Nghiên cứu khả năng nhân giống chanh leo (passiflora edulis) bằng nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Trƣớ ti n, ho ph p m ƣ y tỏ lòng biết ơn sâu sắ ặc biệt ến Thầy giáo PGS.TS Ho ng Vũ Thơ, Trƣởng Bộ mơn Chọn tạo giống, ã tận tình giúp ỡ, h n, ốc thúc v nh hƣớng qu n trọng cho thực hồn thành ề tài khóa luận tốt nghiệp Cho ph p m ƣ c bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, cô giáo Bộ môn Chọn tạo giống, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ũng nhƣ thầy, cô Hội ồng chấm KLTN với tinh thần trách nhiệm o ể hoàn thành chấm khóa luận tốt nghiệp với ti u ề: ―Bƣớc đầu nghiên cứu khả nhân giống Chanh Leo (Passiflora edulis) kỹ thuật nuôi cấy in vitro‖ Em ũng xin hân th nh ảm ơn nghiệm, Vƣờn ƣơm ủ bộ, nhân vi n ô giáo, thầy giáo phịng thí ơn v thuộc Viện CNSH Lâm nghiệp, nhiều cán ã giúp việc thu thập m u thí nghiệm, thu thập thơng tin, số liệu tài liệu liên quan tới ề tài khóa luận, tạo thuận l i giúp em ho n th nh ề tài khóa luận Nhân p n y, ho ph p m ƣ biết ơn sâu sắ tới qu n tâm v giúp ỡ qu Cuối ng, m ũng xin ƣ bạn sinh viên, anh ch áu y tỏ lòng gửi lời cảm ơn hân th nh tới tất bạn bè, i trƣớc ngƣời thân yêu gia ã giúp ỡ nhiệt t nh, ổ vũ t h ự v nh, ộng vi n tinh thần k p thời, g p phần không nhỏ giúp m ho n th nh ề tài khóa luận n y úng tiến ộ v lƣ ng tốt nhất./ Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Vi Thị Yến ạt hất MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro 1.1.3 Cá iều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.4 Cá gi i oạn quy trình nhân giống in vitro 1.1.5 Ứng dụng nuôi cấy in vitro nhân giống trồng 1.1.6 Những nghiên cứu nhân giống ây ƣ c liệu nuôi cấy in vitro 1.2 Giới thiệu loài Chanh Leo 1.2.1 Nguồn gốc phân loại 1.2.2 Đặ iểm sinh học 1.2.3 Thành phần hóa học 12 1.2.4 Công dụng 12 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Đ iểm v iều kiện bố trí thí nghiêm 16 2.4 Đối tƣ ng, vật liệu nghiên cứu 17 2.5 Phƣơng pháp nghi n ứu thực nghiệm 17 2.5.1 Phƣơng pháp luận 17 2.5.2 Phƣơng pháp ụ thể 17 2.6 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử tr ng ến khả tạo m u 22 3.2 Ảnh hƣởng củ môi trƣờng inh ƣỡng ến khả nhân nh nh hồi 25 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến khả nhân nh nh hồi 28 3.4 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến khả r rễ 32 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Tồn kiến ngh 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Kí hiệu Nội dung diễn giải BAP 6-Benzylamino purine IBA Indole-3- butyric acid Kenitin 6-furfuryamino purine NAA Naphthylacetic acid ĐHST Diều Hò Sinh Trƣởng MS Murashige & Skoog, 1962 CTTN Cơng thứ nghi n ứu TB Trung Bình ĐC Đối Chứng 10 MD Môi trƣờng inh ƣỡng nhân tạo DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng thời gian khử tr ng ến khả tạo m u 18 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng củ MD ến khả tái sinh hồi 19 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng củ môi trƣờng dinh ƣỡng ến khả nhân nh nh chồi 19 Bảng 2.4 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến khả r rễ 20 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử tr ng ến khả tạo m u 22 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng củ MD ến khả nhân nh nh hồi 25 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến khả nhân nh nh hồi 29 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến khả r rễ 33 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Thân, lá, hoa Chanh Leo 10 Hình 1.2 Chanh leo vàng (A) Chanh leo tím (B) 11 Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử tr ng ến khả tạo m u 24 Hình 3.2 M u hạt nảy chồi sau tuần nuôi cấy 24 Hình 3.3 Ảnh hƣởng củ MD ến tỷ lệ m u tái sinh chồi 26 Hình 3.4 Ảnh hƣởng củ mơi trƣờng inh ƣỡng ến hệ số nhân nhanh chồi 27 Hình 3.5 Ảnh hƣởng củ MD ến khả nảy chồi (MT1+MT3) 27 Hình 3.6 Ảnh hƣởng củ MD ến khả nảy chồi (MT2+MT4) 28 Hình 3.7 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến tỷ lệ chồi tái sinh 30 Hình 3.8 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến hệ số nhân nhanh 30 Hình 3.9 Ảnh hƣởng củ MD ến khả tạo chồi CT1 (A) CT2 (B)31 Hình 3.10 Khả ật chồi CT3 (trái) CT4 (phải) 31 Hình 3.11 Khả ật chồi Chanh leo CT5 32 Hình 3.12 Ảnh hƣởng chất ĐHST ến tỷ lệ rễ 34 Hình 3.13 Khả r rễ tr n môi trƣờng R5 (trái) R3 (phải) 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Chanh Leo l lo i ây ây l o thân thảo, t n kho họ l Passiflora incarnata, thuộ họ: Lạ ti n (Passiflora) Đây l lo i nguồn gố từ nƣớ N m Mỹ (Argentina, Paraguay Brasil) v n y ƣ gây trồng rộng khắp nhiều nơi tr n giới, l Ấn Độ, Sri L nk , N w Z l n , v ng Caribe, Brazil, Colombia, Ecuador, Indonesia, Peru, California, Florida, Haiti, Hawaii, Austr li , Đông Phi,M xi o, Isr l v N m Phi Chanh Leo dây leo thân thảo, sống lâu năm, lớn nh nh Cây có thân ị l o, vƣơn n iv nhiều tu uốn khả quấn ám hặt tr n khung k h thƣớ nhỏ Chanh keo có h nh hân v t, xẻ thùy mọ so l Hoa thƣờng cánh, m u trắng ánh t m t , thụ phấn nhờ ôn tr ng Ngo i ung ấp nguy n liệu thự phẩm, l m nguy n liệu ƣ liệu ộ phận ây h nh ây ều ng l m thuố giá tr thể sử ụng i thuố y họ ổ truyền v ại Ở nƣớ t , Ch nh l o ã ƣ nhập v gây trồng rộng rãi tr n nhiều t nh th nh ả nƣớ , với hiệu kinh tế lớn n y ây giống m trồng hủ yếu ƣ o Tuy nhi n, tr n thự tế phần nhân ằng hạt, n n thƣờng thƣ ng phân ly, suất thấp, hiệu kinh tế không o Mặt , nghi n ứu nhân giống Ch nh l o ằng nuôi in vitro òn nhiều hạn hế Do phát triển qui mô lớn, l ối với o nh nghiệp lớn muốn kinh o nh Ch nh l o gặp kh khăn, nguồn ây on hất lƣ ng o ung ấp không ủ áp ứng nhu ầu Do , ề t i kh luận với ti u ề ―Bƣớc đầu nghiên cứu khả nhân giống Chanh Leo (Passiflora edulis) kỹ thuật nuôi cấy in vitro‖ hết sứ ần thiết, Th nh ông ủ nghĩ kho họ v thự tiễn ông tr nh nghi n ứu n y giúp ho n thiện quy tr nh nhân giống vô t nh Ch nh L o ằng phƣơng pháp nuôi in vitro, v g p phần hủ ộng ung ấp ây on hất lƣ ng trồng v phát triển tr n quy mô lớn o, ồng ều, sạ h mầm ệnh cho gây CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro Nuôi mô tế ộ phận ủ vô tr ng o thự vật l phƣơng pháp sản xuất h ng loạt ây on từ ây mẹ, ằng h nuôi húng ống nghiệm iều kiện môi trƣờng th h h p v ƣ kiểm soát [4] Nhân giống vô t nh ây trồng in vitro h y vi nhân giống l lĩnh vự ứng ụng hiệu ông nghệ nuôi mô tế Đây l phƣơng pháp nhân giống ại ƣ o thƣ vật thự phòng th nghiệm n n òn gọi l phƣơng pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) ể phân iệt với tr nh nuôi iều kiện tự nhi n ngo i ống nghiệm (in vitro) 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro Kĩ thuật nuôi mô tế