Bước đầu nghiên cứu khả năng nhân giống hoàn ngọc pseuderanthemum palatiferum bằng nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Sau khoảng thời gian học tập rèn luyện Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, đƣợc hƣớng dẫn giúp đỡ thầy cô nhà trƣờng tơi hồn thành mơn học đƣợc thực đề tài khóa luận tốt nghiệp thân Với mong muốn tìm hiểu phƣơng pháp nhân giống in vitro khác so với phƣơng pháp truyền thống, nhƣ áp dụng Công nghệ sinh học vào thực tế nên thực hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp với tiêu đề: “Bƣớc đầu nghiên cứu khả nhân giống Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) nuôi cấy in vitro” Trƣớc tiên cho phép tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến Thầy giáo, PGS.TS Hoàng Vũ Thơ, Trƣởng Bộ môn Chọn tạo giống, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học lâm nghiệp tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp mình, cảm ơn thầy khơng quản khó khăn vất vả tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài hồn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp thời hạn đạt chất lƣợng tốt Cũng cho phép gửi lời cảm ơn chân thành đến giúp đỡ Nhà trƣờng, Ban lãnh đạo nhƣ tất thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, tập thể cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm thuộc Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp Do thời gian, kiến thức kinh nghiệm thực tế cịn hạn chế nên q trình thực đề tài hồn thành báo cáo khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót, mong nhận đƣợc thơng cảm ý kiến đóng góp thầy để đề tài đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.4 Các giai đoạn quy trình nhân giống in vitro 1.1.5 Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro nhân giống trồng 1.1.6 Ƣu điểm nhƣợc điểm phƣơng pháp nhân giống in vitro 1.1.7 Tình hình nghiên cứu ni cấy in vitro dƣợc liệu 10 1.2 Giới thiệu Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) 12 1.2.1 Nguồn gốc phân loại 12 1.2.2 Đặc điểm hình thái 13 1.2.3 Thành phần hóa học 14 1.2.4 Giá trị sử dụng 16 1.3 Một số nghiên cứu nƣớc Hoàn ngọc 17 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 19 2.4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu 19 2.5 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 19 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.6.1 Phƣơng pháp luận 20 2.6.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể 20 2.7 Phƣơng pháp thu thập xử lí số liệu 23 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 25 3.2 Ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi Hoàn ngọc 27 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng than hoạt tính đến khả tái sinh chồi Hoàn ngọc 29 Chƣơng KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận 36 4.2 Tồn kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ TT Từ viết tắt BAP 6-Benzylamino purine IBA Indole-3- butyric acid Kinetin 6-furfuryamino purine NAA Naphthylacetic acid GA3 Acid gibberellic ĐHST MS CTTN MD 10 ̅ 11 ĐC Điều hịa sinh trƣởng Murashige & Skoog, 1962 Cơng thức thí nghiệm Mơi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo Trị trung bình Đối chứng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 21 Bảng 2.2 Ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi 