xác định tính đa hình exon 14 gen mx và một số giống gà đa phương của việt nam

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------------------- ðỒNG THỊ HỒNG LIÊN XÁC ðỊNH TÍNH ðA HÌNH EXON 14 GEN Mx Ở MỘT SỐ GIỐNG GÀ ðỊA PHƯƠNG CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : TS. BÙI TRẦN ANH ðÀO TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI – 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Tác giả luận văn ðồng Thị Hồng Liên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của các cấp lãnh ñạo, ñơn vị tập thể và nhiều cá nhân: Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo sau ñại học, các thầy cô trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và ñặc biệt là các thầy cô khoa Thú Y ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi suốt khóa học. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến TS. Bùi Trần Anh ðào và TS. Nguyễn Thị Phương Thảo ñã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân ñây tôi xin cảm ơn các anh chị và các bạn công tác tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học; các cô chú tại những ñịa ñiểm thu thập mẫu ñã tạo ñiều kiện và nhiệt tình giúp tôi hoàn thành tốt ñề tài nghiên cứu của mình. ðồng thời, tôi xin cảm ơn Ban Giám ñốc, các cô chú, các anh chị và các bạn ñồng nghiệp tại Trung tâm Thực nghiệm và ðào tạo nghề nơi tôi công tác ñã tạo ñiều kiện về thời gian cũng như công việc giúp tôi hoàn thành khóa học cao học ñúng hạn. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội ñồng chấm luận văn ñã cho tôi những ñóng góp quý báu ñể hoàn chỉnh luận văn này. Dù ñã có nhiều cố gắng, tuy nhiên trong quá trong nghiên cứu ñề tài và viết luận văn vẫn còn những thiếu sót, rất mong nhận ñược sự ñóng góp ý kiến từ các thầy cô, các cô chú, các anh chị và các bạn. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Tác giả luận văn ðồng Thị Hồng Liên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Mục lục iii Các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1. MỞ ĐẦU 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Gen Mx và Mx protein ở động vật có xương sống 3 2.2 Gen Mx ở gà 6 2.3 Gen Mx và bệnh cúm gia cầm 17 2.4 Một số giống gà địa phương của Việt Nam 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2 Địa điểm, thời gian thực hiện 28 3.3 Nguyên liệu 28 3.4 Nội dung nghiên cứu 30 3.5 Phương pháp nghiên cứu 30 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR nhân gen exon 14 gen Mx ở gà 38 4.2 Kết quả nhân gen exon 14 ở 7 giống gà địa phương bằng PCR 39 4.3 Kết quả dòng hóa và giải trình tự exon 14 gen Mx ở 7 giống gà 41 4.3.1 Kết quả dòng hóa exon 14 gen Mx của 7 giống gà 41 4.3.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 42 4.4 Kết quả phân tích trình tự exon 14 gen Mx ở 7 giống gà bản địa 43 4.5 So sánh trình tự exon 14 giữa 7 giống gà địa phương với các giống gà trên thế giới 45 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iv 4.6 Kết quả phân tích trình tự amino axit của exon 14 51 4.7 Kết quả phân tích cây phả hệ của exon 14 ở gà 52 4.8 Kết quả xác định tần số alen ở vị trí 2032 exon 14 gen Mx của gà 54 4.9 Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự vùng 3’-UTR gen Mx 57 5. KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. v CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3’-UTR 3’ untranslated region 5’-UTR 5’ untranslated region Asn (N) Asparagine cDNA Complement DNA dN Non-synonymous substitution dS Synonymous substitution GED GTPase effector domain HA Hemagglutinin ISRE interferon stimulated response element LB agar Luria broth M Matrix protein MHC Major histocompatibility complex mRNA Messenger RNA Mx Myxovirus resistence NA Neuraminidase NP Nucleoprotein NS Nonstructure protein PA Transcriptase: protease activity? PB1 Transcriptase: elongation PB2 Transcriptase: cap binding PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction fragment length polymorphism Ser (S) Serine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vi DANH MỤC BẢNG STT Tên hình Trang 2.1 Vị trí phân bố và hoạt tính kháng virus của Mx protein * 6 2.2 Vị trí đa hình ở Mx cDNA của một số giống gà * 9 2.3 Tần số alen G/A 2032 và tần số kiểu gen của một số giống gà * 12 2.4 Tần số alen và tần số kiểu gen mã hóa aa thứ 631 Mx protein * 13 2.5 Trình tự mồi đặc hiệu alen trong phản ứng Realtime PCR 17 3.1 Cặp mồi dùng trong nghiên cứu 32 3.2 Thành phần phản ứng PCR dùng nhân exon 14 gen Mx ở gà 33 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR dùng nhân exon 14 gen Mx ở gà 33 4.1 Kết quả PCR nhân dòng exon 14 gen Mx ở 7 giống gà bản địa 40 4.2 Kết quả so sánh trình tự exon 14 giữa 7 giống gà bản địa và các trình tự được công bố trên ngân hàng gen 47 4.3 Vị trí đột biết nucleotide trên exon 14 gen Mx của gà 49 4.4 Tần số alen 2032-G/A ở 7 giống gà bản địa của Việt Nam 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc Mx protein và vị trí đột biến điểm ở vùng hiệu ứng 4 2.2 Cấu trúc gen Mx và Mx mRNA của gà 7 2.3 PCR-RFLP xác định đa hình nucleotide 2032-G/A 15 2.4 Real time PCR sử dụng mồi đặc hiệu alen xác định đa hình nucleotide 2032-G/A 16 3.1 Vị trí tương quan giữa sản phẩm PCR và Mx cDNA 32 3.2 Sơ đồ vectơ dòng hóa sản phẩm PCR 35 4.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR nhân gen exon 14 gen Mx của gà 38 4.2 Kết quả PCR nhân dòng exon 14 gen Mx của các giống gà 40 4.3 Kết quả dòng hóa exon 14 gen Mx của giống gà Móng 41 4.4 Minh họa kết quả giải trình tự exon 14 gen Mx của giống gà Hồ 43 4.5 Trình tự exon 14 gen Mx của 7 giống gà bản địa 44 4.6 Kết quả so sánh trình tự exon 14 gen Mx của các giống bản địa với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen 46 4.7 So sánh trình tự amino axit mã hóa bởi exon 14 ở gà 51 4.8 Cây phả hệ biểu diễn mối liên hệ giữa trình tự exon 14 của gà 53 4.9 Tần số alen 2032-G/A của các giống gà trong nghiên cứu 56 4.10 Phân tích, so sánh trình tự 3’-UTR của Mx mRNA của gà 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 1 1. MỞ ðẦU Gen Mx (Myxovirus resistence) thuộc nhóm các gen nhỏ có mặt ở tất cả các loài có xương sống từ lớp cá đến động vật bậc cao và chỉ được kích hoạt bởi interferon type I. Sản phẩm của gen Mx hoạt hóa protein Mx tồn tại dưới nhiều dạng (isoform) với hoạt tính kháng virus không giống nhau. Ở gà (Gallus domesticus, Gallus gallus spp), gen Mx có kích thước khoảng 21kb nằm trên nhiễm sắc thể số 1. Nghiên cứu so sánh trình tự gen Mx của các giống gà khác nhau [14] cho thấy: (1) có tới 14/25 nucleotide sai khác dẫn tới sự thay đổi amino axit (non-synonymous), (2) chỉ có sai khác ở vị trí axit amin 631 của protein Mx quyết định tới khả năng đề kháng sự xâm nhiễm của virus in vitro (kháng vesicular stomatitis virus và H5N1 influenza virus). Sự sai khác ở amino axit thứ 631 này được quy định bởi đa hình nucleotide G/A tại vị trí 2032 của Mx cDNA hay vị trí 1892 của Mx mRNA. Ngược lại, một số nghiên cứu chỉ ra rằng đa hình nucleotide kể trên không liên quan đến hoạt tính kháng virus [6, 7, 27, 30]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Ewald và cộng sự [9] cho thấy Mx protein, cụ thể là sự thay đổi ở amino axit 631 có liên quan tới hiệu lực kháng virus cúm gia cầm. Nhóm tác giả nhấn mạnh: (1) hiệu lực kháng virus này có sự khác biệt rõ rệt giữa kết quả in vitro và in vivo (trên bản động vật); (2) việc lựa chọn chủng virus thí nghiệm là yếu tố quyết định đến kết quả thí nghiệm xác định hiệu lực kháng/không kháng virus của protein này. Bên cạnh các nghiên cứu kể trên, các nghiên cứu về tần số alen G/A 2032 của gen Mx quy định tính mẫn cảm hoặc kháng virus chỉ ra có sự khác biệt rõ rệt giữa các giống gà. Nhìn chung các giống gà bản địa, thường có tần số alen kháng virus (alen A) cao hơn so với những giống gà thương phẩm [5, 19, 28]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 2 Trong bối cảnh dịch cúm A H5N1 thể độc lực cao xuất hiện ở Hồng Kông năm 1997 và bùng phát ở nhiều châu lục kéo dài cho đến hiện nay, bên cạnh giải pháp vacxin và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi, một trong những giải pháp khả dĩ là nghiên cứu và chọn tạo những giống gà đề kháng với virus cúm A dựa trên cơ sở lựa chọn giống mang alen quy định tính kháng virus. Hiện trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu công bố về đa hình nucleotide 2032 của Mx cDNA trên các giống gà bản địa của Nhật Bản [14], Trung Quốc [19], Indonesia [31] v.v…. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công bố về trình tự exon 14 gen Mx ở các giống gà bản địa. Do vậy, được sự phân công của Viện Đào tạo sau đại học, dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Trần Anh Đào và TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác ñịnh tính ña hình exon 14 gen Mx ở một số giống gà ñịa phương của Việt Nam”. Mục tiêu của ñề tài Xác định đa hình nucleotide ở vị trí 2032 của Mx cDNA ở một số giống gà địa phương của Việt Nam. Ý nghĩa của ñề tài Tạo cơ sở cho những nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus cúm của các giống gà địa phương của Việt Nam và những nghiên cứu chọn, tạo giống, dòng kháng bệnh cúm gia cầm trong tương lai.