Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây trúc đen lá sọc (sinobambusa tootsik albostriata)

1 ỌC N N ỌC SƢ P M KHOA SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro trúc đen sọc (Sinobambusa tootsik albostriata) Sinh viên thực : Lê Thị Thoa Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trƣờng Ngƣời hƣớng dẫn : Võ Châu Tuấn Nẵng, tháng 5/ 2013 MỞ ẦU Lý chọn đề tài Trên giới, tre trúc đánh giá loài thực vật phong phú thành phần loài có tốc độ phát triển nhanh tất loài thực vật Tre trúc chiếm tới 37 triệu hecta, 1% thuộc rừng hoang dã giới Tre góp phần quan trọng phát triển bền vững khả hấp thu lượng CO2 lớn lồi khác Tre cịn góp phần vào việc làm giảm q trình biến đổi khí hậu ngày tăng lên giới [33] Ở Việt Nam, Tre trúc có vị trí quan trọng đời sống người dân Hiện nay, tre trúc xác định trồng có giá trị lớn kinh tế quốc dân, đặc biệt nông dân nông thôn miền núi [8, 9] Con người dùng phận khác tre trúc như: thân, gốc, lá, măng, rễ… để sử dụng vào nhiều mục đích khác Gần đây, nhiều nghiên cứu phát tre trúc cung cấp nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học phục vụ cho nhu cầu ngày cao người lượng mà không gây ô nhiễm môi trường [15] Tre trúc có vai trị lớn việc cung cấp nguyên vật liệu xây dựng, thủ công mỹ nghệ… để phục vụ đời sống người Một vai trò bật tre trúc cung cấp lượng lớn cảnh, trang trí cho cơng viên, cơng sở, gia đình người ưa chuộng [7] Cùng với phát triển nhanh chóng xã hội, nhu cầu cảnh giới nói chung Việt Nam nói riêng ngày gia tăng Cây cảnh trở thành loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao chiếm vị trí đặc biệt thị trường hàng hóa nơng nghiệp; đó, tre trúc lồi cảnh nhiều người ưa chuộng phổ biến vẻ đẹp vừa mang tính truyền thống đại độc đáo Hiện nay, số lượng nhiều loài tre trúc tự nhiên có xu hướng giảm ảnh hưởng bất lợi điều kiện môi trường, nạn khai thác mức đặc biệt, vấn đề bảo tồn loài tre trúc chưa quan tâm mức Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam cảnh báo loài tre trúc quý biến không trọng công tác bảo tồn Mặc khác, tự nhiên tre trúc nhân giống chủ yếu hình thức sinh sản vơ tính (nhân chồi) với hệ số nhân thấp, cịn phương pháp nhân giống hữu tính thời gian lâu, khó đáp ứng nhu cầu ngày tăng thú chơi cảnh nguồn nguyên vật liệu từ tre trúc Hiện nhân giống in vitro xem phương pháp hữu hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều loài tre trúc quý Trúc đen sọc (Sinobambusa tootsik albostriata) loài trúc quý giới nói chung Việt Nam nói riêng Hiện nay, số lượng trúc đen sọc hiếm, theo điều tra giới, trúc đen sọc có khu phân bố hẹp, chúng thường mọc vùng có nhiệt độ tương đối thấp với độ cao 300 m như: Nhật Bản, Pháp… Còn Việt Nam, theo điều tra biết loài trúc đen sọc Sơn Trà Tịnh Viên thuộc bán đảo Sơn Trà thành phố Đà Nẵng, số lượng ít, có vài Vì vậy, nghiên cứu phương thức nhân giống hữu hiệu để bảo tồn phát triển loài vấn đề cấp thiết Xuất phát từ sở thực đề tài “Nghiên cứu khả nhân nhanh chồi in vitro trúc đen sọc (Sinobambusa tootsik albostriata), làm sở để xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống quý nước ta Mục tiêu đề tài Thiết lập điều kiện môi trường ni cấy thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro trúc đen sọc Nội dung nghiên cứu Đề tài thực nội dung sau đây: - Ảnh hưởng loại chất khử trùng HgCl2, Ca(OCl)2 thời gian khử trùng mẫu trúc đen sọc - Khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất ĐHST đến khả tái sinh chồi in vitro - Khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro Chƣơng TỔN QUAN T 1.1 Sơ lƣợc nhân giống in vitro L ỆU 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro Kỹ thuật nhân giống in vitro hay gọi vi nhân giống sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu nhiều phận khác thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng điều kiện vô trùng ống nghiệm loại bình ni cấy 1.1.2 Các phƣơng thức nhân giống in vitro Thơng thường sinh vật có hai hình thức sinh sản sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính, sinh sản hữu tính đơi khơng xảy điều kiện không đồng kiểu gen, không tạo hạt, hạt lép… người ta sử dụng phương pháp nhân giống vơ tính Thực tế nhân giống vơ tính tiến hành nhiều phương thức giâm cành, chiết, ghép cho hệ số nhân giống thấp, chất lượng giống không cao, phải thời gian dài cho kết ứng dụng số trồng định [3, 5] Sự đời kỹ thuật nhân giống in vitro bước tiến vượt bậc phương pháp nhân giống vơ tính cổ điển giúp khắc phục hạn chế trên, sau số phương thức nhân giống in vitro 1.1.2.1 Phương thức nhân giống trực tiếp - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh Phương thức nhân giống sử dụng phận nhỏ đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm mẫu vật nuôi cấy, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường tiến hành với mục đích làm virus cho trồng [3] Phương pháp nhân giống cách sử dụng mô phân sinh đỉnh hay đỉnh sinh trưởng phổ biến Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng nguyên liệu nhiều đối tượng khác Điển hình như: Năm 1998, Nguyễn Hồng Lộc cs nhân giống thành công quế lan hương (Aerides odorata Lour) từ mô phân sinh đỉnh, kết cho thấy môi trường MS bổ sung 0,4 mg/L NAA; 1,1 mg/L BA 10% nước dừa kích thích đỉnh sinh trưởng tạo protocorm phát triển chồi mạnh [6] Gần đây, nghiên cứu nhân nhanh chuối lùn (Musa nana Lour) phương pháp nuôi cấy in vitro, Từ Thị Tú (2010) sử dụng mẫu chồi đỉnh chuối làm vật liệu nuôi cấy Nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi MS bổ sung mg/L KIN đạt 10,67 chồi/mẫu, chiều cao trung bình 1,18 cm sau 30 ngày nuôi cấy [11] - Vi ghép chồi đỉnh in vitro Vi ghép nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thông qua dinh dưỡng tự nhiên gốc ghép Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích thước khoảng từ 0,2-0,5 mm, tách từ búp non sinh trưởng mạnh mẹ trưởng thành, gốc ghép mầm giá nảy mầm từ hạt giống hoang dại, tồn ghép ni dưỡng điều kiện ống nghiệm vô trùng Phương thức cho phép thu hoàn toàn bệnh mang đặc điểm di truyền mẹ cho mắt ghép [3, 5] Phương thức vi ghép chồi đỉnh in vitro ứng dụng rộng rãi nghiên cứu tạo giống ăn bệnh Có hàng loạt nghiên cứu đối tượng khác như: Lê Thị Hồng (1997) tiến hành vi ghép thuộc họ cam quýt kiểm tra tính vi ghép, kết cho thấy 52/53 đem kiểm tra bệnh Hà Thanh Võ (2005) nghiên cứu kỹ thuật vi ghép bưởi (Citrus grandis) Huang Millikan (1980), Ke cs (1993), Mantel cs (1997), Navarro Juarez (1997) ứng dụng thành công kỹ thuật vi ghép táo để tái sinh tạo virus [2] 1.1.2.2 Phương thức nhân giống gián tiếp - Nhân giống thông qua giai đoạn callus Trong nhân giống in vitro tái sinh hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ni cấy ban đầu khơng nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh mà phát triển thành khối callus, khối callus sau ni cấy mơi trường thích hợp để tái sinh hoàn chỉnh [3] Một số tác giả tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường lên khả hình thành callus từ phận khác chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng khả hình thành từ khối callus loài