitro fertilization of pig follicular oocytes, Theriogenology, 1991, 35.1: 225 167 M.A Gil, M Ruiz, C Cuello, J.M Vazquez, J Roca, E.A Martinez, Influence of sperm: oocyte ratio during in vitro fertilization of in vitro matured cumulusintact pig oocytes on fertilization parameters and embryo development, Theriogenology, 2004, 61.2-3: 551-560 168 L Abeydeera, W Wang, T Cantley, A Rieke, C Murphy, R Prather, B.J.T Day, Development and viability of pig oocytes matured in a protein-free medium containing epidermal growth factor, Theriogenology, 2000, 54.5: 787-797 169 A Gandhi, M Lane, D Gardner, R.J.M.R Krisher, D.I.G Research, Substrate utilization in porcine embryos cultured in NCSU23 and G1 2/G2 sequential culture media, Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research, 2001, 58.3: 269-275 170 M.H Alam, T.J.R.M Miyano, Biology, Interaction between growing oocytes and granulosa cells in vitro, Reproductive Medicine and Biology, 2020, 19.1: 13-23 171 T Somfai, M Ozawa, J Noguchi, H Kaneko, N.W.K Karja, M Fahrudin, 127 M Nakai, N Maedomari, A Dinnyés, T Nagai, In vitro development of polyspermic porcine oocytes: Relationship between early fragmentation and excessive number of penetrating spermatozoa, Animal reproduction science, 2008, 107.1-2: 131-147 172 N.V Linh, T Somfai, T.H Nguyen, N.T Nhung, N.T Hong, N.T Dat, N.H Thinh, N.K Van, D.V Quyen, H.H Chu, Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low fertilization ability in Ban—A native Vietnamese pigs, Animal Science Journal, 2018, 89.8: 10791084 173 M Suzuki, K Misumi, M Ozawa, J Noguchi, H Kaneko, K Ohnuma, D Fuchimoto, A Onishi, M Iwamoto, N Saito, Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum, Theriogenology, 2006, 65.2: 374-386 174 G.S Im, L Lai, Z Liu, Y Hao, D Wax, A Bonk, R.S Prather, In vitro development of preimplantation porcine nuclear transfer embryos cultured in different media and gas atmospheres, Theriogenology, 2004, 61.6: 1125-1135 175 K.P Brüssow, H Torner, W Kanitz, J Rátky, In vitro technologies related to pig embryo transfer, Reproduction Nutrition Development, 2000, 40.5: 469480 176 C Zijlstra, A Kidson, E Schoevers, A Daemen, T Tharasanit, E Kuijk, W Hazeleger, D Ducro-Steverink, B Colenbrander, B.J.T Roelen, Blastocyst morphology, actin cytoskeleton quality and chromosome content are correlated with embryo quality in the pig, Theriogenology, 2008, 70.6: 923935 177 D Bourc'His, D Le Bourhis, D Patin, A Niveleau, P Comizzoli, J.P Renard, E.J.C.B Viegas-Pequignot, Delayed and incomplete reprogramming of chromosome methylation patterns in bovine cloned embryos, Current Biology, 2001, 11.19: 1542-1546 178 W Dean, F Santos, M Stojkovic, V Zakhartchenko, J Walter, E Wolf, W.J Reik, Conservation of methylation reprogramming in mammalian 128 development: aberrant reprogramming in cloned embryos, National Academy of Sciences, 2001, 98.24: 13734-13738 179 Y.K Kang, D.B Koo, J.S Park, Y.H Choi, A.S Chung, K.K Lee, Y.M.J