Phân lập tạo đột biến điểm ở gen p5cs liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ THÖY HƢỜNG PHÂN LẬP, TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM Ở GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hƣóng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hồng Mậu PGS.TS Chu Hoàng Hà THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Thuý Hường Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu Hoàng Hà tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS Nguyễn Hữu Cƣờng toàn thể cán phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho trình nghiên cứu hồn thành luận án Xin cảm ơn giúp đỡ nhóm nghiên cứu đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tập thể cán Bộ môn Di truyền &Sinh học đại giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu đề tài luận án Tôi xin cảm ơn thầy cô khoa Sinh-KTNN khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái Nguyên, xin cảm ơn lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm lãnh đạo Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện Ban giám đốc Sở Giáo dục&Đào tạo Tỉnh Sơn La, Ban giám đốc Trung tâm giáo dục thƣờng xuyên Thành phố Sơn La Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập thực thành công luận án Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2010 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thúy Hƣờng Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid ATP Adenozin triphosphata ATP-ase Enzyme phân giải ATP cDNA Sợi DNA bổ sung (Complementary DNA) AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzymee phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy DEPC Diethyl pyrocarbonate đtg đồng tác giả dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzymee βGlucuronidase HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside kb kilo base LB Luria Bertani LSD Least significant difference = độ lệch chuẩn LEA Late embryogenesis abundant MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MS Môi trƣờng muối theo Murashige Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density P5CS Gen mã hóa pyroline-5-carboxylate synthetase P5CDH Pyrroline carboxylate dehydrogenase P5CR Pyrroline carboxylate reductase PDH Pyrroline dehydrogenase rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trƣờng rễ SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chồi SEM Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chồi T-DNA Transfer –DNA = đoạn ADN đƣợc chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA v/p vịng/phút X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosidase Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu tƣơng 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.2 CƠ SỞ SINH LÝ, HĨA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 10 1.2.1 Khả thích nghi rễ điều kiện hạn 11 1.2.1.1.Sự phát triển rễ 11 1.2.1.2 Khả cố định nitơ đậu tƣơng điều kiện hạn 13 1.2.2 Các tính trạng liên quan đến thích ứng đậu tƣơng điều kiện hạn 14 1.2.2.1 Cƣờng độ thoát nƣớc khí khổng 14 1.2.2.2 Cƣờng độ thoát nƣớc biểu bì 15 1.2.2.3 Mật độ lông tơ 17 1.2.2.4 Hiệu sử dụng nƣớc 17 1.2.3 Đáp ứng phƣơng diện hóa sinh đậu tƣơng điều kiện hạn 18 1.2.4 Một số gen liên quan đến tính chịu hạn 19 1.3 PROLINE VÀ VAI TRÕ CỦA ENZYMEE P5CS TRONG CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROLINE 21 1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp proline 21 1.3.2 Điều hịa q trình trao đổi proline thực vật 23 1.3.3 Vai trò tích lũy proline tính chống chịu 25 1.3.4 Vai trò enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase tính chống chịu trồng 27 1.4 PROMOTER VÀ VAI TRÕ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN DƢỚI ĐIỀU KIỆN KHƠ HẠN Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4.1 Cấu trúc chức promoter 29 1.4.2 Các loại promoter sử dụng công nghệ sinh học 30 1.4.3 Promoter rd29A 32 1.5 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 33 1.5.1 Nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng phƣơng pháp đột biến thực nghiệm 33 1.5.2 Sử dụng công nghệ tế bào thực vật chọn dòng đậu tƣơng chịu hạn 34 1.5.3 Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng 35 1.5.3.1 Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật 35 1.5.3.2 Tiềm phƣơng pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu tạo đậu tƣơng chịu hạn 37 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 39 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 39 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Phƣơng pháp sinh lý, hoá sinh 40 2.2.1.1 Đánh giá nhanh khả chịu hạn 40 2.2.1.2 Định lƣợng protein, lipit, hàm lƣợng thành phần axit amin hạt 40 2.2.1.3 Xác định hàm lƣợng proline 41 2.2.1.4 Phƣơng pháp tính tốn xử lý số liệu 41 2.2.2 Các phƣơng pháp sử dụng nuôi cấy in vitro 41 2.2.2.1 Arabidopsis 41 2.2.2.2 Thuốc 41 2.2.2.3 Đậu tƣơng 42 2.2.