Nghiên cứu khả năng nhân giống keo lai bằng nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Thực tập tốt nghiệp bƣớc quan trọng trình học tập sinh viên nhằm hệ thống lại toàn kiến thức học, vân dụng vào thực tiễn làm quen với nghiên cứu khoa học Qua đó, sinh viên trƣờng hoàn thiện kiến thức lý luận phƣơng pháp nghiên cứu, lực làm việc nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn công việc sau Đƣợc giúp đỡ nhà trƣờng, thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, chúng tơi thực hồn thành đề tài với tiêu đề: “Nghiên cứu nhân giống Keo lai phương pháp ni cấy invitro” Trong q trình thực ngồi cố gắng thân bảo tận tình thầy, giáo Viện Cơng nghệ sinh học góp phần quan trọng đến thành công đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Hồng Vũ Thơ, Trƣởng Bộ mơn Chọn tạo giống, Viện CNSH Lâm nghiệp, tận tình hƣớng dẫn, quan tâm, bảo suốt trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn TS Nguyễn Văn Phong giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học để làm tiếp thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, giáo tồn thể anh chị làm việc Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp – trƣờng đại học Lâm nghiệp Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Giang Thanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Keo lai 1.2 Tình hình nghiên cứu keo nƣớc 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 1.3 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4 Cơ sở khoa học nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4.1 Tính tồn tế bào thực vật 1.5 Các giai đoạn ni cấy mơ tế bào thực vật 1.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 1.5.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động 1.5.3 Giai đoạn chồi nhân nhanh chồi 1.5.4 Giai đoạn tạo mơ hồn chỉnh 1.5.5.Giai đoạn chuyển in vitro vƣờn ƣơm 1.6.Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy mô – tế bào 1.6.1.Điều kiện vô trùng 1.6.2 Vật liệu nuôi cấy 10 1.6.3 Môi trƣờng nuôi cấy invitro 11 1.6.4 Các giai đoạn quy trình nhân giống invitro 16 1.6.5 Ý nghĩa kỹ thuật nhân giống invitro 17 CHƢƠNG MỤC TIÊU NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục Tiêu 19 Mục tiêu tổng quát 19 Cung cấp thông tin, sở khoa học góp phần hồn thiện quy trình nhân giống Keo lai kỹ thuật ni cấy in vitro 19 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Nội dung 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp luận 19 2.4.2 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 20 2.3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm 20 2.3.4.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến hiệu vào mẫu Keo lai 20 2.4.3.2 Ảnh hƣởng số chất điều hòa sinh trƣởng (BAP, Kinetin) đến khả nhân nhanh 21 2.4.3.3 Ảnh hƣởng số chất điều hòa sinh trƣởng (NAA IBA) đến khả nẵng rễ Keo lai 23 2.5 Phƣơng pháp đánh giá sử lý số liệu 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 26 3.2 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh Keo lai 28 3.2.1 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai 28 3.2.2 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 30 3.2.3 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 32 3.3 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai 35 3.3.1 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai 37 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Diễn giải BAP Benzylamino purine IBA Indol butyric acid NAA Naphthyl acetic acid MS Murashige & Skoog Medium MS* MS cải tiến CT Công thức ĐC Đối chứng HSNC Hệ số nhân chồi TB Trung bình W/w Khối lƣợng/thể tích