Han, Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos, Nature genetics, 2001, 28.2: 173-177 PHỤ LỤC THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Tên thiết bị Hãng Mã GS-3120HC20H o Tủ-20 C Nihon Freezer 828993379 CLN-32UD215121 o Tủ-80 C Nihon Freezer 32UD21512143 Tủ stock Alaska 16-3-003712 Bình nitơ Nhật Serial No 001236 Bể ổn nhiệt Nhật (ASONE) 16-3-003713 (1604771A) Low speed Centrifuge LCX-100 Speed 10000 RPM Máy ly tâm Nhật (Tomy) Serial No: 52425004 Tokyo.1790073 Model No: APC-50DR Serial No: 50D1700861 Tủ nuôi TB ASTEC (Nhật) Power: AC230V 5A 50/60 Hz Japan 811-2207 Model No: APM-50DR Tủ nuôi phôi ASTEC (Nhật) Serial No: 50D1500682 Power: AC230V-300VA-50Hz Japan 811-2207 Tủ cấy vô trùng ASTEC(Nhật) Model No: AH-160 Serial No: BO61700283 Power:AC220V 8A 50Hz Model: P-1000 Sutter Instrument Co P1000/M-1775 Máy kéo kim Mỹ 100-240V 50/60Hz 300W NOVATO, CA 94949, USA 415-883-0128 PMM Controller Máy xung điện PRIME TECH Model: PMAS-CT4G Nhật Serial No: 41333 100-240VAC 50/60Hz, 60VA Model: II-PS 100W/A No.2119528 Kính hiển vi soi Nikon Nhật (Nikon) Input AC100V 150VA 50/60Hz KCC-REM-NYC-TI-PS100WA Hệ thống máy piezo hệ thống vi thao tác Nhật Module name: MM-93B (NAISHIGE) Serial No 15234 Model: XS250DUV METTLER Cân điện tử TDNR 18.6.3.1084.895 TOLEDO-Thụy Sỹ X250BDUV Service info, SNR B548772774 Microscope OLYMPUS Kính hiển vi soi Tokyo 1630914, Nhật Bản KCC-REM-OLY-022400002 Model BX53F 100-120/220-240 1.7/0.8A 50/60Hz, SN 6L 44666 201611 Model: MF-900 Máy kéo kim Narishige Serial No: 15125 Tokyo 157-0062.japan Đĩa nuôi giếng Đĩa petri 60 mm Buồn đếm Cryovials Swedesboro,NJ, USA Thomas, Scientific, Mỹ Neubauer-Đức Shizuoka, Nhật Bản Kính hiển vi Tokyo, Nhật huỳnh quang Bản Tủ lạnh Panasonic Nunc MultiDishes, Thomas,Scientific, Falcon 351007 Mariendeld Cryotop-Kitazato Biopharma BX-51, Olympus, Tokyo, Nhật Bản PHỤ LỤC MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU Môi trường rửa buồng trứng: Dulbecco’s phosphate-buffered saline (SigmaAldrich Corp., St Louis, MO, USA) bổ sung kháng sinh (100 units/mL penicillin G potassium) (Sigma-Aldrich Corp) 0.1 mg/mL streptomycin sulfate (Sigma-Aldrich Corp) Mơi trường rửa trứng: có chứa TCM-199 (Hank’s salts; Sigma-Aldrich Corp) bổ sung 5% huyết thai bò (Gibco; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 20 mmol/L HEPES (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) kháng sinh Môi trường nuôi thành thục trứng-Tissue Culture Medium 199 bổ sung 10% dịch nang trứng, 0.6 mmol/L cysteine, 50 mol/Lβ-mercaptoethanol, mmol/L dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma-Aldrich Corp), 10 IU/mL eCG (Serotropin; ASKA Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan), 10 IU/mLhCG (500 units; Puberogen, Novartis Animal Health, Tokyo, Japan) Dầu khống (Paraffin Liquid; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) Mơi trường thụ tinh Pig-FM có chứa 90 mmol/L NaCl, 12 mmol/L KCl, 25 mmol/L NaHCO3, 0.5 mmol/L, NaH2PO4, 0.5 mmol/L MgSO4, 10 mmol/L sodium lactate (Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan), 10 mmol/L Hepes mmol/L CaCl2, mmol/L sodium pyruvate (Sigma), mmol/L caffeine mg/mL BSA (fraction V; Sigma) Môi trường TCM-199 rửa tinh Thành phần mM g/1000 ml Nước 1000 ml TCM-199 bột 9,900 mg (1 túi) NaHCO3 2.2g HEPES 25.00 5.657 g Penicillin G + Streptomycin 100 IU/ml PG 0.1 mg/ml SM 1000 ul Mơi trường tách tế bào cận nỗn: 0.1% hyaluronidase Môi trường rửa tinh: M 199 với Earle’s salts, Gibco, pH 7.8) Môi trường cố định trứng: acetic acid 1:ethanol 10 Môi trường rửa trứng nhuộm: glycerol:acetic acid:nước (1:1:3) 11 Môi trường TALP-PVA bổ sung 10 mM Na-lactate (60% syrup; Sigma L1375), 0,10 mM Na-pyruvate (Sigma P-2256), 2mM mM Caffeinesodium benzoate (Sigma C-4144), 3mg/ml BSA, pH=8,1 12 Môi trường rửa: Nước muối sinh lý 0,9% bổ sung 240mg gentamycin 13 Môi trường nuôi tế bào: DMEM 10% FBS 14 Môi trường đông lạnh tế bào: DMEM bổ sung thêm 10% DMSO 15 Dung dịch cố định lam kính: Vaseline: Paraffine 12:1 (Paraffine: Nacalai, 26031+Vaseline trắng Wako: 224-00165) 16 Thuốc nhuộm trứng: Aceto-Orcein (1%) 17 Môi trường cân dùng đông lạnh phôi: 2% (v/v) ethylene glycol 2% (v/v) propylene glycol 18 Môi trường đông lạnh phôi: 17.5% ethylene glycol, 17.5% propylene glycol, 0.3M sucrose 50 mg/ml polyvinylpyrrolidone 19 Môi trường thuốc nhuộm phơi: 25 µg/ml Hoechst 33342 (H33342, Calbiochem, San Diego, CA, USA) 99.5% ethanol 20 Môi trường nuôi phôi PZM-3: PZM bổ sung mg/ml huyết thai bị 21 Mơi trường xung điện Manitol 0,28mM 22 Mơi trường rửa kim NBVT: IVC Pyrulac+20% PVP 23 Môi trường cấy nhân NBVT: IVC Pyrulac+5 µg/ml Cytochalasin B 24 Môi trường cấy nhân: IVC Pyrulac 25 NCSU-37+10% pFF (porcine follicular fluid), 0.6 mM cysteine, 50 μM βmercaptoethanol, mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma-Aldrich), 10 IU/ml eCG (Serotropin; ASKA Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 10 IU/ml hCG (500 units; Puberogen, Novartis Animal Health, Tokyo, Japan) 26 NCSU-37: Kháng minh dạng ống đóng sẵn mua theo hãng (Meiji Seika Kaisha; ~ 2ml / ống) chứa 100mg / ml Streptomycin sulfate 105 IU / ml Penicillin G kali Chia 8ml (4 ống x 2ml) thành 16 ống (250µl / ống) Bảo quản -20oC 27 TCM-199Air Stock (1000 ml) Nước 1000ml TCM-199 bột 9,900 mg* NaHCO3 HEPES 350 mg 4,776 mg Kháng sinh ml Thêm khoảng 0,95 ml NaOH 1N để điều chỉnh pH đến 7,4 Bột TCM-199: Muối Hank với L-glutamine, khơng có NaHCO3 HEPES (Sigma M0393) Pha lỗng tồn bột TCM 199 1l nước Ngồi ra, sử dụng Gibco 12350-039 loại lỏng, trường hợp đó, việc bổ sung NaHCO3 HEPES không cần thiết! 28 TCM-199 stock (dùng nuôi thành thục trứng) Thành phần Nước TCM-199 bột Lượng 1000ml 9,900 mg (gói) NaHCO3 2.2g Kháng sinh ml Bột TCM-199: Muối Earl`s với L-glutamine, khơng có NaHCO3 HEPES (GIBCO 31100-035) Pha lỗng tồn gói bột TCM 199 1l nước sau chia 600: 400 700: 300 29 TCM-199 stock rửa tinh (1000 ml)* Thành phần Nước TCM-199 bột NaHCO3 HEPES (25 mM) Lượng 1000ml 9,900 mg (gói) 2.2g 5.657 g Kháng sinh 30 ml Dung dịch stock 100x Cysteine Lượng Nồng độ(mM) Cysteine (Sigma, C7352) 0.218 g 60 TCM199 (IVM) stock 30ml Thành phần Chia thành 20 ống (1ml / ống) bảo quản -20oC 31 100x Hormone stock solution Thành phần Lượng Nồng độ(mM) eCG (Serotropin 1000 IU/tube) hCG (Puberogen 1500 IU/tube) (Sankyo) TCM199 (IVM) stock ống 1000 IU ống 1000 IU ml Chia 24 ống (250µl/ống) Giữ -20oC 32 100x dbcAMP stock solution Thành phần Lượng Nồng độ(mM) dbcAMP (Sigma, D0627) 0.250g 100 TCM199 (IVM) stock 5.09 ml Chia 20 ống (250µl/ống) Giữ -20oC 33 1000x 2-ME (Beta Mercaptoethanol) stock solution Thành phần Lượng 14.3M 2-ME (Wako) 35µl TCM199 (IVM) stock 10ml Nồng độ(mM) 50 Chia 40 ống (250µl/ống) Giữ -20oC 34 NCSU-37 Stock dung dịch A (Để nuôi phôi) Thành phần Lượng (g) Nồng độ (mM) NaCl (Nacalai; 313-20) 3.971 136.00 KCl (Nacalai; 28514) 0.223 5.98 CaCl2.2H2O (Nakalai, 06731) 0.156 2.13 KH2PO4 (Nacalai, 28721) 0.101 1.49 MgSO4.7H2O (Nakalai, 21003) 0.183 1.49 Glutamine (Nakalai, 16919) 0.091 1.25 0.5 % Phenol red sol (Sigma, P0290) 250µl Nước 500ml Lọc với màng lọc 0.2µm giữ 4oC 35 NCSU-37 Stock Solution B (for embryo culture) Thành phần Lượng NaHCO3 (Nacalai 31213) 2.106g Phenol red (Sigma, P0290) 100µl Nước 200ml Nồng độ(mM) 125 36 Lọc với màng lọc 0.2µm giữ 4oC Môi trường giải đông tinh trùng: M 199 ( Earle’s salts, Gibco, pH 7.8) 37 Môi trường pha lỗng tinh dịch: Trong lít mơi trường pha lỗng tinh có chứa 60g D-Gluco; 3,75 g Sodium citrate; 3,7 g EDTA; 1,20 g Na-Bicarbonat; 1.000.000 ui Penicilin 1,0 g Streptomycin Dung dịch sau pha bảo quản ở80oC ống ly tâm 50 ml 38 Môi trường đông lạnh NSF.Ib: Trong 0,5 lít mơi trường pha lỗng tinh có chứa 44 g Lactose; 100 ml Lịng đỏ trứng, 500.000 ui Penicillin, 0,5 g Streptomycin Dung dịch sau pha bảo quản ở-80oC ống ly tâm 50 ml 39 Mơi trường đơng lạnh NSF.Iib: Trong 0,5 lít mơi trường pha lỗng tinh có chứa 44 g Lactose; 100 ml Lòng đỏ trứng; 60 ml Glycerol; 14,8 ml OEP; 500.000 ui Penicillin 0,5 g Streptomycin Dung dịch sau pha bảo quản ở-80oC ống ly tâm 50 ml 40 Môi trường TALP-PVA: Môi trường thụ tinh: TALP-PVA bổ sung 3.0 mmol/L calcium lactate, 2.0 mmol/Lcaffeine-sodium benzoate 3.0 mg/mL BSA Cách pha: Chuẩn bị dịch nang trứng (pFF) pFF thu từ nang trứng có kích thước từ 3-6 mm Ly tâm 3000 vòng/phút 90 4oC Giữ - 20oC với lượng đủ 200 ml sau lọc với màng lọc millipore kích cỡ 0,45 µm Giữ ống ly tâm 10ml - 20oC đến sử dụng TALP-PVA (1  dung dịch stock) Thành phần mM g/500 ml PVA (Sigma P-8136) 0.5 Penicillin-G (Sigma P-3032) 0.0375 Streptomycin sulfate (Sigma S-9137) 0.025 Phenol red (Sigma P-5530) 0.001 D-Glucose (Sigma G-7021) 5.00 0.450 NaCl 114.0 3.33 KCl 3.16 0.12 MgCl2 (Anhydrous) 0.5 0.0238 NaH2PO4.H2O 0.35 0.0242 NaHCO3 (Sigma S-5761) 25.00 1.05 CaCl2.2H2O 4.72 0.3422 • Hòa tan chất theo thứ tự trừ CaCl2 450 ml nước Mini Q • Dung dịch khuấy từ thời gian từ 30-60 phút để hòa tan hồn tồn PVA • Hịa tan CaCl2 50 ml nước Mini Q thêm từ từ dung dịch đến bột tan hồn tồn • Lọc tiệt trùng bảo quản 4oC tối đa tháng Môi trường TALP-PVA Thành phần mM Stock Solution Amount 50 