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử 45 2.2.3.1 Thiết kế mồi 45 2.2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết, tinh DNA RNA 46 2.2.3.3 Phƣơng pháp tổng hợp cDNA 46 2.2.3.4 Phản ứng PCR 47 2.2.3.5 Phƣơng pháp OE - PCR ( Overlap Extention) 47 2.2.3.6 Phƣơng pháp tách dòng 48 2.2.3.7 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 50 2.2.2.8 Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS rd29A::P5CSM……… ……………49 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3.9 Các phƣơng pháp phân tí ch biến nạp 53 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 KẾT QUẢ SƢU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG CỦA TỈNH SƠN LA 54 3.1.1 Đặc điểm hình thái, hóa sinh hạt đậu tƣơng 54 3.1.2 Kết đánh giá khả chịu hạn giống đậu tƣơng nghiên cứu 56 3.2 PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƢỢC 59 3.2.1 Kết phân lập gen P5CS 59 3.2.2 Kết khuếch đại, tách dịng xác định trình tự gen P5CS 60 3.2.3 Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngƣợc P5CS phân lập từ đậu tƣơng 70 3.3 PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A 74 3.3.1 Phân lập promoter rd29A 74 3.3.2 Phân tích trình tự promoter rd29A 75 3.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 76 3.3.4 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS 75 3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÖC rd29A::P5CSM 78 3.4.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 78 3.4.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 81 3.4.3 Đánh giá khả chị u hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen 84 3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN 86 3.5.1 Kết tái sinh tạo đa chồi giống đậu tƣơng DT84 86 3.5.1.1 Tối ƣu thời gian khử trùng hạt 84 3.5.1.2 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi từ mầm hạt chín 89 3.5.1.3 Ảnh hƣởng hocmon sinh trƣởng GA3 tới khả kéo dài chồi 91 3.5.1.4 Ảnh hƣởng IBA đến hiệu tạo rễ 91 3.5.1.5 Xác định giá thể thích hợp cho in vitro 95 3.5.2 Kết bƣớc đầu chuyển gen GUS vào đậu tƣơng DT84 96 3.5.3 Kết chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tƣơng 99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tƣơng số quốc gia giới Bảng 1.2 Sản lƣợng đậu tƣơng số quốc gia giới Bảng 1.3 Năng suất đậu tƣơng số quốc gia giới Bảng 1.4 Sản lƣợng đậu tƣơng tỉnh thành phố Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 46 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 47 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 47 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dịng 48 Bảng 2.5 Thành phần hố chất tách plasmid 48 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A vector pBI 101 50 BamHI HindII Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM BamHI SacI 50 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52 Bảng 3.1 Các giống đậu tƣơng địa phƣơng sƣu tập tỉnh Sơn La 53 Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn tỷ lệ tăng hàm lƣợng proline giống 57 đậu tƣơng nghiên cứu Bảng 3.3 Vị trí trình tự nucleotid mồi đặc hiệu gen P5CS 58 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trình tự nucleotid gen P5CS giống 64 đậu tƣơng Bảng 3.5 Vị trí sai khác trình tự axit amin gen P5CS giống 65 đậu tƣơng Bảng 3.6 Vị trí trình tự nucleotid mồi đặc hiệu gen P5CS 69 Bảng 3.7 Hàm lƣợng proline tích lũy dịng thuốc nghiên cứu 82 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn GUS biểu hiện khá mạnh và rõ ràng dòng thuốc chuyển gen đƣợc xƣ̉ lý hạn nhân tạo so với dịng chuyển gen khơng xử lý đối chứng 1.6 Đối với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM, có tƣợng tăng cao hàm lƣợng proline sau gây hạn nhân tạo, dẫn đến khả sống sót cao các đối chƣ́ng (không chuyển gen ) Khả phục hồi dòng chuyển gen nhanh các đối chứng 1.7 Tới ƣu đƣợc quy trình tái sinh chuyển gen thông qua mô nách mầm đậu tƣơng Bƣớc đầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A::P5CSM vào giống đậu tƣơng DT84, thu đƣợc số dịng dƣơng tính PCR gen chuyển Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu , phân tí ch dòng đậu tƣơng chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống - Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A::GUS rd29A::P5CSM vào đối tƣợng trồng khác Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 103 http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phƣơng, Trần Thị Trƣờng (2006), “Sƣu tập, phân loại đánh giá chất lƣợng hạt số giống đậu tƣơng địa phƣơng tỉnh Sơn La” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nông thôn số 11 kỳ I tháng 6/2006 28-32 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hƣờng (2006), “Thành phần axit amin khả chịu hạn số giống đậu tƣơng địa phƣơng tỉnh Sơn La” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nơng thơn số 20 kì II tháng 10/2006 22-26 Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2008) Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen P5CS số giống đậu tƣơng (Glycine max L.Merrili) Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4): 459-466 Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009) Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tƣơng (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên 52(4): 82-88 Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2009) Tạo gen mã hóa enzyme P5CS (Pyroline - carboxylate synthase) mang đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi kỹ thuật PCR Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2009: 191 - 193 Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Chu Hoàng Hà (2010) Tách dòng đánh giá hoạt động promoter cảm ứng khơ hạn RD29A tƣ̀ Arabidopsis thaliana Tạp chí Cơng nghệ sinh học 8(4): 1805-1810 Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Chu Hoàng Hà (2010) Tạo thuốc chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc, làm tăng hàm lƣợng protein khả chống chịu khô hạn Hội nghị toàn quốc khoa học sống Bio-Hà Nội 2010 Tạp chí Cơng nghệ sinh học (3A): 539-544 Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline – – carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar ( Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010): 319-323 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 104 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hỗ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nơng Nghiệp Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa NXB Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Hữu Cƣờng, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tƣơng quan hàm lƣợng proline tính chống chịu lúa Tạp chí cơng nghệ sinh học, 1(1): 85-95 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi, Nguyễn Thị Tỵ (1998), “Xác định thành phần axit amin phương pháp dẫn xuất hoá với 0-phthalđialehyd 9-fluorenlmthyl chlorofomat hệ HP aminoquan series II”, kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1997 NXB khoa học kỹ thuật H, 454-461 Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương NXB Nông Nghiệp Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2005) Sinh học phân tử NXB Giáo Dục.101-112 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương NXB Nơng Nghiệp Trần Thị Cúc Hịa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tƣơng trồng Việt Nam“ Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn 18: 11-16 10 Nguyễn Nhƣ Khanh(2008), Sinh học phát triển thực vật NXB Giáo dục 11 Nguyễn Nhƣ Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật 2008, NXB Giáo dục Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 105 http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học: Hà Nội 13 Trần Thị Phƣơng Liên (2010) Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ :82-140 14 Trần Đình Long, Đồn Thị Thanh Nhàn (1995) Kết nghiên cứu giống đỗ tương M103, Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991-1995:52-56 15 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 16 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội 17 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà , Lê Trần Bì nh (2009) “Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 193- 201 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 20 Armengaud P, Thiery L, Buhot N, Grenier-de March G, Savouré A (2004) “Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features“ Physiologia plantarum 120(3), 442-450 21 Bates LS (1973), Rapid determination of free proline for water stress studies Plant Soil 39: 205-207 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 106 http://www.lrc-tnu.edu.vn 22 Baucher M, Andree BVM , Chabbert B, Michel BJ, Opsomer C, Van MM and Botterman J (1999) “Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility” Plant Molecular Biology 39: 437-447 23 Boggess SF and Stewart CR (1976), “Effect of water stress on proline synthesis from radioactive precursors” Plant Physiology, 58(3): 398-401 24 Borsani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK (2005) “Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis” Cell, 123: 1279–1291 25 Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins’’, Physiologia plantarum, 795-803 26 Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemieniak D, and Slightom JL (1988), “Nucleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress” Gene 64(2): 199-205 27 Curtis J, Shearer G, and Kohj DH (2004), “Bacteroid proline catabolism affects N(2) fixation rate of drought-stressed soybeans” Plant Physiology, 136(92): 3313-3318 28 Chen JB, Wang SM, Jing RL, and Mao XG (2009), “Cloning the PvP5CS gene from common bean (Phaseolus vulgaris) and its expression patterns under abiotic stresses” Journal of Plant Physiology, 166(1): 12- 19 29 Choudhary NL, Sairam RK, and Tyagi A (2005), “Expression of ∆1 Pyrroline - - carboxylate synthetase gene during droght in rice (Oryza sativa L)” Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 42: 366-370 30 Delauney AJ, Hu CAA, and Kishor PB, Verma, D P S (1993) “Cloning of ornithine δ- aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by transcomplementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis” Journal of Biological Chemistry, 268: 18673-18678 31 Dix PJ, (1986) “Plant cell culture technology” Yeoman M.M (eds), Oxford, Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 107 http://www.lrc-tnu.edu.vn Blackwell Scientific Publications 143-201 32 Do TH, Jacob M, Angenon G, Hermans C, Tran TT, Le VS, and Roosens NH (2003), “Proline accumulation and ∆1 - Pyrroline - - carboxylate synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and drought tolerance” Plant Sciences, 165: 1059-1068 33 Fior S, Vianelli A, and Gerola PD (2009), “A novel method for fluorometric continuous measurement of β-glucuronidase (GUS) activity using 4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) as substrate” Plant Sciences 176(1): 130-135 34 Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J (2005) “EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis” The Plant Journal, 43(4): 553-567 35 Hai L, Qingyin Z, Yan LZ, Shasheng W, Xiangning J (2003), “Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco” Plant Growth Regulation 41: p 279-286 36 HamiltonIIIEW,HeckathornSA(2001)MitochondrialadaptationstoNaCl.Com plex I is protected oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is protected by prolinee and betaine Plant Physiology, 126:1266–1274 37 Hawkins S, Samaj J, Lauvergeat V, Boudet A, Grima-Pettenati J(1997), Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in Transgenic Poplar Plant Physiology, 113(2): p 321-325 38 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994) “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries the T-DNA”, The Plant Journal (271-282) 39 Hirasawa, T Tanaka K., Miyamoto D., Takei, M and Ishihara K (1994) “Effects of preflowering moisture deficits on dry matter production and Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 108 http://www.lrc-tnu.edu.vn ecophysiological characteristics in soybean plants under drought conditions during grain filling” Japanese Journal of Crop Sciences, 63: 721-730 40 Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) An auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt tolerance in Arabidopsis Molecular Plant, doi:10.1093/mp/ssn087 41 Hong HP, Zhang H, Olhoft P, Hill S, Wiley H, Toren E, Hillebrand H, Jones T, Cheng M (2007),“Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max (L.) Merriil” In vitro Cellular Developmental Biology-Plant, 43: 558-568 42 Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS (2000) Removal of feedback inhibition of -pyrroline -5- carboxylate synthetase results in increased prolinee accumulation and protection of plants from osmotic stress” Plant Physiology, 122: 1129-1136 43 Hoogenboom G.Peterson, CM, Huck, MG (1987) “Shoot growth rate of soybeans as affected by drought stress” Agronomy Journal, 79: 598-607 44 Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) “A bifunctional D1-enzymeepyrroline-5-carboxylate synthetase catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants” Proc Natl Acad Sci USA, 89: 9354 – 9358 45 Hua X, Van De Cotte B, Van Montagu, M., Verbruggen N (1999) “A 69 bp fragment in the pyrroline-5-carboxylate reductase promoter of Arabidopsis thaliana activates minimal CaMV 35S promoter in a tissue-specific manner” FEBS Letters 458:193–196 46 Hua X-J, Van De Cotte B, Van Montagu M, Verbruggen N (1997) Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabidopsis Plant Physiology, 114: 1215–1224 47 Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M and Ushijima T (1983) “Soybean adaptation to water stress at selected stages of growth” Plant Physiology, 73: 422-427 48 Hufstetler EV, Boerma, HR, Carter TE, Earl HG (2007) “Genotypic Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 109 http://www.lrc-tnu.edu.vn variation for three physiological traits affecting drought tolerance in soybean” Crop Sciences 47: 25-35 49 James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008a) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean” Australian Journal of Agricultural Research, 59: 656-669 50 James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008b) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean” Australian Journal of Agricultural Research, 59: 670-678 51 Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: 3901-3907 52 Jovanovi Z, Proki L, Stiki R, Peki S (1996) “Cuticular characteristics in maize lines differing in drought resistance and maturity grouping” Journal of Experimental Botany, 47: 59-60 53 Jun SS, Choi HJ, Yang JY, Hong YN (2001), “Photosynthetic response to dehydration and high temperature in trehalose-producing transgenic tobacco In PS2001 Proceedings, 12th International Congress on Photosynthesis” CSIRO Publishing, Canberra, S35-017 54 Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC (1984) “Taproot elongation rates of soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting depth” Crop Sciences, 24: 916-920 55 Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G, Hu C, Verma DPS (1995) Overexpression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthase increases prolinee overproduction and confers osmotic tolerance in transgenic plants Plant Physiology, 108: 1387–1394 56 King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated ureides and aminoacids” Plant Physiology, 137: 1389-1396 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 110 http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 Kishor PBK, Sangam S, Amrutha RN, Sri Laxmi P, Naidu KR, Rao K R S S, Sreenath Rao, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N (2005) “Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance” Current Science 88: 424 – 438 58 Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics Erich Grotewold (Ed.)”, Humana Press 189-204 59 Kohl DH, Schubert KR, Carter MB, Hagedorn CH, Shearer G (1988) Prolinee metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis Proc Natl Acad Sci, USA 85: 2036–2040 60 Lambert N, Yarwood JN (1992), Engineering legume seed storage protein, in Plant Protein Engineering Cambridge University press, 167-187 61 Liu F, Andersen MN, Jensen CR (2003) “Loss of pod set caused by drought stress is associated with water status and ABA content of reproductive structures in soybean” Functional Plant Biology 30: 271-280 62 Liu Y, Gai JY, Lu HN, Wang Y J, Chen SY (2005) “Identification of drought tolerant germplasm and inheritance and QTL mapping of related root traits in soybean [Glycine max (L.) Merr.]” Yi Chuan Xue Bao 32: 855863 63 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (November 1951) "Protein measurement with the Folin phenol reagent" Journal of Biological Chemistry, 193 (1): 265–75 64 Marino D, Frendo P, Ladrera R, Zabalza A, Puppo A, Arrese-Igor C (2007) “Nitrogen fixation control under drought stress Localized or systemic?” Plant Physiology, 143: 1968–1974 65 Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costantino P, and Trovato M (2009) “The proline biosynthetic Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 111 genes P5CS1 and P5CS2 play http://www.lrc-tnu.edu.vn overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo development” Physiologia Plantarum 137: 72–85 66 Matysik J, Ali Bhalu,B, Mohanty P (2002) “Molecular mechanism of quenching of reactive oxygen species by proline under water stress in plants” Current Sciences 82: 525-532 67 Murakeozy EP, Nagy Z, Duhaz C, Buchereau A, Tuba Z (2003) “Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary” Journal of Plant Physiology, 160:395– 401 68 Nguyen HT, Babu RCBlum, A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular genetics considerations” Crop Sciences, 37: 1426-1434 69 Olhoft PM, Lin K, Galbraith J, Nielsen NC, Somers DA (2001), “The role of thiol compound in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells” Plant Cell Reports, 20: 731-737 70 Olhoft PM (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primarynode explants from seedlings” In vitro Cellular Developmental BiologyPlant 43: 536-549 71 Olhoft PM, Somers DA (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells” Plant Cell Reports, 20: 706-711 72 Paz1 MM, Shou H, Guo Z, Zhang Z, Banerjee AK, Wang K (2006), “Impoved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for effcicent Agrobacterium-mediated soybean transformation” Plant Cell Reports 25: 206 -213 73 Peng Z, Lu Q, Verma DPS (1996) Reciprocal regulation of D1- pyrroline5-carboxylate synthetase and prolinee dehydrogenase genes control levels during and after osmotic stress in plants Mol Gen Genet, 253: 334–341 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 112 http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 Porcel R, azconR, Ruiz- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativaplants” Journal of Experimental Botany, 56(417):1933-42 75 Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean” Journal of Plant Nutrition, 19: 969-993 76 Ren-Gao X, Hong-Feng X, Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells” Biotechnology Letters, 28: 1551-1557 77 Riederer M, Schreiber L (2001) “Protecting against water loss: Analysis of the barrier properties of plant cuticles” Journal of Experimental Botany, 52: 2023-2032 78 SabehatA, LurieS, Weiss D (1998) Expression of small heat shock proteins at low temperatures Plant Physiology, 117:651–658 79 Sairam RV, Franklin G, Hassel R, Smith B, Meeker K N K, Parani M, Abed DA, Ismail S, Berry K, Goldman SL (2003),” A study on the effect of genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75: 79-85 80 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 81 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol 1, 2, and Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 82 Samoylov VM, Tucker DM, Thibaud-Nissen F, Parrott WA (1998), “A liquid-medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures” Plant Cell Reports, 