MỞ ĐẦU Rượu vang là đồ uống được ưa chuộng và phổ biến trên khắp thế giới. Bởi vậy, ngành công nghiệp sản xuất rượu vang cũng là ngành đem lại doanh thu hàng tỷ đô và hàng triệu việc làm cho người dân. Trong sản xuất rượu vang, một chai rượu vang thành phẩm được đưa ra thị trường không chỉ phải trải qua quá trình sản xuất tỉ mỉ, công phu mà còn phải đáp ứng được yêu cầu khắt khe về hương vị cũng như độ an toàn của sản phẩm. Một trong những yếu tố cần lưu ý đến trong quá trình sản xuất cũng như trong rượu vang thành phẩm là hàm lượng axit hữu cơ có trong rượu. Các axit hữu cơ không chỉ góp phần tạo nên hương vị đặc trưng của từng loại rượu mà còn có một số công dụng tốt đối với sức khỏe con người như chống oxi hóa, chống viêm, bảo vệ cơ tim... Tuy nhiên, nồng độ axit quá cao sẽ gây ra vị chua, làm mất hương vị và làm hỏng rượu. Rượu vang tại mỗi vùng sản xuất có hàm lượng thành phần các chất khác nhau. Điều này do sự khác biệt về nguyên liệu và quy trình sản xuất đặc trưng cho từng vùng. Do đó, việc phân tích hàm lượng các axit hữu cơ trong rượu vang là cần thiết để lựa chọn vùng nguyên liệu để sản xuất rượu vang; theo dõi, kiểm soát nồng độ các axit trong suốt quá trình sản xuất và đánh giá chất lượng rượu vang thành phẩm. Hiện nay, một số phương pháp phân tích các axit hữu cơ trong rượu vang được khuyến nghị bởi Tổ chức Nho và Rượu vang Thế giới (International Organization of Vine and Wine (OIV, Paris, Pháp)) bao gồm: sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí (GC)... Những phương pháp này có khả năng phân tích một cách nhanh chóng và chính xác thành phần của rượu vang. Tuy nhiên các phương pháp này còn tồn tại một số hạn chế như sử dụng phức tạp, chi phí mua sắm và vận hành thiết bị cao, thời gian phân tích kéo dài. Một số phương pháp đơn giản hơn đã được phát triển để rút ngắn thời gian và giảm giá thành phân tích như sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng và bộ kit enzyme hay cảm biến sinh học (biosensor). Tuy vậy, những bộ dụng cụ này thường chỉ xác định một số giới hạn thành phần axit như các axit malic, citric, axetic, lactic và succinic; và chỉ cung cấp thông tin bán định lượng về hàm lượng của các axit này. Trong đó, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CEC4D) nổi bật hơn cả, bởi vì phương pháp này có những ưu điểm như vận hành đơn giản, thiết kế nhỏ gọn, có khả năng phân tích đồng thời các chỉ tiêu, có giới hạn phát hiện thấp và độ chính xác cao, đặc biệt là chi phí thấp hơn so với các phương pháp khác nên nó có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong phân tích rượu vang. Với những lý do trên, đề tài “Đánh giá hàm lượng các axit hữu cơ trong một số loại rượu vang và mối liên quan với quy trình sản xuất, nguồn gốc nguyên liệu” đã được tiến hành. Mục tiêu của nghiên cứu: 1. Xây dựng quy trình phân tích xác định các axit hữu cơ mạch ngắn có mặt trong quá trình lên men sản xuất rượu vang và trong rượu nho thành phẩm. 2. Đánh giá mối liên quan giữa hàm lượng các axit hữu cơ mạch ngắn có trong các loại rượu nho khác nhau với điều kiện môi trường trồng nho. Nội dung nghiên cứu gồm: Để đạt được các mục tiêu đã nêu, nội dung nghiên cứu cần thực hiện là: 1. Xây dựng quy trình phân tích: nghiên cứu, khảo sát điều kiện tối ưu để phân tích xác định đồng thời hàm lượng các axit tartaric, malic, succinic, citric, axetic, lactic, ascorbic bằng phương pháp CEC4D. 2. Theo quy trình phân tích đã phát triển, áp dụng phân tích hàm lượng các axit hữu cơ mạch ngắn trong một số mẫu rượu vang bán thành phẩm được sản xuất bằng các quy trình sản xuất khác nhau và các mẫu rượu vang thành phẩm đang được bày bán trên thị trường Đánh giá mối liên quan giữa hàm lượng các axit hữu cơ mạch ngắn với quy trình sản xuất. Đánh giá mối liên quan giữa hàm lượng các axit hữu cơ mạch ngắn với điều kiện môi trường tại vùng nguyên liệu.