ml Na-lactate (60% syrup; Sigma L-1375) 10.0 92.5 µl Na-pyruvate (Sigma P-2256) 0.10 0.6 mg Caffeine-sodium benzoate (Sigma C-4144) 2.00 39.8 mg Ca-lactate2 (Hemicalcium salt; Sigma L-4388) 3.0 32.8 mg BSA 150 mg 10 • Cho tất thành phần vào dung dịch stock khuấy BSA tan hồn tồn • Trước điều chỉnh pH cần đo pH phải đạt ~ 8,1 • Điều chỉnh pH đến 7.6 • Lọc tiệt trùng bảo quản 4oC tối đa tuần 41 D-manitol 0,28 M D-Mannitol (Nakalai, 21303) CaCl2.2H2O* (Nakalai, 06731) 10.2g 200µl 0.075g CaCl2.2H2O 5ml nước MgSO4.7H2O** (Nakalai, 21003) 200µl 0.124g MgSO4.7H2O 5ml nước HEPES (Dojindo 346-01373) 0.024g BSA (Fraction V; Sigma A4919) 0.02g Nước 200ml 42 Môi trường POM EGF stock (1000x) chuẩn bị theo bước sau: Lượng Nồng độ EGF (Sigma, D0627) mg 1mg /ml POM bicarb stock + 10 mg/ml BSA 1ml EGF mg/ml stock 10 µl POM bicarb stock + 10 mg/ml BSA 990µl Thành phần 10µg/ml Stock giữ -20oC ống 200ml Mơi trường POM sử dụng nghiên cứu có bổ sung 10 ng/ml EGF Vậy 100 ml môi trường POM bổ sung 100µl stock EGF Dung dịch Stock POM/PZM (1x) Thành phần mM g/500 ml NaCl 108.00 3.156 KCl 10.00 0.373 KH2PO4 0.35 0.024 11 MgSO4.7H2O 0.40 0.049 NaHCO3 25.07 1.053 Penicillin G + Streptomycin 100 IU/ml PG 500 ul sulfate (1000x dung dịch stock) 0.1 mg/ml SM Hòa tan thành phần 450 ml nước Mini Q Thêm nước mini Q tích 500 ml Lọc tiệt trùng Bảo quản ° C tối đa tháng Môi trường POM Thành phần POM/PZM3 bicarb stock solution mM Trong 50 ml 47.75 ml* 100 ml 97.5* Na-pyruvate 0.20 0.0011 g** 0.0022** Ca-(lactate)2.5H2O 2.00 0.0308 g 0.06166 Glucose 0.036 g 0.07200 g L-Glutamax (200 mM, 100x) 1.00 0.25 ml 0.5 ml Hypotaurine 5.00 0.0273 g 0.05455 g L-cysteine (stock)$ 0.6 0.5 ml ml BME Amino Acids Solution (50x, Sigma) 20.00 ml/L 1.0 ml ml MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x, Sigma) 10.00 ml/L 0.5 ml ml PVA 3.0 mg/ml 0.150 g 0.3 Cách pha: Đầu tiên lấy 45 ml 90 ml dung dịch POM stock Sau cho chất Bổ sung nốt dung dịch POM stock 0,022g/ml để đạt thể tịch 50 ml 100 ml Chỉnh pH đến 7,5-7,55 43 Thuốc nhuộm Hoechst 33342 Stock 1: 25 mg thuốc nhuộm Hoechst 33342 (Sigma, B2261) pha loãng ml DPBS PBS-để đạt nồng độ 5mg/ml (giữ ở-30oC) Stock 2: Pha 20 µl Stock với 10ml PBS để đạt nồng độ µg/ml 12 Dung dịch nhuộm: Pha ml Stock với ml Glycerol, sục 20 phút giữ ống thủy tinh, phủ dầu khoáng tránh ánh sáng Dung dịch Working: Pha lỗng 200 µl Stock với 800 µl PBS để đạt nồng độ 1µg/ml ... suất tạo phôi in vitro lợn nói chung, lợn địa nói riêng cịn thấp Vì chúng tơi đề xuất đề tài: ? ?Nghiên cứu nuôi thành thục trứng tạo phôi lợn địa Việt Nam kĩ thuật in vitro? ?? Mục tiêu: Nghiên cứu. .. tế vào ngành chăn nuôi nghiên cứu y-sinh lợn 1.3 Nghiên cứu tạo phôi in vitro lợn Bản 1.3.1 Một số đặc điểm hình thái sinh sản lợn Bản Việt Nam có nguồn đa dạng phong phú giống lợn mini địa nuôi. .. sinh sản lợn 12 1.2 Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro 1.2.1 Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng nguồn nguyên 15 liệu trứng điều kiện nuôi thành thục 15 Tạo phôi