o (tisue culture) n i v kĩ thuật nhân giống vô t nh n i ri ng ều ự v o sở kho họ l t nh to n năng, phản h v phản phân h v trẻ h 1.1.2.1.Tính tồn tế bào Cuối kỷ XIX ầu kỷ XX, nh sinh l thự vật họ ngƣời Đứ Gottli H rl n t ã ặt m ng ầu ti n ho nuôi mô tế ông ƣ r giả thuyết t nh to n ủ tế o: ―Tế o thự vật o ất kỳ ủ sinh vật n o ũng ều m ng to n ộ thông tin i truyền ần thiết v sinh vật Khi gặp iều kiện th h h p, tế o ều thể ủ ủ ả thể phát triển th nh thể ho n h nh‖ Tính to n ủ tế phƣơng pháp nuôi mô - tế minh ƣ om H rl n t n u r h nh l sở l luận ủ o thự vật Cho ến n y nh kho họ khả tái sinh thể thự vật ho n h nh từ tế ã hứng o ri ng rẽ [6] 1.1.2.2 Sự biệt hóa phản biệt hóa tế bào Sự phân h ảm nhận h tế o l huyển h tế o th nh mô huy n h , nh u thể Tuy nhi n, tế th nh mô húng ho n to n khả phân hi o ã phân ủ m nh Trong iều kiện môi trƣờng th h h p, húng lại tế o phôi sinh v phân hi mạnh mẽ nhƣ tế o v tế hò hoạt h v phản iệt h g n Tại thời iểm n o số g n ƣ hoạt h mới, số g n lại tr nh ã ƣ mã h gọi l l kết ủ tr nh iều tr nh phát triển ủ (m vốn trƣớ n y ứ thể hế) ể ho r t nh trạng nh h hoạt ộng Điều n y xảy r th o hƣơng ấu trú Mặt , tế ủ phân tử ADN tế o nằm khối mô ủ o xung qu nh Khi tá h ri ng tế khối mô tạo iều kiện thuận l i ho hoạt h ƣ tế o Về ản hất th iệt h hoạt h n ầu ho r khả tái sinh th nh ây ho n h nh Qú tr nh phản phân h ởi tế o h p tử thể trở ạng o thể thƣờng ứ o hoặ giảm k h thƣớ g n ủ tế xảy r th o hƣơng tr nh nh hế ủ o, tr nh sẵn ộ g n [1], [4], [12] 1.1.2.3 Sự tr hóa V o kỷ XVII-XVIII, ngƣời t th o tuổi v ời sống ủ v li n tụ h thể trẻ h ho ịng vơ t nh thối h i thơng qu sinh sản ằng hạt Song thự tế ho thấy òng vô t nh l vô hạn nhƣ n sống môi trƣờng th h h p ổi ằng sinh sản sinh ƣỡng Khả r hồi, rễ th nh phần nh u l nh u V ể họn m u ph h p phải ăn ứ v o trạng thái sinh l h y tuổi m u Trong nuôi in vitro, m u non trẻ phản ứng với trƣờng nuôi nh nh, ễ tái sinh, ặ r mô non trẻ ƣ iều kiện v môi iệt nuôi mô sẹo, phôi Ngo i h nh th nh, sinh trƣởng mạnh, mứ ộ nhiễm mầm ệnh t 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.3.1 Điều kiện vô trùng Điều kiện vô tr ng l tr nh nuôi mô - tế iều kiện ti n ối với th nh ông o Để m u nuôi sống ƣ th ần ủ hất inh ƣỡng ho m u, không vô tr ng th vi khuẩn, khuẩn, nấm lấy hết hất inh ƣỡng môi trƣờng nhƣ m u hết + Vô trùng dụng cụ môi trường Trong nuôi mô – tế o thự vật, th o tá m u ƣ tiến h nh tủ vô tr ng Để vô tr ng ụng ụ v môi trƣờng nuôi ấy, thể sử ụng phƣơng pháp s u: - Khử trùng khô (sấy khô): phƣơng pháp n y h ằng kim loại, thủy tinh, ụng ụ ng ho t nh h u nhiệt Thiết ụng ụ ng khử tr ng khơ l lị sấy, tủ sấy Nhiệt ộ ảm ảo 160 – 2000C - Khử trùng ướt: l phƣơng pháp áp ụng hiệu v phổ iến vô tr ng môi trƣờng v ụng ụ nuôi Thiết sử ụng l nồi hấp vô trùng, ng l 1200C nhiệt ộ thƣờng - Màng lọc: ng ể loại ỏ tá nhân gây nhiễm k nh thƣớng 0,025-10µm khỏi mơi trƣờng ni Đây l phƣơng pháp ph h p với môi trƣờng m th nh phần ủ n phân hủy nhật ộ o nhƣ ung số hất iều hò sinh trƣởng Hiện n y ngƣời t h nzym ò sử ụng hệ thống ơm khử tr ng ung ti h lớn ể th nh tr ng ung t h lớn ể th nh tr ng ung h nuôi nuôi tế o trần h y huyền ph tế o + Vô trùng mẫu cấy: Với loại m u nh u hoặ ng loại m u nhƣng v tr nh u… th phƣơng pháp khử tr ng m u l nh u Phƣơng pháp phổ iến vô tr ng m u n y l sử ụng h hất khả ti