Bước đầu phân lập và nghiên cứu chủng nấm metarhizum anisopliae trên côn trùng hại lạc tại xã nghi trung nghi lộc nghệ an

1 Trờng đại học vinh Khoa sinh học - - Võ thị hoa Bớc đầu phân lập nghiên cứu chủng nấm metarhizium anisopliae côn trùng hại lạc xà nghi trung - nghi lộc - nghệ an Khoá luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành s phạm sinh học Vinh 2010 2010 Trờng đại học vinh Khoa sinh học - - Bớc đầu phân lập nghiên cứu chủng nấm metarhizium anisopliae côn trùng hại lạc t¹i x· nghi trung - nghi léc - nghƯ an Khoá luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành s phạm sinh học Giáo viên hớng dẫn : GVC Nguyễn Dơng Tuệ Sinh viên thực : Võ Thị Hoa Líp : 47A - Sinh VINH - 2010 LỜI CẢM ƠN Những năm học trường đại học Vinh cho em nhiều kiến thức làm tảng, sở thực đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học Trong trình nghiên cứu đề tài, em nhận bảo, giúp đỡ tận tình thầy, cô giáo trường đại học Vinh Trước hết, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ hướng dẫn, bảo nhiệt tình, chu đáo cho em suốt trình học tập nghiên cứu Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn quan tâm, giúp đỡ to lớn thầy cô khoa Sinh học anh chị cán phòng thí nghiệm Di truyền Vi sinh - Khoa Sinh học - trường đại học Vinh suốt thời gian làm khóa luận Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, bác nông dân xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An ủng hộ, động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn Em xin chân thành cảm ơn ! Vinh, tháng năm 2010 Sinh viên Võ Thị Hoa MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược tình hình nghiªn cứu chủng nm Metarhizium anisopliae giới Việt Nam .5 1.1.1 Trªn thÕ giíi 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Tác hại sâu hại sản xuất nông nghiệp 10 1.3 Đặc điểm chủng nấm Metarhizium anisopliae .11 1.3.1 Đặc điểm phân loại hình thái Metarhizium anisopliae .11 1.3.2 Cơ chế tác động gây bệnh cho côn trùng nấm Metarhizium anisopliae .12 1.3.3 Những bệnh lý biểu côn trùng bị nấm mốc ký sinh tiêu diệt .13 1.3.4 Vai trị nấm ký sinh trùng tự nhiên 15 1.4 Đánh giá thuốc trừ sâu sinh học .16 1.4.1 Ưu điểm thuốc trừ sâu sinh học 16 1.4.2 Nhược điểm thuốc trừ sâu sinh học .18 1.5 Chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm Metarhizium 18 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp điều tra thực địa 21 2.2.2 Phương pháp thu mẫu sâu 22 2.2.3 Phương pháp phân lập nấm 22 2.2.4 Xác định số lượng bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae phương pháp CFU (colony forming unit) độ đo đục (Nephelometer) 24 2.2.5 Phương pháp quan sát chủng nấm Metarhizium anisopliae tiêu cố định 25 2.2.6 Phương pháp xác định sinh trưởng theo Blachman 25 2.2.7 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng Metarhizium anisoplieae 25 2.2.8 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ ẩm đến sinh trưởng phát triển chủng Metarhizium anisoplieae 26 2.2.9 Phương pháp tìm hiểu