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN QUANG HIẾU ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC AXIT HỮU CƠ TRONG MỘT SỐ LOẠI RƯỢU VANG VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI QUY TRÌNH SẢN XUẤT, NGUỒN NGUYÊN LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN QUANG HIẾU ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC AXIT HỮU CƠ TRONG MỘT SỐ LOẠI RƯỢU VANG VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI QUY TRÌNH SẢN XUẤT, NGUỒN NGUYÊN LIỆU Chuyên ngành: Kĩ thuật Môi trường Mã số: 8520320.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS Phạm Hùng Đỗ Quang Việt PGS.TS Huy Hà Nội – 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Giáo viên hướng dẫn GS.TS Phạm Hùng Việt PGS.TS Đỗ Quang Huy, giảng viên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giao đề tài tận tình giúp đỡ, hướng dẫn chi tiết cho em suốt trình thực luận văn Trân trọng cảm ơn đề tài “Phân tích sàng lọc phân tích thẩm định an toàn thực phẩm sở phát triển ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản đa kênh sử dụng đồng thời hai cảm biến điện hóa đo quang: Ứng dụng thí điểm kiểm sốt số thực phẩm chức đồ uống có cồn dễ bị làm giả Việt Nam”; mã số 104.04-2016.50; Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ tạo điều kiện để em nghiên cứu hồn thiện luận văn Em xin cảm ơn tới Trung tâm Nghiên cứu Môi trường Phát triển bền vững – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên hỗ trợ cung cấp trang thiết bị nghiên cứu, đặc biệt anh chị nhóm Điện di mao quản giúp đỡ em nhiều suốt trình nghiên cứu thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Môi trường - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội tận tình giảng dạy, bảo, truyền đạt nguồn kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian em học tập trường Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ em trình làm luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Trần Quang Hiếu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rượu vang .3 1.1.1 Khái niệm rượu vang 1.1.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang 1.1.3 Phân loại rượu vang 1.1.4 Thành phần rượu vang 1.2 Các axit hữu mạch ngắn rượu vang 1.2.1 Giới thiệu chung axit hữu mạch ngắn rượu vang 1.2.2 Cấu tạo, tính chất vật lý, hóa học .8 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng axit hữu 1.2.3.1 Quy trình sản xuất 1.2.3.2 Các yếu tố môi trường vùng nguyên liệu sản xuất 14 1.2.4 Chỉ tiêu chất lượng rượu vang .15 1.3 Tổng quan số vùng sản xuất rượu vang 15 1.3.1 Tổng quan vùng sản xuất rượu vang Ninh Thuận 15 1.3.1.1 Điều kiện tự nhiên tỉnh Ninh Thuận 16 1.3.1.2 Điều kiện khí tượng, thủy văn .16 1.3.1.3 Đặc điểm địa chất, thổ nhưỡng 17 1.3.2 Tổng quan số vùng sản xuất rượu vang giới .18 1.4 Các phương pháp phân tích axit hữu mạch ngắn rượu vang 19 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng 19 1.4.2 Phương pháp sắc ký khí 20 1.4.3 Phương pháp điện di mao quản 21 1.5 Giới thiệu phương pháp điện di mao quản .23 1.5.1 Cấu tạo hệ điện di mao quản 24 1.5.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp điện di mao quản 25 1.5.2.1 Độ linh động điện di 25 1.5.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 25 1.5.2.3 Detector thường dùng phương pháp điện di mao quản 26 1.6 Yếu tố ảnh hưởng tới trình tách chất phương pháp điện di mao quản 27 1.6.1 Dung dịch điện li 27 1.6.2 Điện tách .27 1.6.3 Lượng mẫu vào mao quản .28 1.7 Các thông số đánh giá phương pháp điện di mao quản .28 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 29 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu .33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp thu thập tài liệu 33 2.2.2 Phương pháp phân tích thiết bị điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) .33 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 34 2.3 Hóa chất thiết bị .34 2.3.1 Hóa chất 34 2.3.2 Thiết bị 35 2.3.3 Chuẩn bị hóa chất 36 2.3.4 Chuẩn bị mao quản .36 2.3.5 Chuẩn bị mẫu 36 2.4 Khảo sát điều kiện phân tích CE 37 2.4.1 Khảo sát dung dịch điện ly 37 2.4.1.1 Khảo sát nồng độ Histidin 37 2.4.1.2 Khảo sát pH dung dịch 37 2.4.2 Khảo sát nồng độ CTAB .37 2.4.3 Khảo sát điện tách 38 2.5 Xác định thơng số đánh giá hiệu phương pháp phân tích 38 2.5.