u iệt vi sinh vật Hiệu khử tr ng phụ thuộ v o loại, nồng ộ, thời gi n xử l h khử tr ng Một h hất ƣ lự họn ể vô tr ng phải ảm ảo thuộ t nh: khả iệt vi sinh vật tốt v không hoặ t ộ Cá h hất h y ƣ hất sử ụng ối với m u thự vật l : hypo lorit nxi (nồng ộ 5-15%), hypo lorit n tri (nồng ộ 10-20%), oxy gi (nồng ộ 10-12%), thủy ngân loru (nồng ộ 0,1-1%), hất kháng sinh (50-100 mg/l)… Để tăng t nh linh ộng ủ h th m hất l m tăng sứ t pol… hoặ hất iệt khuẩn, ngƣời t thƣờng sử ụng ăng ề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, thể phối h p xử l với ồn 700 Lần 1,80 1,62 1,60 1,40 1,40 1,20 1,09 0,93 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 MT1 MT2 MT3 CTTN MT4 Hình 3.4 Ảnh hƣởng mơi trƣờng dinh dƣỡng đến hệ số nhân nhanh chồi Cột tr số tr n iểu h nh 3.4 ho thấy, môi trƣờng MT1 sạ h tái sinh với tr số ngƣ lại MT4 o th ũng thu ƣ hệ số nhân hồi tỷ lệ thấp m u sạ h tái sinh, h thu ƣ tỷ lệ m u o tƣơng ứng, hệ số nhân thấp Hình 3.5 Ảnh hƣởng MD đến khả nảy chồi (MT1+MT3) Ngo i r , kết kiểm tr thống k ằng phân t h phƣơng s i ảnh hƣởng ủ môi trƣờng tới hệ số nhân hồi ho thấy, F Tính (=32,77) > FTr ảng (=4,06) ã hứng tỏ rằng, mơi trƣờng inh ƣỡng có ảnh hƣởng rõ rệt ến hệ số nhân hồi giữ ông thứ th nghiệm, m ảnh hụp tr n h nh 3.5 v h nh 3.6 nhƣ l v ụ sinh ộng l m rõ ho g ã phân t h tr n 27 Hình 3.6 Ảnh hƣởng MD đến khả nảy chồi (MT2+MT4) Tạo ƣ hồi in vitro sạ h l phải gi tăng ƣ ần thiết song hƣ ủ, iều qu n trọng l số lƣ ng mô thời gi n ngắn, h y n i h thú ẩy nhân nh nh tr nh nuôi in vitro ƣ qu n tâm 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Trong tr nh nhân giống in vitro, nhân nh nh l gi i oạn hiệu v tố ộ ủ tỏ quy tr nh nhân giống nh ƣ ông nghệ nhân giống Hệ số nhân o ng hứng ng hiệu Năm 1993, Rhojw ni & R z ã khẳng rằng: ―Trong việ tạo hồi Auxin ũng tá ng ụng t h ự phối h p với Cytokinin nồng ộ th h h p‖ V việ t m r h m lƣ ng ủ hất iều hò sinh trƣởng th h h p ho mụ Mụ ti u số ủ nhân giống h nh l nh h nhân hồi l ần thiết ất kỳ quy tr nh nhân giống n o l thu ƣ o Muốn th phải g p mặt ủ á hệ số hất k h th h, hất iều hò sinh trƣởng Chất ĐHST l ông ụ hữu h giúp húng t nghi n ứu sâu phát sinh thự vật ống nghiệm Đặ iệt với mụ h nhân giống tạo số lƣ ng lớn thời gi n ngắn th việ sử ụng loại hất ĐHST nồng ộ nh u ho tỷ lệ m u tái sinh lớn l tất yếu Cá c ông thứ nghi n ứu ảnh hƣởng ủ hất iều hò sinh trƣởng ều th nh phần: MS + 20g/l ƣờng su ros + 6g/l g r, òn nh u loại v nồng ộ hất iều hò sinh trƣởng Chồi ây Ch nh L o s u nảy mầm v th nghiệm tạo m u sạ h ƣ v 28 hồi phát triển khỏ thu ƣ từ v o môi trƣờng nhân nh nh ể tạo hồi Những hồi n y ƣ s u sử ụng l m nguồn vật liệu ho th nghiệm S u tuần nuôi kết th nghiệm ƣ tr nh y ảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi Chất ĐHST (mg/l) CTTN BAP Kinetin IBA Tổng số NAA mẫu Khả tái sinh chồi Tỷ lệ tái sinh Hệ số nhân (%) (lần) TB V% TB V% Đặc điểm chồi ĐC - - - - 20 18,33 15,75 0,83 3,46 + CT1 0,3 - 0,1 0,1 20 33,33 8,66 1,22 10,34 + CT2 0,3 0,1 0,1 0,1 20 35,00 14,29 1,33 5,73 + CT3 0,7 0,1 0,1 0,1 20 68,33 11,18 2,05 11,18 ++ CT4 0,5 0,1 0,1 0,1 20 81,67 3,53 2,17 6,66 +++ CT5 1,0 0,1 0,1 0,1 20 45,00 11,11 1,28 5,95 + Ghi chú: + Chất lƣ ng hồi k m: hồi yếu, mảnh, hết ++ Chất lƣ ng hồi trung nh: hồi yếu, mảnh +++ Chất lƣ ng hồi tốt: hồi mập, khỏ - Không ổ sung