V/v Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 21 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai 22 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 22 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nằng nhân nhanh chồi 23 Bảng 2.6 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai 23 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai 24 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 26 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai 28 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 30 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh 33 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai 35 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai 37 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 27 Hình 3.2 Tỷ lệ mẫu mẫu tái sinh theo thời gian khử trùng 28 Hình 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai 29 Hình 3.4 Chiều cao chồi hệ số nhân chồi theo nồng độ BAP 30 Hình 3.5 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 31 Hình 3.6 Chiều cao chồi hệ số nhân chồi theo nồng độ Kinetin 32 Hình 3.7 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh 34 Hình 3.8 Chiều cao chồi hệ số nhân chồi theo nồng độ BAP Kinetin 34 Hình 3.9 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai 36 Hình 3.10 Tỷ lệ rễ (trái) số rễ Tb/cây (phải) theo nồng độ IBA 36 Hình 3.11 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai 38 Hình 3.12 Tỷ lệ rễ (trái) số rễ Tb/cây (phải) theo nồng độ NAA 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Keo lai (Acacia hybrids) giống lai tự nhiên Keo tai tƣợng (Acacia mangium) Keo tràm (Acacia auriculifomis) đƣợc phát chọn lọc, nhân giống gây trồng năm gần Giống keo lai có nhiều ƣu điểm vƣợt trội lồi bố mẹ, tốc độ sinh trƣởng nhanh, suất cao, giá trị kinh tế lớn, chu kỳ dinh doanh ngắn, hiệu kinh tế cao cho ngƣời trồng rừng, khu vực duyên hải miền Trung hay vùng đồi núi khu vực phía Bắc nƣớc ta Hiện nay, gây trồng Keo lai cung cấp gỗ nguyên liệu giấy, dăm ván nhân tạo đƣợc doanh nghiệp trồng rừng, ngƣời dân quan tâm Diện tích trồng rừng keo lai lên đến hàng nghìn héc ta năm, kéo theo nhu cầu có chất lƣợng cao cho trồng rừng lớn Nhiều doanh nghiệp, nhà vƣờn sản xuất giống keo lai chủ yếu giâm hom Tuy nhiên hạn chế hom rễ cọc không phát triển, tán dày lớn làm cho bị đổ ngã, gây thiệt hại lớn cho doanh nghiệp ngƣời dân trồng rừng gặp bão to, gió lớn Tuy nhiên, sử dụng ni cấy in vitro lại khắc phục đƣợc, ni cấy mơ giúp hệ rễ cọc phát triển tốt hơn, thân cân đối giúp gia tăng phịng chống gió to, bão lớn Hơn nữa, vật liệu giống cho trồng vƣờn cấp hom đƣợc chuyên gia khuyến cáo sử dụng nuôi cấy mô thay sau chu kỳ khai thác cành hom Chính vậy, việc thực hoàn thành đề tài nghiên cứu với tiêu đầu: “Nghiên cứu nhân giống Keo lai phương pháp ni cấy invitro” cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Keo lai Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học : Thân, tán, : Cây gỗ cao đến 25-30 m, đƣờng kính 60-80 cm Thân gỗ trắng, tròn đều, tán phát triền cân đối, màu vàng trắn có vân, có giác lõi phân biệt Lá có 3-4 gân mặt hình mác Hoa, quả, hạt : Hoa lƣỡng tính mọc cụm, màu trắng vàng, mọc nách lá.Quả dẹt, non thẳng, già cộn hình xoắn ốc Mùa hoa tháng 3-4, chín tháng 7-8 Vỏ cứng, chín màu xám nứt Mỗi có 5-7 hạt màu nâu đen, bóng Một kg hạt có 45.000-50.000 hạt, thu đƣợc từ 3-4kg Cơng dụng : Gỗ nhỏ dùng làm nguyên liệu giấy, ván dăm, trụ mỏ, ván sợi úp, gỗ lớn ván dán, ván ép… Từ hạt nảy mầm tới tháng hình thái biến đổi theo giai đoạn mầm, thật giả Lá giả mọc