tre khổng lồ Dendrocalamus giganteus Munro Ramanayake cs (2003) sử dụng phận chồi, hoa non rễ Khối callus hình thành mơi trường MS có bổ sung 4% sucrose; 33,9 µM 2,4-D 16,1µM NAA [26] - Nhân giống thơng qua phát sinh phơi vơ tính Năm 1958, Street and Reinert hai tác giả mơ tả hình thành phơi vơ tính từ tế bào đơn cà rốt (Daucus carota) Đến năm 1977, Murashige cho phơi vơ tính trở thành biện pháp nhân giống in vitro Đến nay, cơng nghệ phơi vơ tính coi cơng nghệ có triển vọng cho nơng nghiệp kỷ 21 [3] Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu Trần Văn Minh nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma dịng hóa keo lai (Acacia sp.) in vitro Kết cho thấy môi trường WPM bổ sung TDZ (0,2 – 0,5 mg/L); mg/L BA 10% nước dừa thích hợp cho phát sinh tế bào soma ba loại mẫu vật (thân, rễ lá) Trong mơi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L TDZ; mg/L BA 10% nước dừa tỏ thích hợp cho tế bào soma biệt hóa thành phơi soma Kết nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp cho tái sinh chồi mơi trường WPM bổ sung 0,2 mg/L TDZ 10% nước dừa, tế bào soma tái sinh dạng cụm chồi nhân nhanh liên tục môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L KIN [1] 1.1.3 Mục đích nhân giống in vitro Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích: - Duy trì nhân nhanh kiểu gen làm vật liệu cho công tác tạo giống - Nhân nhanh với hiệu kinh tế cao loài hoa cảnh khơng trồng hạt - Nhân nhanh trì cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống loài rau, cảnh trồng khác - Nhân nhanh kinh tế kiểu gen quý giống lấy gỗ lâm nghiệp gốc ghép nghề trồng ăn quả, cảnh - Nhân nhanh điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm bệnh virus - Bảo quản tập đồn giống nhân giống vơ tính loài giao phấn ngân hàng gen 1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro 1.1.4.1 Mẫu nuôi cấy Các yếu tố cần quan tâm chọn mẫu bao gồm kiểu gen, quan chọn, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng Mẫu ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả tái sinh khả hình thành in vitro Năm 2006, Đặng Thị Thanh Thúy cs nghiên cứu quy trình nhân giống giáng hương (Ptercarpus macrocarpus), kết cho thấy sử dụng mẫu chồi đỉnh cho hiệu hình thành in vitro tốt sử dụng mẫu nuôi cấy hạt Aliuo (2006), tiến hành nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro đối tượng Bambusa vulgaris, kết cho thấy nguyên liệu cho hiệu tái sinh chồi cao chồi nách lấy từ cành thứ hai trưởng thành [12] 1.1.4.2 Kích thước mẫu Trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, độ lớn chồi có ý nghĩa quan trọng Nó liên quan đến tỷ lệ sống tính ổn định mặt di truyền Tuy nhiên, ni cấy mẫu với kích thước lớn khả sống sót cao mẫu dễ bị nhiễm [4] 1.1.4.3 Phương pháp vô trùng mẫu Khâu vơ trùng mẫu có vai trị lớn đến thành công nuôi cấy mô tế bào thực vật Thời gian vơ trùng, nồng độ hóa chất sử dụng phải phù hợp với đối tượng kích thước mẫu Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào sử dụng số chất khử trùng thông dụng như: dung dịch thuốc diệt nấm, cồn 700, thủy ngân clorua (0,1%), Hypocloric sodium (0,5-5,25%), dung dịch brom [22] Năm 2006, Khưu Hoàng Minh cs nghiên cứu thành cơng quy trình ni cấy mơ trai Nam Bộ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.), kết nghiên cứu cho thấy mẫu trai vô trùng tốt dung dịch Hypo – Na 25% với thời gian 20 – 30 phút kết hợp với dung dịch HgCl2 0,05% 15 phút Víctor cs (2006) tiến hành nghiên cứu trình nhân giống in vitro đối tượng Guadua angustifolia Kunth, Các