hất ĐHST v o ông thứ th nghiệm S u khoảng tuần, hồi phát triển mạnh v huyển s ng môi trƣờng ủ khỏ th tiến h nh ể nhân nh nh hồi, tăng hệ số nhân hồi Đoạn thân mầm mắt ngủ ũng ƣ v s ng môi trƣờng nhân nh nh, s u tuần, iều kiện ánh sáng ph h p, phát triển tạo r nhiều hồi n Cá hồi n y ƣ s ng môi trƣờng nhân nh nh, mắt ngủ tiếp tụ phát triển th m nhiều hồi n nữ Số liệu ảng 3.3 v h nh 3.7 ho thấy, môi trƣờng hất ĐHST nh u ho kết với hệ số nhân hồi ũng nh u Th o th nh phần hất ĐHST gồm hồi , CT4 với BAP (0,5mg/l); Kinetin (0,1mg/l); IBA (0,1mg/l); v NAA (0,1mg/l) ho tỷ lệ m u tái sinh ạt 81,67%, hệ số nhân hồi ạt 2,17 lần, o số ông thứ th nghiệm nhân nh nh hồi 29 Tr số tr n iểu h nh 3.8 ũng ho thấy, ông thứ CT4 o số nh vƣơn ột tr số nhƣ l minh hứng rõ n t ho g ã phân t h tr n Tỷ lệ (%) 90 81,7 80 68,3 70 60 45,0 50 40 30 20 33,3 35,0 CT1 CT2 18,3 10 00 ĐC CT3 CT4 CT5 CTTN Hình 3.7 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến tỷ lệ chồi tái sinh Kết phân t h phƣơng s i nhân tố ho h ti u tỷ lệ m u tái sinh hồi cho thấy, FTính(=75,96) > FTr giữ ơng thứ nghiệm l ảng(=3,10), nghĩ hứng tỏ kết ho thấy việ iệt ổ sung hất ĐHST ảnh hƣởng ến tỷ lệ hồi tái sinh Tƣơng tự, hệ số nhân hồi ũng ƣ ủ iều h nh 3.7 với CT4 l phản ảnh ật tr n ột tr số o (H nh 3.7) Lần 2,50 2,05 2,17 2,00 1,50 1,00 1,22 1,33 1,28 0,83 0,50 0,00 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CTTN Hình 3.8 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến hệ số nhân nhanh 30 Ngo i r , kết kiểm tr thống k ằng phân t h phƣơng s i nhân tố ho h ti u tỷ lệ m u tái sinh hồi ho thấy, FTính(=47,59) > FTr Nhƣ vậy, lần nữ nghiệm l ã hứng tỏ rằng, nghĩ , việ ổ sung hất ĐHST iệt giữ ảng(=3,10) ông thứ ảnh hƣởng rõ rệt ến hệ số nhân hồi q tr nh ni Hình 3.9 Ảnh hƣởng MD đến khả tạo chồi CT1 (A) CT2 (B) Tất nhi n, ây l kết ƣớ i nồng ộ rộng hơn, tỷ lệ ật hồi thể l nhƣ v ầu, ần thể thu o (85%) nhƣ CT4 nghi n ứu sâu hơn, với kết h nh xá Mặt , thể ho ph p nhận x t rằng, Chanh Leo ối tƣ ng thự vật thuận l i ho nhân giống vô t nh, m nghi n ứu n y ụ Hình 3.10 Khả bật chồi CT3 (trái) CT4 (phải) Trong nghi n ứu nhân giống, hệ số nhân l qu n trọng, ánh giá th nh công hiệu ông tr nh Tƣơng tự nhƣ tr n, hệ số nhân ũng tăng ần th o 31 nồng ộ BAP nồng ộ, v nhân h ụ, ối hứng (ĐC) không sử ụng hormon , hệ số ạt 0,83 lần, tăng tiếp nồng ộ 0,1 mg/L (CT1), hệ số nhân ạt 1,22 lần, sử ụng hormon l IBAvới nồng ộ 0,1%, NAA 0,1%, v phối h p với KT 0,2mg/L (CT4), IBA 0,1%, NAA 0,1%, hệ số nhân ạt 2,2 lần ng iều ki n so sánh Tuy nhi n, iều hú v 0,2mg/L tƣơng ứng thu ƣ lần) o Trong tr n nồng ộ l tổ h p giữ BAP v KT (CT4), nồng ộ 0,5 tỷ lệ ật hồi (85%) v hệ số nhân hồi (2,17 ơng thứ ịn lại sử ụng phối h p h i hormon o (CT3) Rõ r ng ò t m hủng loại v nồng ộ hormon sử ụng th h h p ho nhân nh nh l ần thiết, nghĩ kho họ v thự tiễn o, l với ối tƣ ng thự vật nghi n ứu lần ầu, hẳng hạn nhƣ passiflora edulis Hình 3.11 Khả bật chồi Chanh leo CT5 Tóm lại, nhân nhanh Chanh L o ằng ni in vitro sử ụng môi trƣờng MS, vitro l ông thứ ph h p ể nhân nh nh hồi ây Ch nh L o in ông thứ CT4: (MS + 0,5mg/l BAP + 0,2mg/l Kin tin + 0,1mg/l IBA + 0,1mg/l NAA + 20g/l ƣờng su ros + 6g/l g r) ho hệ số nhân hồi o (2,17 lần), tỷ lệ ật hồi (85%) s u 35 ng y nuôi ấy; hất lƣ ng hồi sinh trƣởng x nh tốt, hồi mập, khỏ v ồng ều (H nh 3.10) 3.4 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ Các chồi ạt ti u huẩn từ th nghiệm tr n ƣ huyển s ng MD có ổ sung hất ĐHST ể xú tiến m u r rễ tạo ây ho n h nh q trình 32 ni Nghi n ứu ƣ su ros +6g/l g r v ƣ ố tr với loại MD khác nhau, gồm ½ MS + 20g/l ổ sung hất ĐHST nh u S u tuần nuôi ấy, kết ghi Bảng 3.4 ƣới ây: Bảng 3.4 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ Chất ĐHST (mg/l) CTTN Tỷ lệ rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Trạng thái rễ IBA NAA ĐC 0,0 0,0 0,00 - R1 0,1 0,0 46,67 2-3 + R2 0,2 0,0 33,33 1-2 + R3 0,0 0,1 80,00 3-4 ++ R4 0,0 0,2 20,00 0-1 + R5 0,1 0,2 93,33 4-5 +++ Ghi chú: +++: Trạng thái rễ tốt (rễ dài, mập nhiều rễ phụ) ++: Trạng thái rễ (rễ dài, mảnh nhiều rễ phụ) +: Trạng thái rễ (rễ ngắn, mảnh, rễ phụ) Số liệu ảng 3.4 v h nh 3.12 ho thấy, sử ụng phối h p IBA v NAA môi trƣờng r rễ ảnh hƣởng không nhỏ tới khả r rễ Sử ụng IBA v NAA tr nh thú rễ nuôi in vitro Ch nh l o với nồng ộ nh u ho kết với tỷ lệ r rễ ũng nh u Trong R5 sử ụng phối h p IBA với NAA mg/l tƣơng ứng ạt kết r rễ l 93,33%, hiều 5,0 cm, o số Cụ thể, nồng ộ 0,1 mg/l v 0,2 i trung nh ủ rễ l 4,0 - ông thứ so sánh th nghiệm ơng thứ th nghiệm R1 R2 cho thấy, nồng ộ sử ụng IBA tăng từ 0,1 mg/L (R1) l n 0,2 mg/l (R2) v hƣ ổ sung NAA ho tỷ lệ r rễ giảm từ 46,6% xuống 33,33% , hiều i trung nh ủ rễ h ạt từ 1,0 ến 3,0 cm (hình 3.12) Mặt , kiểm tr thông k ằng phân t h phƣơng s i nhân tố ảnh hƣởng ủ IBA v NAA ến tỷ lệ r rễ ho thấy, FTính (=6,93) > FTr iệt rõ rệt giữ ông thứ th nghiệm l 33 ảng nghĩ (=4,96), ã hứng tỏ Tỷ lệ (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 93,3 80,0 46,7 33,3 20,0 0,0 ĐC R1 R2 R3 R4 R5 CTTN Hình 3.12 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến tỷ lệ rễ Tuy nhiên nồng ộ NAA 0,1 mg/l (R3) tăng l n 0,2mg/l (R4) v không ổ xung IBA th tỷ lệ r rễ gảm nh nh h ng từ 80% (R3) òn 20% (R4) Khi ổ sung ả IBA 0,1mg/l v NAA 0,2mg/l v o môi trƣờng r rễ th tỷ lệ r rễ tăng l n nh nh h ng l 93,33% Hình 3.13 Khả rễ mơi trƣờng R5 (trái) R3 (phải) Điều n y hứng tỏ IBA v NAA rễ hồi Ch nh L o in vitro l ảnh hƣởng tốt tới h nh th nh ông thứ môi trƣờng R5 ( ổ sung 0,1mg/l IBA + 0,2 mg/l NAA) ho tỷ lệ hồi r rễ o ạt 93,33%, hiều i trung nh ủ rễ l 4-5 cm Tuy nhi n, kết tr n h l ƣớ ầu ần nghi n ứu huy n sâu hơn, với ải nồng ộ v loại hất ĐHST nh u, số m u lớn ể thu ƣ ƣ kết h nh xá Song ây l lần ầu nghi n ứu n n qu n tâm v ần hƣớng nghi n ứu tiếp th o thời gi n tới 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ tất ả kết thu ƣ phần tr n, ƣớ ầu ề t i kh luận i ến số kết luận nhƣ s u: Công thứ khử tr ng ằng HgCl2 0,1% tốt ho m u hạt Ch nh L o thời gi n phút hi l m lần, lần phút, ho tỷ lệ m u sạ h ạt 72,2%, m u sạ h tái sinh ạt 57,8% Môi trƣờng v o m u ph h p l : MS + 20g/l ƣờng + 6g/l g r + 0,6mg/l KIN + 0,2mg/l NAA ho tỷ lệ m u tái sinh hồi l 91%, hệ số nhân nh nh hồi ạt 1,62 lần, hiều o hồi ạt 7-10 m, thời gi n ật hồi 7-9 ngày Môi trƣờng nhân nh nh tốt l : MS + 0,5mg/l BAP + 0,1mg/l Kin tin + 0,1mg/l IBA + 0,1mg/l NAA + 20g/l ƣờng su ros + 6g/l g r, ho hệ số nhân hồi o (2,17 lần), hồi mập, khỏ mạnh ồng ều Môi trƣờng ph h p ho thú rễ l R5 (0,1mg/l IBA + 0,2 mg/l NAA + 20g/l sucrose + g/l agar) ho tỷ lệ r rễ ạt 93,33%, hiều i rễ l 4-5 cm 4.2 Tồn kiến nghị Do thời gi