cách tồn Chiều rồn hẹp chiều rộng keo tai tƣợng nhƣng lớn chiều rộng keo tràm Đặc điểm sinh lý, sinh thái : Tốc độ sinh trƣởng : Keo lai có tốc độ sinh trƣởng nhanh rõ rệt so với lồi Keo bố mẹ Với số dịng Keo lai đƣợc chọn lọc trồng thâm canh tuổi đạt trung bình 8,6-9,8m chiều cao, 9,8-11,4cm đƣờng kính, 19,4-27,2 m³/ha/năm lƣợng sinh trƣởng 50-77m³/ha sản lƣợng gỗ Rừng Keo lai 7-8 tuổi đạt 150-200m³ gỗ/ha, nhiều 1,5-2 lần rừng Keo tai tƣợng Keo tràm Keo lai có nhiều hạt có khả tái sinh tự nhiên hạt mạnh Cây có khả tái tạo đất, chống xói mịn, chống cháy rừng Gỗ thẳng có tác dụng nhiều mặt Phù hợp với ƣa sáng, chủ yếu đất xám, đất feralit Chịu đƣợc khô hạn, nhiệt độ trung bình Độ cao từ 500-800m so với mực nƣớc biển độ dốc thấp Cây Keo lai có gỗ thẳng, màu vàng trăng có vân, có giác lõi phân biệt Sản lƣợng khai thác gỗ 150-200m3/ha với chu kì 7-8 năm, nhiều 1,5-2 lần so với rừng keo tai tƣợng keo tràm Gỗ có tác dụng nhiều mặt: Gỗ có kích thƣớc nhỏ làm ngun liệu giấy, gỗ có kích thƣớc lớn đƣợc sử dụng xây dựng, đóng đồ mộc mỹ nghệ, hàng hóa xuất Là ƣa sáng, mọc nhanh, có khả cải tạo đất, chống xói mịn cháy rừng 1.2 Tình hình nghiên cứu keo ngồi nƣớc 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Những năm gần đây, việc sử dụng tiến kỹ thuật công nghệ tế bào thực bật công tác chọn giống rừng đƣợc thực nhiều nƣớc giới nhƣ: Thụy Điển Brazil, Úc , Trung Quốc… Nuôi cấy mô phân sinh keo lai đƣợc Darus tiến hành môi trƣờng Murashige Skooge (MS) có thêm benzyllamnimo Pyrine (BAP) 0,5mg/l cho rễ phòng thành công (Gamborg.O.L cs, 1995) Darus H Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia nuôi cấy mô tế bào keo tai tƣợng môi trƣờng MS có bổ sung 3% đƣờng; 0,6% thạch 0,4mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Nhiệt độ trình ni cấy trì 25oC(± 4oC), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả sử dụng muối Hypoclorite 4% khử trùng thời gian 20 phút (Sharma.J.K, 1994) Có thể nói phƣơng pháp nhân giống sinh dƣỡng cho lâm nghiệp đƣợc áp dụng quy mô lớn nhiều nƣớc giới, công cụ tối ƣu để nâng cao suốt rừng trồng chƣơng trình chọn giống cho rừng 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Ở Việt Nam nuôi cấy mô đƣợc phát triển từ năm 70 sở nhân giống nuôi cấy mô quy mô lớn nhƣ: Viện CNSH, Viện KHKT NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh, Phú Thọ, Trung tâm ứng dụng KHSX nơng lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, Nghiên cứu ứng dụng thành cơng cho số lồi trồng đặc biệt nông nghiệp cảnh (Lê Đình Khả cs, 2006) Keo lai đƣợc tìm thấy Ba Vì (Hà Nội), Thống Nhất (Đồng Nai), Sông Bé số tỉnh miền Trung nhƣ Quảng Nam – Đà Nẵng Khánh Hòa Từ năm 1993 đến nay, nƣớc ta việc chọn lọc, phát hiện, nhân giống khảo nghiệm giống thành công cho giống lai tự nhiên keo tai tƣợng keo tràm, gọi tắt Keo lai GS Lê Đình Khả chủ trì, mở triển vọng lớn cho trồng rừng nguyên liệu Keo lai có ƣu rõ rệt sinh trƣởng, ƣu thể đƣợc thể rõ rệt Ba Vì lẫn Đông Nam Bộ, nơi Keo lai sinh trƣởng nhan Keo tai tƣợng 1,5-1,6 lần chiều cao 1,64-1,98 lần đƣờng kính, so với keo tràm tuổi cho thấy, Keo lai sinh trƣởng nhanh Keo tràm 1,3 lần chiều cao 1,5 lần đƣờng kính Tháng năm 1995, Trần Cự, Nguyễn Đình Hải cơng bố kết chọn lọc trội Keo lai giâm hom thông tin khoa học kỹ thuật kinh tế lâm nghiệp Cũng thời gian này, Nguyễn Văn Chiến Lƣu Bá Thịnh tiến hành giâm hom từ chồi gốc trội Keo lai thu đƣợc kết cao Nếu hom đƣợc xử lý IBA tỉ lệ rễ đạt từ 80-90%, ứng dụng kết nghiên cứu này, trung tâm khoa học sản xuất lâm nghiệp Đông Nam Bộ sản xuất đƣợc 2000 Keo lai Năm 1997, Phạm Văn