ảnh hưởng độ pH đến sinh trưởng phát triển chủng Metarhizium anisoplieae 26 2.2.10 Thử nghiệm ảnh hưởng chủng nấm Metarhizium anisoplieae đến đời sống sâu hại lạc 26 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tình hình sản xuất lạc thực trạng sâu hại lạc xã Nghi Trung Nghi Lộc - Nghệ An 28 3.1.1 Đặc điểm tình hình sản xuất lạc 28 3.1.2 Thực trạng sâu bệnh hại lạc 29 3.2 Kết nghiên cứu đặc điểm chủng nấm phân lập 31 3.2.1 Tần số gặp chủng nấm mốc sâu hại lạc 31 3.2.2 Đặc điểm chủng nấm mốc kí sinh sâu hại lạc 32 3.3 Kết nghiên cứu chủng Metarhizium anisopliae 37 3.3.1 Xác định số lượng bào tử chủng Metarhizium anisopliae phương pháp CFU (colony forming unit) 37 độ pha loãng thập phân 38 3.3.2 Kết đo độ đục 39 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng, phát triển chủng Metarhizium anisoplieae .40 3.3.4 Ảnh hưởng độ ẩm tới sinh trưởng, phát triển chủng Metarhizium anisoplieae .42 3.3.5 Ảnh hưởng độ pH tới sinh trưởng, phát triển chủng Metarhizium anisoplieae .44 3.3.6 Thử nghiệm khả diệt sâu chủng Metarhizium đến đời sống số loài sâu hại lạc 47 3.4 Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm phục vụ sản xuất .50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận .53 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1.2: Tình hình sử dụng biện pháp phòng trừ sâu hại lạc địa phương 30 Bảng 3.2.1: Tấn số gặp chủng nấm mốc xác sâu .31 Bảng 3.2.2: Một số đặc điểm chủng nấm mốc phân lập sau ngày nuôi cấy môi trường Czapeck 33 Bảng 3.3.1: số lượng bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae độ pha loãng thập phân .38 Bảng 3.3.2a: Bảng thang mật độ bào tử độ đục chủng Metarhizium anisopliae độ pha loãng thập phân .39 Bảng 3.3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng, phát triển chủng Metarhizium anisopliea 41 Bảng 3.3.4: Ảnh hưởng độ ẩm tới sinh trưởng, phát triểncủa chủng Metarhizium anisoplieae .43 Bảng 3.3.5: Ảnh hưởng độ pH tới sinh trưởng, phát triển chủng Metarhizium anisoplieae 45 Bảng 3.3.6: Kết thử nghiệm khả diệt sâu chủng Metarhizium đến đời sống số loài sâu hại lạc .48 DANH MỤC HÌNH, ẢNH Hình 3.2.1: So sánh tỉ lệ gặp chủng nấm mốc kí sinh sâu hại lạc 32 Hình 3.3.1: So sánh mật độ bào tử chủng Metarhizium anisopliae 38s Hình 3.3.2b: Đường chuẩn NTU/CFU .39 Hình 3.3.3: So sánh tốc độ sinh trưởng chủng Metarhizium anisoplieae nhiệt độ khác .42 Hình 3.3.4: So sánh tốc độ sinh trưởng chủng Metarhizium anisoplieae độ ẩm khác 44 Hình 3.3.5: So sánh tốc độ sinh trưởng chủng Metarhizium anisoplieae độ pH khác 46 Hình 3.3.6: So sánh tỷ lệ sâu chết nhiễm nấm Metarhizium anisoplieae độ pha loãng khác .50 Ảnh 1: Một số sâu hại lạc 29 Ảnh 2: Các chủng nấm mốc kí sinh sâu phân lập môi trường Czapeck .35 Ảnh 3: Chủng Metarhizium anisopliae 36 Ảnh 4: Khuẩn ty bào tử chủng nấm Metarhizium anisopliae 36 Ảnh 5: Thể bình chủng Metarhizium anisopliae .36 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghệ An tỉnh có diện tích sản lượng lạc lớn nước với diện tích