đoạn mẫu khử trùng tốt dung dịch NaOCl 1,5% với khoảng thời gian 10 phút [39] 1.1.4.4 Thời gian nuôi cấy cấy chuyền Thời gian ni cấy cấy chuyền có ảnh hưởng đến phát sinh quan từ mô sẹo Khi mô sẹo ni lâu mơi trường phát sinh quan chắn xảy phát sinh hình thái bị ức chế mô sẹo cấy chuyền liên tục Trong trường hợp khác, mô sẹo nuôi cấy môi trường tạo mơ sẹo, sau chuyển sang mơi trường khác 10 có thành phần dưỡng chất chất điều hịa sinh trưởng thực vật thay đổi phát sinh quan (chồi rễ) xảy [4] Năm 2003, Ramanayake cs nghiên cứu yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả tạo callus từ phận khác loài tre khổng lồ Dendrocalamus giganteus Munro, callus hình thành mơi trường MS bổ sung 4% sucrose; 33,9 µM 2,4-D 16,1 µM NAA, sau khoảng thời gian 10 tuần nuôi cấy, khối callus phải cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy lỏng ni điều kiện bóng tối ánh sáng yếu [26] 1.1.4.5 Điều kiện nuôi - Nhiệt độ Nhiệt độ cao cần thiết cho tạo chồi có số trường hợp ngoại lệ Trường hợp trì mẫu cấy điều kiện nhiệt độ cao bất thường làm giảm hiệu cytokinin làm tăng hiệu auxin Heide (1965) quan sát thấy mức độ hoạt động cytokinin mẫu cấy Begonia giảm xuống mẫu nuôi cấy điều kiện 270C so với nuôi nhiệt độ 150C Trên môi trường MS có bổ sung KIN tăng trưởng tăng chồi bên từ chồi Asparagus plumosus tăng nhanh nhiệt độ 240C ngừng hẳn sau tuần Chồi tăng trưởng chậm 170C tăng trưởng diễn liên tục 90C tăng trưởng chồi không xảy 300C Theo Tisserart (1981) nhiệt độ ni cấy 250C, nhiệt đới nhiệt độ nuôi cấy cao khoảng 27-300C - Ánh sáng Trong nhiều trường hợp, ánh sáng kích thích tạo chồi Cũng có trường hợp ngoại lệ có số trồng lại tạo chồi dễ dàng tối Chồi hoa Freesia, cuống hoa Eucharis grandiflora Nerine bowdenii Euconomou Read (1986) cho biết mẫu cấy Petunia hybrida tăng trưởng mơi trường khơng có cytokinin xử lí 26 Ca(OCl)2 10% có khả thẩm thấu cao vào bên chồi, oxi hóa phần mẫu tương đối non, gây chết mẫu Đồng thời, việc sử dụng cồn 700 gây mềm nhũn chồi góp phần gây chết chồi Khi mẫu xử lý dung dịch HgCl2 0,1% khoảng thời gian phút tỷ lệ mẫu sống đạt 81,11%, tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 15,00% Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút, tỷ lệ mẫu sống đạt 89,45%, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể xuống 3,33%, đồng thời tỷ lệ mẫu chết tăng nhẹ (từ 3,837,22%) Khi tăng thời gian khử trùng lên 11 phút tỷ lệ mẫu sống đạt 81,11%, tỷ lệ mẫu chết lại có xu hướng tăng lên (11,11%) Kết cho thấy, sử dụng HgCl2 nồng độ thấp hiệu khử trùng tăng lên, đồng thời làm giảm khả làm chết mẫu Như vậy, phương pháp khử trùng trên, phương pháp khử trùng HgCl2 0,1% thời gian 10 phút cho hiệu khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 89,45% 3.2 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi in vitro trúc đen sọc Đoạn chồi có mắt đốt sau khử trùng dung dịch HgCl 0,1% thời gian 10 phút cấy mơi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/L; 25 ml/L nước dừa; sucrose 2%; agar 0,8%; pH = 5,8 Kết thu sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BA đến khả tái sinh đoạn chồi có mắt đốt 27 BA Số chồi Chiều cao Chiều dài Đặc điểm chồi (mg/L) (chồi/mẫu) chồi (cm) (cm) 0,0 0,3c 0,7b 0,6d 0,5 1,0bc 2,9a 1,7c Chồi khỏe, xanh nhạt 1,0 1,3b 3,2a 3,5ab Chồi khỏe, xanh đậm 1,5 2,3a 3,5a 1,5c Chồi khỏe, xanh đậm 2,0 3,0 a 3,7 a 4,2 a Chồi khỏe, xanh đậm 2,5 2,7a 3,2a 3,2a Chồi khỏe, xanh nhạt LSD 0,9179 0,8679 0,7832 Chồi nhỏ, yếu, xanh nhạt Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p