Tuấn nghiên cứu công bố kết trội nhân giống hom Keo lai Theo tác giả hom đƣợc lấy từ chồi gốc giai đoạn tháng tuổi có tỉ lệ cao (90%), hom đƣợc xử lý IBA dạng bột dạng dung dịch Tóm lại, từ năm 1993 đến Việt Nam có nhiều nghiên cứu Keo lai Từ nghiên cứu hình thái, chọc lọc trội, nhân giống hom nuôi cấy mô, khả cải tạo đất, tiềm bột giấy, Nuôi cấy mô nƣớc ta áp dụng rộng rãi công tác nhân giống 100.0 ,88.9 90.0 ,90.7 ,92.6 ,93.9 100.0 ,84.2 90.0 80.0 ,67.9 70.0 ,86.7 80.0 ,72.0 70.0 60.0 60.0 50.0 50.0 40.0 40.0 30.0 30.0 20.0 20.0 10.0 10.0 0.0 CT1 CT2 CT3 0.0 CT4 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.2 Tỷ lệ mẫu (trái) mẫu tái sinh (phải) theo thời gian khử trùng 3.2 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh Keo lai 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai BAP chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm Cytokinin, thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy in vitro BAP đƣợc sử dụng nghiên cứu tạo cụm chồi giai đoạn nhân nhanh Chồi thí nghiệm đƣợc cắt đƣa vào môi trƣờng nhân nhanh bổ sung BAP với nồng độ khác nhau, sau theo dõi khả nhân nhanh chồi vòng 30 ngày Kết nghiên cứu đƣợc thể Bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu TN CT1 ĐC CT2 CT3 CT4 CT5 CTTN Chiều cao chồi (cm) ̅ V% ̅ V% Trạng thái chồi 54 2,22 5,9 4,19 3,8 + 0,5 1,0 1,5 54 54 54 3,07 3,10 3,12 2,0 3,4 2,2 4,64 4,83 5,38 3,7 3,1 3,3 ++ ++ +++ 2,0 54 3,10 3,6 5,10 2,7 +++ Hệ số nhân (lần) Ghi chú: + chồi mảnh, yếu; ++ chồi gầy, nhỏ; +++ thân thấp, chồi mập, to; 28 Số liệu Bảng 3.2 Hình 3.3 cho thấy, chất ĐHST có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi, thƣờng sử dụng nồng độ khác thu đƣợc kết khác phụ thuộc vào đối tƣợng nuôi cấy Trong nghiên cứu này, bổ sung BAP vào MD cho kết tạo chồi tốt rõ rệt so với đối chứng Chẳng hạn, môi trƣờng CT1 (Đối chứng) hệ số nhân chồi thấp đạt 4,19 lần Trong cơng thức thí nghiệm có bổ sung BAP (CT2 CT3) cho hệ số nhân chồi lần lƣợt là: 4,64 - 4,83 lần, chiều cao chồi đạt lần lƣợt 3,07- 3,10 cm tƣơng ứng Khi tăng hàm lƣợng lên CT4 (1,5 mg BAP/l) hệ số nhân chồi đạt giá trị cao 5,38 lần Qua bảng số liệu ta thấy, tiếp tục tăng hàm lƣợng BAP lên 2,0 mg/l (CT5) hệ số nhân chồi giảm, đồng thời tiêu theo dõi khác giảm Nhƣ ta thấy hàm lƣợng BAP cao ức chế sinh trƣởng phát triển chồi,hàm lƣợng BAP cao kìm hãm phát triển quần thể chồi, chồi sinh trƣởng phát triển không bình thƣờng, sắc tố diệp lục Rõ ràng việc tìm nồng độ chất ĐHST phù hợp có ý nghĩa việc tăng tỷ lệ mẫu tái sinh chồi Keo lai Hình 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai Quan sát ta thấy, bổ sung BAP hàm lƣợng 1,5 mg/l chồi sinh trƣởng phát triển tốt, thân chồi mập, xanh hình thái khỏe khơng bổ sung BAP Vì vậy, nghiên cứu MD có bổ sung BAP 1,5 mg/l 29 môi trƣờng phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh Keo lai cm lần 3.50 3.07 3.10 3.12 6.00 3.10 3.00 2.50 5.00 2.22 5.38 4.64 4.83 5.10 4.19 4.00 2.00 3.00 1.50 1.00 2.00 0.50 1.00 0.00 ĐC 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l 0.00 ĐC BAP 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l BAP Hình 3.4 Chiều cao chồi (trái) hệ số nhân chồi theo nồng độ BAP Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng BAP đến tỷ lệ tái sinh trồi tiêu F cho thấy, FTính (=138,15) > F0,5 (=5,98) cho thấy việc bổ sung BAP có ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ tái sinh chồi 3.2.