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 38 2.5.2 Độ xác phương pháp 38 2.5.3 Đường chuẩn .40 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .41 3.1 Kết khảo sát tối ưu điều kiện phân tích thiết bị CE-C4D 41 3.1.1 Kết khảo sát tối ưu nồng độ Histidin 41 3.1.2 Kết khảo sát tối ưu pH dung dịch điện ly 42 3.1.3 Kết khảo sát tối ưu nồng độ CTAB 43 3.1.4 Kết khảo sát tối ưu điện tách 44 3.2 Kết đánh giá phương pháp 45 3.2.1 Giới hạn phát giới hạn định lượng 45 3.2.2 Độ tái lặp độ lặp lại 46 3.2.3 Đánh giá độ phương pháp 46 3.2.4 Đường chuẩn .48 3.3 Áp dụng phân tích mẫu thực 53 3.3.1 Kết phân tích hàm lượng axit hữu 02 mẫu rượu vang bán thành phẩm .53 3.3.2 Mối liên quan hàm lượng axit hữu quy trình sản xuất 59 3.3.3 Kết phân tích hàm lượng axit hữu mẫu rượu vang sản xuất nước 60 3.3.4 Kết phân tích hàm lượng axit hữu mẫu rượu vang nhập 64 3.3.5 Mối liên quan hàm lượng axit hữu nguồn gốc nguyên liệu 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .71 KẾT LUẬN .71 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO .73 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tên viết tắt C4D CE Tên tiếng anh Tên tiếng việt Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết Capacitively coupled contactless nối kiểu tụ điện Điện di mao quản conductivity detector Capillary electrophoresis CTAB Cetyltrimetyl amoni bromua DAD Detector mảng diot Detector Diod Array EOF Dòng điện di thẩm thấu Electro - Osmotic Flow FID Detector ion hóa lửa Flame Ionization Detector GC Sắc ký khí Gas Chromatography His HPLC Histidin Sắc ký lỏng hiệu cao High Sắc ký lỏng Chromatography Liquid Chromatography LOD Giới hạn phát Limit of detection LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantitation LC MES Performance Axit (N - morpholino) etanesulfonic MS Detector khối phổ Mass Spectrometry RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn Standard Deviation SD TCVN UV Liquid Tiêu chuẩn Việt Nam Detector đo độ hấp thụ phân tử vùng Ultraviolet dectector tử ngoại DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng số axit hữu số loại rượu vang [25] Bảng 1.2 Một số thông tin chất phân tích .8 Bảng 1.3 Tổng hợp diện tích theo nhóm đất 18 Bảng 2.1 Thông tin mẫu nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Danh sách hóa chất cần sử dụng .34 Bảng 3.1 Điều kiện tối ưu cho phân tích phương pháp CE-C4D 45 Bảng 3.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng số axit hữu rượu vang phương pháp CE-C4D 45 Bảng 3.3 Độ lặp lại độ tái lặp theo độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic thời gian di chuyển 46 Bảng 3.4 Kết phân tích đánh giá độ phương pháp phân tích 47 Bảng 3.5 Bảng tóm tắt đường chuẩn axit hữu .48 Bảng 3.6 Kết phân tích hàm lượng axit hữu mẫu 1, mẫu 54 Bảng 3.7 Kết phân tích 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước 61 Bảng 3.8 Kết phân tích 04 mẫu sản phẩm rượu vang nhập .65 Bảng 3.9 Bảng tổng hợp số liệu phân tích axit hữu rượu vang vùng nguyên liệu .67 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Q trình trao đổi chất vi khuẩn lactic lên men dị hình [11] .12 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo thiết bị điện di mao quản (CE) 24 Hình 1.3 Tốc độ di chuyển anion tác dụng dịng EOF .26 Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo chung dectector C4D 27 Hình 2.1 Quy trình cơng nghệ sản xuất rượu vang sở sản xuất Phan Rang Ngọc Trúc 31 Hình 2.2 Hình ảnh thiết bị điện di mao quản sử dụng 