n nghi n ứu hạn, n n ề ngh tiếp tụ nghi n ứu th m nội ung s u ể ổ sung v ho n thiện quy tr nh nhân giống Ch nh L o ằng kỹ thuật nuôi in vitro Cần tiếp tụ nghi n ứu hu kỳ nhân hồi ủ lo i Ch nh L o nghiên ứu ảnh hƣởng ủ thời gi n huấn luyện tới khả sống ủ ây Ch nh L o, ũng nhƣ nghi n ứu ảnh hƣởng ủ th nh phần giá thể tới khả sống v sinh trƣởng ủ ây on Ch nh L o gi i oạn vƣờn ƣơm Tiếp tụ nghi n ứu ho n thiện quy tr nh nhân giống ể nâng nhân giống từ kết m nghi n ứu ã thu ƣ 35 o hiệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Trần B nh; Hồ Hữu Nh - L Th Muội (1997), Công nghệ sinh họ ải thiện giống ây trồng, NXB Nông nghiệp, H Nội ―Cây Chi (S lvi hisp ni ) v giá tr tiềm năng‖ (2015), Trung tâm ứng ụng tiến ộ kho họ v ông nghệ Cần Thơ Võ Văn Chi, Dƣơng Đứ Tiến (1978), Phân loại thự vật, NXB Đại họ v Trung họ huy n nghiệp H Nội Nguyễn Th Th nh Hiền, Dƣơng Tấn Nhựt, Đỗ Năng V nh (2003), ―Bƣớ v ầu nghi n ứu việ tạo hạt nhân tạo, ứng ụng nhân giống vô t nh ảo quản‖, Hội ngh Công nghệ sinh họ to n quố 2003, H Nội, tr ng 935- 938 Nguyễn Ho ng Lộ , Đo n Trọng Đứ , Trần Th Tri u H (2005), Nghi n ứu nhân nh nh in vitro ây C g i l o (Sol num h in n ns H n ) lo i thảo ƣ qu , Bộ Giáo ụ v Đ o tạo Nguyễn Đứ Th nh (2000), Nuôi mô tế o thự vật nghi n ứu v ứng ụng, NXB Nông nghiệp, H Nội Nguyễn Quố Thiện (2005), Ứng ụng hệ thống Bior xuất số lƣ ng lớn ây ƣ liệu v ho tor sản ảnh, Trung tâm CNSH – TP Hồ Ch Minh Phan Th Hồng Thủy v nh m nghi n ứu phịng Hỗ tr Cơng nghệ tế o thự vật (2016), ―Nhân giống ây Sâm s u (Curculigo orchioides) – loại ƣ liệu qu , ằng phƣơng pháp nuôi mô tế Nông nghiệp Công nghệ o thự vật‖, B n quản l khu o TP.HCM Hoàng Vũ Thơ (2016), Nghi n ứu nhân giống Đinh ũ (Stereospermum colais) ằng phƣơng pháp nuôi in vitro, Tạp h Nông nghiệp v phát triển nông thôn, kỳ tháng 3/2016 10 Trần Văn Tiến (2013), Nghi n ứu nhân nh nh giống ây Ch m ngây (Moringa oleifera L.) hất lƣ ng kho họ v ông nghệ Việt N m o ằng kỹ thuật nuôi mô, Viện H n lâm 11 Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tƣ (2010), ―Nghi n ứu nhân giống in vitro Ba kích (Morinda officinalis How)‖, Tạp h kho họ v ông nghệ, Đại họ Đ Nẵng, số 5, tr ng 191-196 12.Ho ng Th Sản (2003), Phân loại họ thự vật, NXB Giáo ụ 13 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng H ng, L Hồng Điệp (2007), Công nghệ sinh họ tập 2- Công nghệ sinh họ tế o, NXB Giáo ụ , H Nội Tài liệu tiếng anh 14 Ricardo Ayerza (h), Wayne Coates, Protein content, oil content and fatty acid profiles as potential criteria to determine the origin of commercially grown chia (Salvia hispanica L.), Industrial Crops and Products, Volume 34, Issue 2, September 2011, Pages 1366-1371 (hàm lƣ ng prot in, ầu, tiềm năng) 15 ―Di t ry hi s (Salvia hispanica L.) ri h in α-linolenic acid improves adiposity and normalises hypertriacylglycerolaemia and insulin r sist n in yslip mi r ts‖, British Journ l of Nutrition, Volum 101, Issu May 2008, pp 41-50 16 D Orona-Tamayo, ME Valverde, O Paredes-López (2017), Chia— The New Golden Seed for the 21st Century: Nutraceutical Properties and Technological Uses, Sustainable Protein Sources, Chapter 17, Pages 265-281 17 Vanesa Y Ixtaina, Susana M Nolasco, Mabel C Tomás (2008), ―Physi l prop rti s of hi (Salvia hispanica L.) s s‖, In ustri l Crops n