trồng lạc khoảng 25 ngàn ha/năm sản lượng 45 ngàn tấn/năm Lạc (Arachis hypogea L.) trồng lý tưởng hệ thống luân canh cải tạo đất màu Nghệ An Nó cung cấp mặt hàng nơng sản xuất thực phẩm có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, suất lạc Nghệ An nói riêng, Việt Nam nói chung cịn thấp so với nhiều nước giới Trung Quốc 2,9 tấn/ha, Mỹ 3,0 tấn/ha (Theo FAO, USDA(*) 2005) [3] Qua nghiên cứu cụ thể địa bàn xã Nghi Trung - Nghi Lộc - Nghệ An cho thấy có nhiều nguyên nhân làm giảm suất lạc, sâu bệnh nguyên nhân chủ yếu Lạc Nghi Trung trồng vụ/năm : Vụ Đông Xuân (tháng 7- tháng 11, âm lịch), vụ Xuân Hè (tháng1- tháng5, âm lịch) Cũng nh loại khác, lạc b nhiều loại côn trùng phá hoại k t gieo trồng thu hoạch nh cµo cào, châu chấu, sâu róm, sâu khoang, sâu xanh, sâu cn l¸ Số lượng lồi sâu hại mật độ chúng lạc thay đổi tuỳ theo điều kiện khí hậu thời tiết, giống, điều kiện kỹ thuật canh tỏc Theo báo điện tử Nghệ An toàn tỉnh có tới 900 lạc bị sâu phá hoại nh sâu xanh sâu khoang, cào cào, châu chấu trung bình mật độ 1-3 con/m2, có nơi 15-20 con/m2,chủ yếu vào cuối tháng hai Hng nm, thit hi sâu hại lạc khoảng 25-30% chí có lên đến 40-50%.[2] Để bảo vệ mùa màng, người nông dân sử dụng thuốc hố học có độ độc cao để phun phòng ngừa sâu hại Hiện nay, thuốc trừ sâu có khoảng 1.000 loại tên thương mại chứa khoảng 5000 loại hóa chất độc hại với số lượng hàng vạn bán thị trường [5] Thùc tÕ cho thÊy viƯc sư dơng thc trõ s©u hoá học với số lợng nhiều liên tục đà tiêu diệt đợc sâu nhng đồng thời tiêu diệt thiên địch nhiều vi sinh vật có lợi, tích luỹ độc hại cho nông phẩm, gây ô nhiễm nguồn nớc, gây hại loài thuỷ sinh, cân sinh thái nhiều mực độ khác Vì vậy, vic s dng chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh vừa nâng cao st, phÈm chÊt c©y trång, võa bảo vệ mơi trường sinh thỏi cng nh sc kho ngi điều thùc sù cÇn thiÕt Biện pháp đánh giá giải pháp tích cực, đầy tính khả thi cho nông nghiệp Tuy Việt Nam, người dân chưa có thói quen sử dụng nhiều chế phẩm sinh học diệt sâu hại người ta đánh giá cao Những chế phẩm sinh học đưa vào nước ta từ đầu năm 1970 với số lượng Đầu tiên chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) nghiên cứu năm 1971 Một số dòng virus NPV (Nucleopolyhedroviruses) GV (Granuloviruses) nghiên cứu từ năm 80 Năm 1990, Viện Bảo vệ Thực vật phân lập sản xuất thử số lồi nấm ký sinh gây bệnh trùng cho kết khả quan Những năm gần đây, nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt trùng đạt nhiều thành tựu Trong đó, người ta trọng tới việc nghiên cứu chủng nấm Metarhizium anisopliae Đây chủng nấm có khả diệt 200 loài sâu loài rầy, mối, bọ xít, bọ cánh cứng, cào cào, mối nhiều lồi sâu ăn khác [18] Nó sử dụng sinh học trừ sâu để kiểm sốt số lồi gây hại trùng sử dụng kiểm soát bệnh sốt rét muỗi nghiên cứu [18] Ở nước ta có số cơng trình nghiên cứu chủng Metarhizium anisopliea nghiên cứu sử dụng Metarhizium flovoviridae trừ mối (Nguyễn Dương Khuê, 2005), Metarhizium aniopliae phịng