35 Hình 3.1 Giản đồ điện di khảo sát ảnh hưởng nồng độ Histidin .41 Hình 3.2 Giản đồ điện di khảo sát tối ưu điều kiện pH dung dịch đệm điện di 42 Hình 3.3 Giản đồ điện di khảo sát tối ưu nồng độ CTAB .43 Hình 3.4 Giản đồ điện di khảo sát tối ưu điện tách 44 Hình 3.5 Giản đồ điện di đánh giá độ phương pháp phân tích 48 Hình 3.6 Đường chuẩn xác định nồng độ axit tartaric 49 Hình 3.7 Đường chuẩn xác định nồng độ axit malic 50 Hình 3.8 Đường chuẩn xác định nồng độ axit succinic 50 Hình 3.9 Đường chuẩn xác định nồng độ axit citric .51 Hình 3.10 Đường chuẩn xác định nồng độ axit axetic 51 Hình 3.11 Đường chuẩn xác định nồng độ axit lactic .52 Hình 3.12 Đường chuẩn xác định nồng độ axit ascorbic 52 Hình 3.13 Kết phân tích axit tartaric mẫu rượu vang đợt 56 Hình 3.14 Kết phân tích axit malic mẫu rượu vang đợt 57 Hình 3.15 Kết phân tích axit succinic mẫu rượu vang đợt .57 Hình 3.16 Kết phân tích axit citric mẫu rượu vang đợt 58 Hình 3.17 Kết phân tích axit axetic mẫu rượu vang đợt 58 Hình 3.18 Kết phân tích axit lactic mẫu rượu vang đợt 59 Hình 3.19 Hàm lượng axit malic 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước .62 Hình 3.20 Hàm lượng axit citric 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước .63 Nhận xét: Từ kết phân tích 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước sử dụng nguồn nguyên liệu nho Ninh Thuận, nhận thấy tất mẫu phát axit tartaric, axit malic, axit succinic, axit citric, axit axetic, axit lactic Về axit tartaric: Hàm lượng axit tartaric khoảng từ 416,8 –3882,5 mg/L Về axit malic: Hàm lượng axit malic khoảng từ 56,6 – 2131,7 mg/L Tại mẫu (rượu vang Phan Thiết) có hàm lượng axit malic cao (2131,7 mg/L) Kết sở sản xuất bổ sung thêm lượng axit malic trình sản xuất thời gian lên men ngắn, vi khuẩn lactic chưa tiến hành trình lên men malolactic Object 33 Hình 3.19 Hàm lượng axit malic 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước Về axit succinic: Hàm lượng axit succinic khoảng từ 383,5 – 1460,7 mg/L Về axit citric: Hàm lượng axit citric khoảng từ 91,8 – 3302,2 mg/L Tại mẫu 10 (rượu vang Venushill vị chát) có hàm lượng citric đặc biệt cao (3302,2 mg/L) Kết sở sản xuất bổ sung thêm lượng axit citric trình sản xuất xuất nấm mốc trình sản xuất 61 Object 35 Hình 3.20 Hàm lượng axit citric 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước Về axit axetic: Hàm lượng axit axetic khoảng từ 229,6 – 2591,5 mg/L Trong mẫu (mẫu 6, mẫu 9, mẫu 10) hàm lượng axit axetic vượt giới hạn cho phép độ axit dễ bay theo TCVN 7045:2013 rượu vang Bộ Khoa học cơng nghệ ban hành Trong đó, độ axit dễ bay tính theo axit axetic ≤ 20 tương đương hàm lượng axit axetic ≤ 1200 mg/L Rượu vang có mùi dấm chua, ảnh hưởng đến hương vị rượu Object 37 Hình 3.21 Hàm lượng axit axetic 08 mẫu sản phẩm rượu vang sản xuất nước 62 Về axit lactic: hàm lượng axit lactic khoảng từ 129,7 – 2521,8 mg/L Về axit ascorbic: 08 mẫu phân tích, phát axit ascorbic mẫu với hàm lượng 24,8 mg/L Kết hàm lượng axit ascorbic nguyên liệu nho làm rượu vang Thăng Long cao thời gian ủ men mẫu rượu so với mẫu lại Tổng hàm lượng axit hữu cơ: Mẫu có tổng hàm lượng axit hữu lớn Mẫu rượu vang Venushill đỏ bị chua có hàm lượng axit hữu lớn Object 39 Hình 3.22 Tổng hàm lượng axit hữu 08 mẫu sản phẩm sản xuất nước 3.3.4 Kết phân tích hàm lượng axit hữu mẫu rượu vang nhập Nghiên cứu tiến hành phân tích 04 mẫu sản phẩm rượu vang nhập (được sản xuất vùng nguyên liệu khác giới) nhằm xác định hàm lượng 07 axit hữu mạch ngắn cần nghiên cứu 63 Bảng 3.8 Kết phân tích 04 mẫu sản phẩm rượu vang nhập STT Code Rượu vang nhập Mẫu 11 (Vang Signus) Mẫu 12 (Vang Ventura) Mẫu 13 (Vang Bordeaux) Mẫu 14 (Vang Senorio De orgaz) *) Ghi chú: Axit Tartaric (mg/L) Axit Malic (mg/L) Axit Succinic (mg/L) Axit Citric (mg/L) Axit Axetic (mg/L) Axit Lactic (mg/L) Axit Ascorbic (mg/L) 2156,9 79,9 620,8 156,7 767,4 554,2