22 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng chất ĐHST than hoạt tính đến khả tái sinh chồi 23 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 26 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi 28 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng MD có than hoạt tính đến khả tái sinh chồi 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái (trái) hoa Hồn ngọc (phải) 13 Hình 1.2 Hình thái thân (trái) rễ Hồn ngọc (phải) 14 Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 26 Hình 3.2 Mẫu tái sinh chồi (trái) mẫu không tái sinh (phải) 27 Hình 3.3 Ảnh hƣởng MD đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 28 Hình 3.4 Tái sinh chồi MS + (*) (trái) 1/2MS (phải) 29 Hình 3.5 Ảnh hƣởng MD có than hoạt tính đến tỷ lệ tái sinh chồi 31 Hình 3.6 Tái sinh chồi môi trƣờng ĐC (trái) MN2 (phải) 31 Hình 3.7 Tái sinh chồi mơi trƣờng MN3 (trái) MN4 (phải) 32 Hình 3.8 Mẫu tái sinh từ chồi ban đầu cấy chuyển vào môi trƣờng MN4 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với phát triển kinh tế, chăm sóc sức khỏe ln vấn đề đƣợc ngƣời quan tâm đặc biệt chủ trọng Trong sử dụng loại thảo dƣợc để chữa trị bồi bổ thể đƣợc ƣu tiên Đây lý mà nhu cầu khai thác loài cho sản phẩm sử dụng làm nguyên liệu dƣợc liệu ngày lớn Hồn ngọc (Pseutheranthemum palatiferum) hay cịn gọi Con khỉ, loài thảo dƣợc địa quý, có phổ sinh thái rộng đƣợc quan tâm gây trồng phát triển nhiều vùng miền nƣớc Giá trị bật Hoàn ngọc sản phẩm có khả sử dụng để chữa trị bệnh nhƣ tiêu chảy, nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa, bệnh trĩ nội, việm đại tràng mãn tính, cầm máu ngồi da, tiểu đƣờng, ngủ, vảy nến hiệu quả, ngồi lồi cịn đƣợc coi thảo dƣợc chữa trị bách bệnh Tuy nhiên, việc gây trồng quy mơ lớn ln gặp nhiều khó khăn, hạt giống không đủ cung cấp Hơn nữa, nguồn hạt giống cung cấp phần lớn trôi thị trƣờng tự do, khó kiểm sốt đƣợc chất lƣợng nhƣ khả nhiễm bệnh hại khác Vì vậy, chọn tìm nguồn giống tốt, sử dụng kỹ thuật nhân giống thích hợp nhằm nhân nhanh với số lƣợng lớn có chất lƣợng, đồng cần đến công nghệ nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro - kỹ thuật cho hệ số nhân cao, cung cấp bệnh, thời gian ngắn Do đó, đề tài khóa luận với tiêu đề: “Bƣớc đầu nghiên cứu khả nhân giống Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) nuôi cấy in vitro” cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Thành công nghiên cứu tạo sở khoa học cho hồn thiện quy trình nhân giống vơ tính kỹ thuật ni cấy in vitro góp phần cung cấp giống có chất lƣợng, đồng cho nhƣ cầu gây trồng phát triển Hoàn ngọc Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật phƣơng pháp sản xuất hàng loạt từ số mẫu cấy ban đầu, đƣợc thực cách đƣa mẫu cấy từ bên tự nhiên vào ống nghiệm điều kiện vô trùng, dinh dƣỡng nhân tạo có kiểm sốt [7] Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống lĩnh vực ứng dụng có hiệu công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Đây phƣơng pháp nhân giống đại đƣợc thực phịng thí nghiệm nên cịn gọi phƣơng pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với q trình ni cấy điều kiện tự nhiên ống nghiệm (in vivo) 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào (tissue culture) nói chung kỹ thuật nhân giống vơ tính nói