Products, Volume 28, Issue 3, November 2008, Pages 286-293 ( l ủ hạt hi ) ặ t nh vật PHỤ LỤC Phụ biểu 1: kết phân tích phƣơng sai Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance KT1 0 KT2 173,40 57,80 103,63 KT3 166,70 55,56 192,96 KT4 103,30 34,43 25,96 KT5 20,00 6,67 11,22 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 8659,809 2164,952 32,43083 1,0595E-05 3,47805 Within Groups 667,56 10 66,756 9327,369 14 ANOVA Total Phụ biểu 2: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi Chanh Leo Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance KT1 0 KT2 216,7 72,23333 159,8533 KT3 203,3 67,76667 25,85333 KT4 163,3 54,43333 25,96333 KT5 30 10 10,89 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 13543,1 3385,774 76,0643 1,90569E-07 3,47805 Within Groups 445,12 10 44,512 Total 13988,22 14 ANOVA Phụ biểu 03: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi Chanh Leo Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance MT1 273,3 91,1 14,52 MT2 180 60 44,89 MT3 220 73,33333 44,22333 MT4 86,7 28,9 14,52 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 6203,26 2067,75 70,0023 4,39649E-06 4,06618 Within Groups 236,306 29,5383 Total 6439,56 11 ANOVA Phụ biểu 04: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng MD đến khả nhân nhanh Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance MT1 4,87 1,623333 0,001633 MT2 3,27 1,09 0,0103 MT3 4,20 1,4 0,0049 MT4 2,80 0,933333 0,018233 SS df MS F P-value F crit Between Groups 0,861633 0,287211 32.76172 7.65728E-05 4.066181 Within Groups 0.070133 0.008767 Total 0.931767 11 ANOVA Source of Variation Phụ biểu 05: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả tái sinh chồi Chanh Leo Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance ĐC 55 18,33333 8,333333 CT1 100 33,33333 8,333333 CT2 105 35 25 CT3 205 68,33333 58.33333 CT4 245 81.66667 8.333333 CT5 135 45 25 SS df MS F P-value F crit Between Groups 8440,278 1688,056 75,9625 1,16283E-08 3,105875 Within Groups 266,6667 12 22,22222 Total 8706,944 17 ANOVA Source of Variation Phụ biểu 06: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance ĐC 2,50 0,833333 0,000833 CT1 3,65 1,216667 0,015833 CT2 4,00 1,333333 0,005833 CT3 6,15 2,05 0,0525 CT4 6,50 2,166667 0,020833 CT5 3,85 1,283333 0,005833 SS df MS F P-value F crit Between Groups 4,032361 0,806472 47,59508 1,68486E-07 3,105875 Within Groups 0,203333 12 0,016944 Total 4,235694 17 ANOVA Source of Variation Phụ biểu 07: ảnh hƣởng chất ĐHST đến khả rễ Chanh Leo Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance ĐC 0 R1 140 46,666 44,422 R2 100 33,333 44,422 R3 240 80 44,48 R4 60 20 44,48 R5 280 93,3333 44,42 Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 19044,44 3808,88 102,83 2,00356E-09 3,1058 Within Groups 444,49 12 37,055 Total 19488,9 17 ANOVA ... oạn quy trình nhân giống in vitro 1.1.5 Ứng dụng nuôi cấy in vitro nhân giống trồng 1.1.6 Những nghiên cứu nhân giống ây ƣ c liệu nuôi cấy in vitro 1.2 Giới thiệu loài Chanh Leo ... VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro 1.1.3 Cá iều kiện nuôi cấy in vitro ... trƣờng inh ƣỡng ến khả tái sinh hồi in vitro Chanh Leo; Nghi n ứu ảnh hƣởng ủ môi trƣờng inh ƣỡng ến khả nhân nh nh hồi in vitro Chanh Leo; Nghi n ứu ảnh hƣởng ủ môi trƣờng inh ƣỡng ến khả r rễ