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai, mẫu thí nghiệm đƣợc đƣa vào mơi trƣờng có hàm lƣợng Kinetin khác sau 30 ngày theo dõi, kết đƣợc thể Bảng 3.3 dƣới đây: Bảng 3.3 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 54 54 Chiều cao chồi (cm) ̅ V% 1,17 5,2 1,20 2,6 Hệ số nhân (lần) ̅ V% 2,30 6,8 3,20 14,4 1,0 54 1,24 3,6 4,30 3,3 +++ CT4 1,5 54 1,23 29,0 3,20 10,2 +++ CT5 2,0 54 1.21 2,9 2,20 8,3 +++ CTTN Nồng độ Kinetin (mg/l) Số mẫu TN CT1 CT2 ĐC 0,5 CT3 Trạng thái chồi + ++ Ghi chú: + chồi mảnh, yếu; ++ chồi gầy, nhỏ; +++ thân thấp, chồi mập, to; 30 Ở CT1 (ĐC) không bổ sung Kinetin thu đƣợc hệ số nhân chồi 2,3 lần chiều cao chồi đạt 1,17 cm Bổ sung Kinetin (1,0 mg/l) cho hiệu tốt CT3 thu đƣợc hệ số nhân chiều cao chồi lần lƣợt 4,30 lần 1,24 cm tƣơng ứng Tuy nhiên, hàm lƣợng tăng lên CT4-CT5 (1.5-2,0 mg/l) kết nhân chồi giảm dần, với kết chiều cao TB 1,23-1,21 cm hệ số nhân 3,20-2,20 lần Nhìn chung mơi trƣờng đƣợc bổ sung Kinetin cho hiệu tạo cụm chồi tốt so với đối chứng Hình 3.5 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai Qua quan sát thấy việc bổ sung Kinetin vào môi trƣờng để nhân chồi cho chất lƣợng chồi tốt hơn, thân mập, xanh nhiên số chồi, hệ số nhân chồi lại thấp so với công thức tốt bổ sung BAP Do đó, việc bổ sung Kinetin có tác dụng làm tăng chất lƣợng chồi mơi trƣờng có bổ sung Kinetin 1,0 mg/l môi trƣờng phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh Keo lai Tuy nhiên hiệu tiêu theo dõi lại giảm so với công thức BAP tốt Nhƣ vậy, đánh giá khả nhân nhanh dƣới tác dụng riêng rẽ BAP Kinetin cơng thức cho hiệu nhân nhanh tốt với Keo lai BAP 1,5 mg/l Qua nghiên cứu cho thấy việc sử dụng BAP cho hiệu nhân nhanh tốt, mập, khỏe, xanh phát triển tốt Vì vậy, so với Kinetin, BAP thích hợp nhân nhanh Keo lai 31 Hệ số nhân chồi Chiều cao chồi cm 1.26 1.24 1.24 1.22 lần 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 1.23 1.21 1.20 1.20 1.18 1.17 1.16 1.14 1.12 ĐC 4.30 3.20 2.30 ĐC 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l 3.20 2.20 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l Kinetin Kinetin Hình 3.6 Chiều cao chồi (trái) hệ số nhân chồi theo nồng độ Kinetin Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng Kinetin đến tỷ lệ tái sinh trồi tiêu F cho thấy, F Tính (=21,84) > F0,5 (=5,89) cho thấy việc bổ sung Kinetin có ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ tái sinh chồi Nhƣ vậy, lần cho thấy, kinetin chất điều hịa sinh trƣởng thích hợp cho khả xúc tiến bật chồi keo lai trình ni cấy in vitro 3.2.3 Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai Trong ni cấy in vitro, dị tìm mơi trƣờng nhân tạo phù hợp với nhu cầu dinh dƣỡng đối tƣợng nuôi cấy cần thiết, tất nhiên tùy thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng, phát triển điều kiện cụ thể, hormone đóng vai trị quan trọng Trong số loại hormone thƣờng sử dụng ni cấy in vitro, BAP KT (Kinetin) đƣợc sử dụng rộng rãi phổ biến Kết thu đƣợc sử dụng loại hormone cho nhân nhanh Keo lai đƣợc tổng hợp Bảng 3.4 dƣới đây: 32 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh Nồng Nồng độ độ CTTN Kinetin BAP (mg/l) (mg/l) Số mẫu TN Chiều cao chồi (cm) Hệ số nhân (lần) ̅ V% ̅ V% Trạng thái chồi CT1 ĐC ĐC 54 1.07 6,0 5,9 6,5 + CT2 0,5 1,0 54 1,16 3,5 3,5 11,8 ++ CT3 1,0 1,0 54 1,19 6,0 4,9 4,0 ++ CT4 1,5 1,0 54 1,80 4,7 4,3 10,0 +++ CT5 2,0 1,0 54 1,22 4,6 3,8 9,9 +++ Ghi chú: + chồi mảnh, yếu; ++ chồi gầy, nhỏ; +++ thân thấp, chồi mập, to; Qua Bảng 3.4 cho thấy, ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả bật chồi Keo lai rõ rệt, có xu hƣớng tăng dần theo nồng độ BAP Khi môi trƣờng bổ sung BAP Kinetin cho hiệu tạo cụm chồi tốt so với đối chứng Kết cho thấy môi trƣờng bổ sung Kinetin