riêng dựa vào sở khoa học tính tồn năng, phân hoá, phản phân hoá trẻ hóa [1] 1.1.2.1 Tính tồn tế bào Haberland (1902) lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào chun hố chứa lƣợng thơng tin di truyền (bộ ADN) tƣơng đƣơng với lƣợng thông tin di truyền thể trƣởng thành [17] Vì vậy, điều kiện định tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào Qua ngƣời ta biến tế bào (hoặc mẩu mô) thành thể hồn chỉnh đƣợc ni cấy mơi trƣờng thích hợp có đầy đủ điều kiện cần thiết cho tế bào thực trình phân hố, phản phân hố 1.1.2.2 Sự phân hóa phản phân hóa Tính phân hố tế bào biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hố đảm nhiệm chức khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mơ khác đảm nhiệm chức khác (mô dậu, mô dẫn, mơ bì, mơ khuyết…) nhƣng chúng có nguồn gốc từ tế bào môi sinh trải qua giai đoạn phân hố tế bào để hình thành mơ riêng biệt Tính phản phân hố tế bào: Đó tế bào đƣợc phân hoá thành mô riêng biệt với chức khác nhƣng điều kiện định chúng quay trở trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy quan dinh dƣỡng nhƣ lá, thân…thì giai đoạn tạo mơ sẹo tế bào quay trở trạng thái phôi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan dinh dƣỡng nhƣ lá, thân… trƣớc [7], [17], [18] Về chất phân hố phản phân hố q trình hoạt hố gen, thời điểm trình phát triển thể số gen đƣợc hoạt hoá số gen khác bị ức chế Điều đƣợc xảy theo chƣơng trình đƣợc mã hố cấu trúc phân tử AND [17], [18], [4] Khi nằm thể hồn chỉnh tế bào có ức chế lẫn nhau, nhƣng đƣợc tách rời điều kiện định gen đƣợc hoạt hố dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành thể Đó sở làm tảng cho kỹ thuật ni cấy mơ tế bào 1.1.2.3 Sự trẻ hóa Vào kỷ XVII-XVIII, ngƣời ta cho dòng vơ tính thối hóa theo tuổi trẻ hóa thơng qua sinh sản hạt Song thực tế cho thấy đời sống dịng vơ tính vơ hạn nhƣ sống mơi trƣờng thích hợp liên tục đổi sinh sản sinh dƣỡng Khả tái sinh dấu hiệu quan trọng xác định chuyển giai đoạn từ non trẻ sang trƣởng thành Khả chồi, rễ thành phần khác khác Nuôi cấy phận non trẻ chồi, rễ tốt phận trƣởng thành Vì vậy, việc trẻ hóa biện pháp quan trọng nhân giống sinh dƣỡng 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 1.1.3.1 Điều kiện vô trùng Môi trƣờng để nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đƣờng, vitamin, muối khống…rất thích hợp cho loại nấm vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào nấm vi khuẩn lớn nhiều so với tế bào thực vật, môi trƣờng nuôi cấy cần nhiễm vài bào tử nấm vi khuẩn sau vài ngày đến tuần, tồn bề mặt mơi trƣờng mơ nuôi cấy phủ đầy nhiều loại nấm vi khuẩn Thí nghiệm bị bỏ điều kiện mô nuôi cấy không phát triển chết dần - Vô trùng dụng cụ môi trƣờng nuôi cấy: + Khử trùng ƣớt: + Khử trùng khô (sấy khô): + Màng lọc: + Vô trùng mẫu cấy: - Vô trùng box cấy: 1.1.3.2 Ánh sáng nhiệt độ Sự phát sinh hình thái mơ quan nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng chất lƣợng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trị q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, với đa số lồi thời gian chiếu sáng thích hợp từ 12-18 h/ngày Cƣờng độ ánh sáng yếu tố quan trọng tác động đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, cƣờng độ ánh sáng cao kích thích tạo chồi cƣờng độ ánh sáng thấp hình thành mơ sẹo Nhìn chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy 1000-7000 lux Chất lƣợng ánh sáng ảnh hƣởng tới phát sinh hình thái mô thực vật Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi so với ánh sáng trắng Nếu Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu Các mẫu Hoàn ngọc đƣợc thu hái trực tiếp tự nhiên thƣờng chứa nhiều vi sinh vật dính bám bề mặt (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) Chính cần phải tiến hành làm vi sinh vật cách khử trùng trƣớc thực thí nghiệm tạo mẫu in vitro Trong nhân giống in vitro giai đoạn khử trùng giai đoạn quan trọng, định thành bại giai đoạn Chỉ giai đoạn thành cơng có đƣợc nguồn mẫu có khả tái sinh chồi cho thí nghiệm tiếp sau thực Đối với lồi có cơng thức khử trùng thích hợp khác nhau, nhằm thu đƣợc tỷ lệ mẫu nhƣ tỷ lệ mẫu tái sinh cao Đối với Hoàn ngọc nhận thấy đoạn thân non chƣa hóa gỗ nên cần tìm cơng thức khử trùng phù hợp để vừa đủ làm mẫu mà đảm bảo khả tái sinh chúng Trƣớc thực thao tác khử trùng theo công thức (thực phịng thí nghiệm) thao tác làm bên quan trọng để giảm tỉ lệ mẫu nhiễm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo công thức nhƣ Bảng 3.1, trƣớc tiến hành khử trùng HgCl2 mẫu đƣợc xử lý sơ bên đƣợc khử trùng qua cồn 70 30 giây Mỗi công thức đƣợc nuôi mơi trƣờng dinh dƣỡng MS, có bổ sung 20g/l đƣờng saccharose, 7g/l agar, pH 5,8 Sau tuần nuôi cấy, quan sát theo dõi, kết thu đƣợc đƣợc tổng hợp Bảng 3.1 nhƣ sau 25 Bảng Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu CTTN Thời gian khử trùng (phút) Tổng Lần Lần Tỷ lệ mẫu Tổng số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu tái sinh ̅ V% ̅ V% CT1 90 37,78 13,48 47,97 22,90 CT2 2 90 55,56 6,93 86,11 2,79 CT3 90 73,33 4,55 89,45 2,42 CT4 3 90 88,89 2,17 26,21 12,54 CT5 90 92,22 2,09 4,81 42,13 Số liệu Bảng 3.1 Hình 3.1 cho thấy, dù sử dụng chất khử trùng HgCl2 0,1% nhƣng thời gian khác cho kết khác Khi thời gian khử trùng tăng từ phút lên phút tỷ lệ mẫu khơng bị nhiễm tăng theo tăng từ 37,78 lên 92,22% tƣơng ứng Mặc dù tỷ lệ mẫu tăng theo thời gian khử trùng nhƣng tỷ lệ mẫu tái sinh tăng dần thời gian khử trùng từ đến phút (tăng từ 47,97 đến 89,45%), sau giảm dần từ đến phút (từ 89,45 xuống 4,81%) Nhƣ vậy, rõ ràng xác định thời gian khử trùng phù hợp cần thiết, nhằm thu đƣợc kết tốt (Hình 3.1) Tỷ lệ (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 86,11 89,45 88,89 92,22 73,33 55,56 47,97 37,78 26,21 4,81 CT1 CT2 CT3 Mẫu CT4 CT5 (CTTN) mẫu tái sinh Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng thời gian gian khử trùng đến khả tạo mẫu Hoàn ngọc cho thấy, Ftính (=133,38) > F05 (=3,48) 26 Điều chứng tỏ thời gian khử trùng có ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo mẫu sạch, kết có khác biệt công thức thực nghiệm có ý nghĩa Hình 3.2 Mẫu tái sinh chồi (trái) mẫu không tái sinh (phải) Làm mẫu giai đoạn quan trọng nuôi cấy mô, cần phải tìm cơng thức khử trùng với thời gian phù hợp Vừa phải đảm bảo mẫu không nhiễm nấm, khuẩn, vừa phải đảm bảo mẫu khả tái sinh Tóm lại, nghiên cứu cơng thức khử trùng phù hợp Hồn ngọc cơng thức CT3, theo mẫu đƣợc xử lý cồn 70 30 giây, sau xử lý HgCl2 0,1% phút, chia lần, lần đầu phút Công thức cho tỷ lệ mẫu 73,33% tỷ lệ mẫu tái sinh 89,45% 3.2 Ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi Hoàn ngọc Sau tạo đƣợc mẫu có khả tái sinh việc tìm mơi trƣờng dinh dƣỡng có vai trị quan trọng quy trình ni cấy in vitro Mơi trƣờng nguồn cung cấp dinh dƣỡng khoáng đa vi lƣợng cần thiết cho phát sinh hình thái, sinh trƣởng phát triển mẫu ni cấy Vì nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng giai đoạn sinh trƣởng mẫu nuôi cấy để chọn đƣợc mơi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng phát triển đối tƣợng thí nghiệm cần đƣợc quan tâm Trong nghiên cứu này, thí nghiệm đƣợc bố trí với loại mơi trƣờng gồm ½ MS, MS MS + (*) để nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng 27 đến khả tái sinh chồi Hồn ngọc Mỗi loại mơi trƣờng thí nghiệm đƣợc bổ sung 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose pH= 5,8 Sau tuần nuôi cấy, kết đƣợc thu thập ghi Bảng 3.2 dƣới đây: Bảng Ảnh hƣởng MD đến khả tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi CTTN MD Tổng số mẫu cấy ̅ V% Trạng thái chồi NC1 ½ MS 45 17,78 21,65 + NC2 MS 45 35,56 10,83 ++ NC3 MS + (*) 45 60,00 11,11 +++ Chú thích: (*) 0,5mg/l BAP +++: Trạng thái chồi tốt (chồi mập, khỏe đồng đều); ++: Trạng thái chồi (chồi mảnh, khỏe đồng đều); +: Trạng thái chồi (chồi mảnh, yếu đồng đều); Từ kết Bảng 3.2 Hình 3.3 cho thấy môi trƣờng dinh dƣỡng khác cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi hệ số nhân chồi khác Mơi trƣờng ½ MS cho tỉ lệ tái sinh chồi 17,78%, môi trƣờng MS thông thƣờng cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 35,56%, nhƣng sử dụng môi trƣờng MS + (*) tỷ lệ tăng lên 60%, có khác biệt rõ rệt (Hình 3.3) Tỷ lệ (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 60,00 35,56 17,78 CT1 CT2 CT3 (CTTN) Hình 3.3 Ảnh hƣởng MD đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 28 Kết phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng môi trƣờng tới tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cho thấy, Ftính (=54,60) > F05 (=5,14), chứng tỏ kết có khác biệt cơng thức thực nghiệm có ý nghĩa Hình 3.4 Tái sinh chồi MS + (*) (trái) 1/2MS (phải) Tóm lại, môi trƣờng MS + (*) môi trƣờng dinh dƣỡng cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nghiên cứu trên, nên dùng mơi trƣờng làm môi trƣờng nuôi cấy khởi động 3.3 Ảnh hƣởng chất ĐHST than hoạt tính đến khả tái sinh chồi Hồn ngọc Các chất điều hịa sinh trƣởng (ĐHST) thành phần thiếu đƣợc mơi trƣờng ni cấy in vitro, có vai trị quan trọng định việc xúc tiến bật chồi hay rễ Tuy nhiên, sử dụng loại chất ĐHST nồng độ khác thƣờng cho kết khác Nói cách khác, kết phụ thuộc vào loại chất nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc bổ sung Thơng thƣờng phối hợp hai nhóm chất ĐHST chẳng hạn Cytokinin auxin với tỉ lệ thích hợp thu đƣợc kết tốt với nhiều đối tƣợng nuôi cấy Ngoải ra, số môi trƣờng nuôi cấy bỏ sung thêm Than hoạt tính vào cải thiện tăng trƣởng tế bào nhƣ hấp phụ chất ức chế tăng trƣởng tế bào thực vật, làm giảm q trình oxy hóa phenol hay 29 tích tụ chất gây hóa nâu, thay đổi pH trung bình đến mức tối ƣu, tạo mơi trƣờng tối, mơ điều kiện đất Trong nghiên cứu này, than hoạt tính đƣợc đƣa vào với thành phần hàm lƣợng nhƣ Bảng 3.3 dƣới với mong muốn thu đƣợc kết tốt Bảng 3 Ảnh hƣởng MD có than hoạt tính đến khả tái sinh chồi Thành phần bổ sung CTTN Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi ̅ V% Trạng thái chồi 45 35,56 10,83 + 45 60,00 11,11 ++ 0,2 45 68,89 5,59 ++ 0,2 0,2 45 68,89 5,59 +++ 0,3 0,3 45 86,67 7,69 +++ Kinetin (mg/l) BAP (mg/l) GA3 Than hoạt tính (mg/l) ĐC 0 0 MN1 0,5 MN2 0,3 0,2 MN3 0,3 MN4 0,5 Tổng số mẫu cấy Số liệu Bảng 3.3 hình 3.5 sau thời gian tuần ni cấy cho thấy, chất ĐHST có ảnh hƣởng đến tỷ lệ tái sinh chồi Hoàn ngọc Khi sử dụng nồng độ khác cho kết khác Trong nghiêm cứu cơng thức nghiệm cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao công thức MN4 với tỷ lệ 86,67%, cơng thức đối chứng khơng đƣợc bổ sung chất ĐHST than hoạt tính tỷ lệ 35,56% Rõ ràng việc tìm nồng độ chất ĐHST phù hợp có ý nghĩa việc tăng tỷ lệ mẫu tái sinh chồi hoàn ngọc Trong nghiên cứu có bố trí thí nghiệm có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ nhau, khác cơng thức có bổ sung than hoạt tính, cơng thức cịn lại khơng Nhƣng qua kết Bảng 3.3 nhận thấy than hoạt tính khơng ảnh hƣởng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 30 Tỷ lệ (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 86,67 68,89 68,89 MN2 MN3 60,00 35,56 ĐC MN1 MN4(Cơng thức) Hình 3.5 Ảnh hƣởng MD có than hoạt tính đến tỷ lệ tái sinh chồi Mặt khác, kết kiểm tra thống kê phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng chất ĐHST than hoạt tính đến tỷ lệ tái sinh chồi cho thấy, Ftính (=39) > F05 (=3,48) Điều chứng tỏ rằng, việc thêm chất bổ sung vào môi trƣờng ni cấy có khác biệt rõ rệt khả tái sinh chồi có ý nghĩa Tuy nhiên, kết bƣớc đầu cần có nghiên cứu chuyên sâu hơn, với dải hàm lƣợng rộng nhƣ với nhiều loại mẫu cấy so sánh để thu đƣợc kết xác Song kết bƣớc đầu có ý nghĩa thực tiễn ni cấy Hồn ngọc tạo tiền đề cho nghiên cứu đạt kết cao Hình 3.6 Tái sinh chồi mơi trƣờng ĐC (trái) MN2 (phải) 31 Tƣơng tự theo Bảng 3.3, Hình 3.5 Hình 3.6 cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi tăng dần từ công thức ĐC đến MN4, điều cho thấy nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng có ảnh hƣởng tỷ lệ tái sinh chồi Cơng thức MN2 MN3 có bổ sung chất ĐHST giống nhau, nhƣng qua theo dõi sau đánh giá kết nhận thấy mẫu môi trƣờng MN3 có trạng thái chồi tốt mơi trƣờng MN2 Công thức MN4 cho kết tốt công thức mơi trƣờng cịn lại thí nghiệm Hình 3.7 Tái sinh chồi môi trƣờng MN3 (trái) MN4 (phải) Nhƣ vậy, môi trƣờng đối chứng môi trƣờng MS+ 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose, không bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng khơng bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ tái sinh chồi 35,56%, tỷ lệ thấp, trạng thái chồi in vitro có phần đơi chút Mơi trƣờng MN2 môi trƣờng MS+ 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose + 0,3mg/l kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,2mg/l GA3 cho tỷ lệ tái sinh chồi 68,89%, trạng thái chồi tốt, chồi mập Mơi trƣờng MN3 có cơng thức giống MN2 đƣợc bổ sung thêm 1g/l khơng có khác biệt tỷ lệ tái sinh chồi, khác chồi mơi trƣờng MN3 mập có màu xanh thẫm công thức khác điều kiện nuôi cấy 32 Môi trƣờng MN4 môi trƣờng MS + 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose + 0,5mg/l kinetin + 0,3mg/l BAP + 0,3mg/l GA3 cho tỷ lệ tái sinh chồi 86,67%, trạng thái chồi tốt, chồi cao so với chồi mơi trƣờng khác Tóm lại, mơi trƣờng MN4 có cơng thức mơi