trừ rầy nâu, bọ xít, sâu cắn gié lúa, bọ cánh cứng hại dừa (Phạm Thị Thùy cộng sự, 2004 - 2005; Nguyễn Thị Lộc đồng nghiệp, 2002 ) [12] Tại Cần Thơ, từ năm 2005-2007 sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để phòng trị sâu ăn tạp, rầy đạt hiệu cao 70% sau 7-12 Tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học từ chủng nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ sâu hại nước ta cịn ít, với quy mơ thí điểm số địa phương Tại Nghệ An, năm 2004 chế phẩm sinh học đưa vào ứng dụng sang lĩnh vực sản xuất nông nghiệp chăn nuôi Bước đầu, chế phẩm đưa vào 10 khảo nghiệm 20 lạc HTX tiêu biểu thuộc địa bàn huyện: Diễn Châu, Quỳnh Lưu, Nam Đàn, Nghi Lộc Đối với diện tích có phun EMt khả chống chịu bệnh tốt suất cao diện tích khơng phun chế phẩm Mới nhất, chế phẩm sinh học ứng dụng vào thử nghiệm xử lý bệnh dịch vàng lùn xoắn hại lúa tỉnh Nghệ An cho kết tốt, góp phần đẩy lùi dịch bệnh [1] Víi mong mn t×m hiĨu thêm đặc điểm điều kiện ảnh hởng tíi sù sinh trëng, ph¸t triĨn cđa nÊm Metarhizium anisopliae khả tiêu diệt sâu hại lạc nấm này, lựa chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp: "Bớc đầu phân lập nghiên cứu chủng nấm Metarhizium anisopliae côn trùng hại lạc xà Nghi Trung - Nghi Lc - Nghệ An" Mục tiêu đề tài Do thấy đợc ý nghĩa quan trọng việc sử dụng nấm Metarhizium anisopliae diệt sâu hại lạc, ảnh hởng lớn đến suất, phẩm chất trồng nên thực đề tài nhằm: 1.Tìm hiểu tình hình sâu hại lạc 2.Thu thập sâu hại lạc từ phân lập chủng nấm Metarhizium anisopliae Nghiên cứu đặc điểm sinh học yếu tố ảnh hớng tới sinh trởng phát triển chủng Metarhizium anisopliae, định hớng việc điều khiển chủng sinh trởng,phát triển tốt theo mục đích ngời sử dụng 4.Trên sở kết thu đợc, xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm, sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn Nhiệm vụ đề tài Để đạt đợc mục tiêu trên, đề tài bao gồm nhiệm vụ: Điều tra thực địa, thu thập, xử lý, bảo quản mẫu Pha chế môi trờng nuôi cấy, ph©n lËp chđng Metarhizium anisopliae, theo dâi sù sinh trëng phát triển chủng Tiến hành thí nghiệm ảnh hởng số yếu tố môi trờng tới trình sinh trởng,phát triển, tìm điều kiện tối u để chủng Metarhizium anisopliae sinh trởng, phát triển tốt 4.Từ yếu tố thích hợp nhất, xây dựng quy trình sản xuất sinh khối, sản xuất chế phÈm nÊm Metarhizium anisopliae ®Ĩ cã thĨ sư dơng thùc tiÔn ... diệt sâu hại lạc nấm này, lựa chọn đề tài khoá luận tốt nghi? ??p: "Bớc đầu phân lập nghi? ?n cứu chủng nấm Metarhizium anisopliae côn trùng hại lạc xà Nghi Trung - Nghi Lc - Nghệ An" Mục tiêu đề tài... với việc nghi? ?n cứu nấm mốc ký sinh côn trùng ứng dụng chúng giới, nước ta bước đầu nghi? ?n cứu loại nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại việc nghi? ?n cứu nấm mốc ký sinh thể côn trùng phát... cứu đặc điểm chủng nấm phân lập 31 3.2.1 Tần số gặp chủng nấm mốc sâu hại lạc 31 3.2.2 Đặc điểm chủng nấm mốc kí sinh sâu hại lạc 32 3.3 Kết nghi? ?n cứu chủng Metarhizium anisopliae