vào công thức BAP tốt thấy tiêu theo dõi có thay đổi Hệ số nhân chồi công thức bổ sung Kinetin thấp so với đối chứng Tƣơng tự nhƣ trên, với công thức CT1 (ĐC) không bổ sung Kintin thu đƣợc 5,9 lần Khi bổ sung thêm hàm lƣợng Kinetin, CT3 cho hệ số nhân nhanh cao đạt 4,9 lần chiều cao chồi đạt 1,19 cm Kết tốt thu đƣợc CT4 (1,0 mg/l) với số thay đổi là: 4,3 lần; 1,80 cm Hệ số nhân chồi giảm so với công thức BAP tốt nhất, nhiên chiều cao chồi lại đƣợc cải thiện đáng kể, kết cần lƣu ý 33 Hình 3.7 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh Về mặt hình thái, sử dụng kết hợp BAP, IBA làm cho chất lƣợng chồi tốt hơn, thân mập, xanh so với sử dụng riêng rẽ BAP Tuy nhiên tăng tiếp nồng độ BAP lên 2,0 mg/L, tỷ lệ bật chồi có xu hƣớng giảm Tóm lại, nhân nhanh Keo lai phƣơng pháp nuôi cấy in vitro sử dụng môi trƣờng MS, bổ sung BAP KT nồng độ 1,5 1,0 mg/L tƣơng ứng (CT4) cho hệ số nhân chồi (4,3 lần) chiều cao TB chồi (1,80 cm) cao so với cơng thức khác điều kiện Hay nói cách khác, CT4 mơi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh Ngoài ra, chồi sinh trƣởng xanh tốt, mập khỏe mạnh 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 1.80 1.07 1.16 1.22 1.19 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT1 Chiều cao TB chồi CT2 CT3 CT4 CT5 Hệ số nhân chồi Hình 3.8 Chiều cao chồi hệ số nhân chồi theo nồng độ BAP Kinetin 34 Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng BAP Kinetin đến tỷ lệ tái sinh trồi tiêu F cho thấy, FTính (=243,39) > F0,5 (=3,70) cho thấy việc bổ sung BAP Kinetin có ảnh hƣởng đến tỷ tái sinh chồi 3.3 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai Thúc rễ tạo hoàn chỉnh bƣớc cuối quan trọng, với huấn luyện, chăm sóc đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn cần thiết để hồn thiện quy trình nhân giống in vitro cho loài Keo lai Trong nghiên cứu này, mẫu giai đoạn nhân nhanh đƣợc chuyển sang giai đoạn rễ để tạo hoàn chỉnh Chồi Keo lai dễ rễ môi trƣờng nuôi cấy in vitro, nhiên chất lƣợng rễ khơng đảm bảo Vì vậy, việc nghiên cứu bổ sung Auxin cần thiết IBA chất kích thích rễ thƣờng sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật Đề tài thực nghiên cứu ảnh hƣởng IBA nồng độ khác Sau 30 ngày theo dõi, kết đƣợc trình bày Bảng 3.6 dƣới đây: Bảng 3.6 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai Nồng độ IBA (mg/l) Số mẫu TN CT1 ĐC CT2 Tỷ lệ rễ (%) Số rễ TB/cây (rễ) ̅ V% ̅ V% Trạng thái rễ 54 87,0 19,5 1,97 2,6 + 0,2 54 88,9 7,5 2,76 6,4 ++ CT3 0,5 54 90,7 5,4 3,83 10,8 ++ CT4 0,8 54 92,6 3,5 4,66 2,1 +++ CT5 1,0 54 96,3 1,9 5,77 5,5 +++ CTTN Ghi chú: +++: Trạng thái rễ tốt (Rễ dài, mập nhiều rễ phụ) ++: Trạng thái rễ (Rễ dài, mảnh nhiều rễ phụ) +: Trạng thái rễ (Rễ ngắn, mảnh, rễ phụ) 35 Hình 3.9 Ảnh hƣởng IBA đến khả rễ Keo lai Qua Bảng 3.6 Hình 3.9 mơi trƣờng bổ sung IBA tỷ lệ rễ tăng lên rõ rệt so với công thức đối chứng Các chồi Keo lai tƣơng đối rễ, không cần sử dụng Auxin đạt tỷ lệ 87,0% Khi tăng hàm lƣợng IBA tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình tăng.Công thức cho tỷ lệ rễ cao dịng Keo lai cơng thức sử dụng IBA với hàm lƣợng 1,0 mg/l cho tỷ lệ rễ, số rễ trung bình lần lƣợt là: 96,3%; 5,77 rễ số rễ/cây Tỷ lệ (%) 98.0 7.00 ,96.3 94.0 ,90.7 90.0 4.66 5.00 ,92.6 92.0 88.0 5.77 6.00 96.0 3.83 4.00 ,88.9 2.76 3.00 ,87.0 2.00 86.0 1.97 1.00 84.0 82.0 0.00 ĐC 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l ĐC IBA 0,5 mg/l 1,0 mg/l 1,5 mg/l 2,0 mg/l IBA Hình 3.10 Tỷ lệ rễ (trái) số rễ Tb/cây (phải) theo nồng độ IBA 36 Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng IBA đến tỷ lệ rễ tiêu F cho thấy, FTính (=2534,13) > F0,5 (=5,31) cho thấy việc bổ sung IBA có ảnh hƣởng đến khả rễ keo lai 3.3.1 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai Các chồi đủ tiêu chuẩn giai đoạn nhân nhanh đƣợc tách riêng chồi chuyển sang mơi trƣờng có bổ sung NAA Sau 30 ngày nuôi cấy Kết tiêu theo dõi tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình mẫu chất lƣợng rễ đƣợc tổng hợp Bảng 3.7 dƣới đây: Bảng 3.7 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu TN CT1 ĐC CT2 Tỷ lệ rễ (%) Số rễ TB/cây (rễ) ̅ V% ̅ V% Trạng thái chồi 54 87,7 9,5 1,94 17,6 + 0,2 54 90,7 4,1 2,72 0,7 ++ CT3 0,5 54 91,4 11,5 3,82 8,8 ++ CT4 0,8 54 92,6 3,5 4,80 8,8 +++ CT5 1,0 54 98,8 1,1 5,60 4,4 +++ CTTN Ghi chú: +++: Trạng thái rễ tốt (Rễ dài, mập nhiều rễ phụ) ++: Trạng thái rễ (Rễ dài, mảnh nhiều rễ phụ) +: Trạng thái rễ (Rễ ngắn, mảnh, rễ phụ) Tƣơng tự IBA, NAA có tác dụng việc thúc đẩy khả rễ dòng Keo lai Qua bảng trên, môi trƣờng bổ sung NAA cho hiệu tạo cụm chồi tốt so với đối chứng Ở công thức NAA cho kết tốt CT5 (1,0 mg/l) với tiêu lần lƣợt tăng so với đối chứng tỷ lệ rễ 98,8% số rễ TB/cây 4,4% Từ thí nghiệm trên, ta thấy hàm lƣợng NAA tốt để kích thích rễ dịng Keo lai 1,0 mg/l (CT5) 37 Hình 3.11 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Keo lai Nhƣ vậy, đánh giá khả rễ dƣới tác dụng riêng rễ hai loại Auxin NAA, IBA cơng thức cho hiệu rễ tốt IBA 1,0 mg/l Qua quan sát ta thấy việc sử dụng IBA cho hiệu rễ tƣơng đối tốt, rễ khỏe, phát triển tốt dòng Keo lai Nhƣ vậy, so với NAA, IBA thích hợp vai trị kích thích tạo rễ Số rễ TB/cây Tỷ lệ (%) 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 86.0 84.0 82.0 98.8 5.60 6.00 4.82 5.00 90.7 91.4 92.6 3.82 4.00 2.72 3.00 87.7 2.00 1.94 1.00 0.00 ĐC ĐC 0,2 mg/l 0,5 mg/l 0,8 mg/l 1,0 mg/l 0,2 mg/l 0,5 mg/l 0,8 mg/l 1,0 mg/l IBA IBA Hình 3.12 Tỷ lệ rễ (trái) số rễ Tb/cây (phải) theo nồng độ NAA Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng NAA đến tỷ lệ rễ tiêu F cho thấy, FTính (=2083,48) > Ftra bảng (=5,99) cho thấy việc bổ sung NAA có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả rễ keo lai 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ tất nghiên cứu đạt đƣợc phần nêu đến số kết luận sau: Khử trùng HgCl2 0,1% tạo mẫu keo lai tốt thời gian phút, chia 2, lần đầu phút lần sau phút, cho tỉ lệ mẫu mẫu tái sinh chồi đạt 90,7 93,9% tƣơng ứng Môi trƣờng có bổ sung BAP 1,5 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt trị số cao 5,38 lần, chồi sinh trƣởng phát triển tốt, thân chồi mập, xanh chồi khỏe mạnh Môi trƣờng có bổ sung Kinetin 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt trị số cao 4,30 lần, chồi sinh trƣởng phát triển tốt, thân chồi mập, xanh chồi khỏe mạnh Môi trƣờng nhân nhanh bổ sung BAP Kinetin nồng độ lần lƣợt 1,5 1,0 mg/l tƣơng ứng, cho hệ số nhân chồi (4,3 lần) chiều cao chồi trung bình đạt 1,80 cm, chồi sinh trƣởng xanh tốt, mập khỏe mạnh, mơi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh Công thức sử dụng IBA với nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ rễ, số rễ trung bình đạt lần lƣợt 96,3% 5,77 rễ tƣơng ứng, khỏe mạnh, phát triển cân đối, xanh tốt Công thức sử dụng NAA với nồng độ 1,0 mg/l cho kết tốt với tỷ lệ rễ 98,8%, số rễ TB/cây 4,4%, khỏe mạnh,phát triển tốt, phù hợp cho thúc rễ tạo hoàn chỉnh Keo lai 4.2 Tồn kiến nghị Cần tiến hành nghiên cứu thêm môi trƣờng nhân chồi rễ thích hợp cho dịng Keo lai, thử nghiệm với Cytokinin, Auxin khác đánh giá kết hợp chất điều hòa sinh trƣởng để tìm mơi trƣờng thích hợp 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài Liệu Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình Công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Phong, Phạm Thanh Hà, Vũ Thị Phƣơng Thảo, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Việt Hà, Phan Thị Thu Hiền (2015), Nhân giống in vitro Giảo Cổ Lam bảy lá, Tạp chí NNPTNT, tháng 12/2015, tr.254-260 Đặng Ngọc Hùng (2009), Ngiên cứu nhân bạch đàn giống dòng lai UE35 UE56 Eucalyptuep urophyla E exserta phương pháp nuôi cấy mô, Báo cáo đề tài Thạc sỹ, trƣờng đại học Nông Lâm, Thái Nguyên Lê Đình Khả (1999), Ngiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên Keo tai tượng Keo tràm Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp Lê Đình Khả (2006), Lai giống rừng, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội Lê Đình Khả, Dƣơng Mộng Hùng (2003), Giống rừng, Nxb Nơng Nghiệp Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Hồ Quang Vinh (1997), Kết khảo nghiệm giống lai tự nhiên Keo tai tượng Keo tràm, Tạp chí Lâm Nghiệp Lê Đình Khả, Nguyễn Hồng Nghĩa, Nguyễn Xn Liệu (2006), Cẩm nang nghành lâm nghiệp chƣơng Cải thiện giống quản lý giống rừng Việt Nam, Bộ Nông nghiệp PTNT, Chƣơng trình Hỗ trợ Ngành Lâm nghiệp Đối tác 10 Hoàng Vũ Thơ, “Nghiên cứu nhân giống Đinh đũa (Stereospermum colais) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn số 6-2016 11 Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh 12 Trần Thị Lệ, Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Đức Lƣơng, Phan Thanh Trúc, Lƣơng Văn Hinh, Trấn Văn Điền (1999) Giáo trình Chọn tạo giống trồng, Nxb Nơng nghiệp 14 Đồn Thị Mai, Lê Sơn (2011), Kết khoa học công nghệ đề tài Nghiên cứu nhân nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn uro, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) Lát hoa công nghệ tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Giống rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 15 Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh Hƣơng, Văn Thu Huyền (2009), Nuôi cấy mô số giống Keo lai chọn tạo, Trung tâm nghiên cứu giống rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 16 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý học thực vật, Nxb Hà Nội 17 Phan Hữu Tôn (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục cụ công tác giống trồng, Nxb Nông Nghiệp 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học,tập 2- Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo Dục 20 Le Dinh Kha 2001 Studies on the use of natural hybrids between A mangium and A auriculifomis in Vietnam Hanoi, Agriculture Publising House II.Tài Liệu Tiếng Anh 21 Trindate H., J G Ferreira, M S Pais, R Aloni (1990), The role of cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globulus grownln vitro, Australian Forestry 22 Sharma J.K (1994), Patbological investigations in Forest Nurseries and plantations in Vietnam, Report of Food and Agriculture organization of the United Nations, FAO VIE/92,022: Hanoi ... đến khả nhân nhanh Keo lai 28 3.2.1 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh Keo lai 28 3.2.2 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai 30 3.2.3 Ảnh hƣởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai. .. nghiên cứu Keo lai Từ nghiên cứu hình thái, chọc lọc trội, nhân giống hom nuôi cấy mô, khả cải tạo đất, tiềm bột giấy, Nuôi cấy mô nƣớc ta áp dụng rộng rãi công tác nhân giống số giống Keo lai. .. tái sinh chồi 3.2.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng kinetin đến khả nhân nhanh Keo lai, mẫu thí nghiệm đƣợc đƣa vào mơi trƣờng có hàm lƣợng Kinetin