18: 49-54 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 113 http://www.lrc-tnu.edu.vn 83 Satoh R, Nakashima K, Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2002) “ACTCAT, a novel cis-acting element for proline-and hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding proline dehydrogenase in Arabidopsis” Plant Physiology, 130, 709–719 84 Shinozaki K, Yamamguchi-Shinozaki K (2007), “Gene expression and signal transduction in water-stress response” Plant Physiology, 115: 327334 85 Sinclair TR, Ludlow MM (1986) “Influence of soil water supply on the plant water balance of four tropical grain legumes” Journal of Plant Physiology, 13: 329-341 86 Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007) “Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved symbiotic N fixation” Field Crops Research 101: 68-71 87 Specht JE, Williams JH (1985) Breeding for drought and heat resistance: Prerequisites and examples In: World Soybean Research Conference III Proceedings Edited by Shibles, R pp.468–475 Westview Press, Boulder, Colarado 88 Sun XH, Chen MJ (2002) “A brief account of promoter cloning” Acta Edulis Fungi 9(3): 57-62 89 Szabados L, AouldSavoure (2009) “Proline: a multifunctional amino acid” Trends in Plant Science 15 (2): 89-97 90 Szekely G, Abraham E, Cseplo A, Rigo G, Zsigmond L, Csiszar J, Ayaydin F, Strizhov N, Jasik J, Schmelzer E (2008): “Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis” Plant Journal, 53(1):11-28 91 Tae-Seok K and Korban SS (2004), “Enhancing the frequency of somatic embryogenesis following Agrobacterium-mediated transformation of immature cotyledons of soybean [ Glycine max(L.) Merrill.]” In vitro Cellular Developmental Biology-Plant 40: p 552-558 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 114 http://www.lrc-tnu.edu.vn 92 Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) “Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray” Plant Physiology, 135:1697–1709 93 Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of soybeans” Z Acker-und Pflanzenbau Bd 146 94 Thomashow MF (1998) Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance Plant Physiology, 118:1–7 95 Topping JF (1988), Tobacco transformation Methods of Molecular Biology, 81: 365 96 Turner NC, Wright GC, Siddique KHM (2001) “Adaptation of grain legumes (pulses) to water limited environments” Advances in Agronomy 71: 193-23 97 Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene expression in Arabidopsis thaliana Proceeding of National Academy of Sciences, 101 (49):17306-17311 98 Valliyodan B and Nguyen HT (2006) “Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants” Current Opinion in Plant Biology 9: 189 99 Vierling E, Kimpe JA (1992) Plant responses to environmental stress Current Opinion in Biotechnology, 3: 164–170 100 Wu Y ZH, Que YX, Chen RK, Zhang MQ (2008) “Cloning and identification of promoter rd29A and its application in sugarcane drought resistance” Sugar Technology Reviews.10(1): 36-41 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 115 http://www.lrc-tnu.edu.vn 101 Xu Q, Wen XP and Deng XX (2004) “A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and PCR analyses” Plant Molecular Biology Reporter, 22: 301a-301g 102 Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1993) “The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22, a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana” Mol.Gen.Genet 2: p 17-25 103 Zhang CS, Lu Q, Verma DPS (1995) “Removal of feedback inhibition of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzymee catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants” Journal of Biological Chemistry, 270: 20491–20496 104 Zhang C-S, Lu Q, Verma DPS (1997) “Characterization of 1 – pyrroline 5-carboxylate synthase gene promoter in transgenic Arabidopsis thalilana subjected to water stress” Plant Science 129 : 81-89 105 Zhang N, Si HJ, and Wang D (2005), “Cloning of rd29A gene promoter from Arabidopsis thaliana and its application in stress-resistance transgenic potato” Acta Agronomica Sinica 31(2): 159-164 Tài liệu trang Web 106 .http://www.gso.gov.vn 107 http://faostat.fao.org 108.http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Promoter Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 116 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 117 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... cứu chuyển gen chịu hạn vào đậu tƣơng chƣa đƣợc quan tâm mức Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: ? ?Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm. .. chế phản hồi proline 2.2 Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn đậu tƣơng 2.3 Tạo đậu tƣơng mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn Nội dung nghiên cứu... 3.2 PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƢỢC 59 3.2.1 Kết phân lập gen P5CS 59 3.2.2 Kết khuếch đại, tách dịng xác định trình tự gen P5CS 60 3.2.3 Tạo đột biến điểm