trƣờng MS + 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose + 0,5mg/l kinetin + 0,3mg/l BAP + 0,3mg/l GA3 phù hợp thí nghiệm (Hình 3.10) Hình 3.8 Mẫu tái sinh từ chồi ban đầu cấy chuyển vào môi trƣờng MN4 Nghiên cứu cho thấy môi trƣờng MN4 thích hợp so với cơng thức mơi trƣờng khác thí nghiệm Các chồi đủ tiêu chuẩn tiến hành lựa chọn tiếp tục chuyển sang môi trƣờng mới, kích thích tạo cụm chồi cho nhân nhanh hay thúc rễ tạo hoàn chỉnh 33 Chƣơng KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ tất kết nghiên cứu đạt đƣợc phần trên, đề tài khóa luận đến kết luận nhƣ sau: Công thức khử trùng HgCl2 phút, chia lần, lần đầu phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao 89,45% Môi trƣờng dinh dƣỡng MS + 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose + 0,5mg/l BAP, đạt tỷ lệ tái sinh 60,0%, công thức phù hợp cho mẫu tái sinh chồi Môi trƣờng MS + 7g/l agar + 20g/l đƣờng saccharose + 0,5mg/l kinetin + 0,3mg/l BAP + 0,3mg/l GA3 phù hợp cho tái sinh chồi (86,67%) 4.2 Tồn kiến nghị Do thời gian thực khóa luận cịn hạn chế nên quy trình nhân giống Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) chƣa đƣợc hoàn thiện Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm cơng thức cho kết tốt huấn luyện từ mơi trƣờng in vitro ngồi mơi trƣờng Cần có thời gian điều kiện để tiếp tục hoàn thiện nội dung cịn lại quy trình nhân giống Hoàn ngọc 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: D.T Nhựt Công Nghệ Sinh học thực vật.Tập NXB Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh,9-31 (2009) Danh lục loài thực vật Việt Nam tập III, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội H.K Diệu Khảo sát thành phần hóa học Xuân hoa (Pseuderanthemumpalatiferum) Tạp chí Khoa học Trƣờng ĐH Cần Thơ, 9, 232-240 (2008) Lê Trần Bình (1997) Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nông nghiệp Hà Nội Lê Văn Chi (1992) Cách sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng vi lƣợng hiệu cao Nhà xuất Khoa học – kỹ thuật, Hà Nội N.T.T Hằng, P.N Hoang Phát sinh chồi từ ni cấy lóng thân Hồn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Nees)Radik) Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc ĐH Thái Nguyên, 109-112 (2009) Nguyễn Văn Uyển tác giả - Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng – Nhà xuất Nơng nghiệp – TPHCM PGS TS Hồng Vũ Thơ, “Nghiên cứu nhân giống Đinh đũa (Stereospermum colais) phƣơng pháp ni cấy in vitro” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn số 6-2016 PGS.TS Vũ quang Nam- TS Bùi Văn Thắng- TS Nguyễn Văn Việt, “Nhân giống Xạ đen (Celastrus hindsii Benth.) phƣơng pháp ni cấy mơ” Tạp chí khoa học lâm nghiệp số 2-2013 10 Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây cỏ Việt Nam, Quyển III NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh 11 Sách Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập II NXB khoa học kỹ thuật 12 Trần Thị Tuyết Nhung, Phan Ngô Hoang, “Sự phát sinh phôi thể hệ từ mô sẹo Hồn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk)” TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 17, SỐ T2 – 2014 13 TS Bùi Văn Thắng- TS Nguyễn Văn Việt-Cao Thị Việt Nga- Vùi Văn Kiên, “Nhân giống đảng sâm (codonopsis (Blume) Hook F et Thomson) kỹ thuật nuôi cấy” Tạp chí khoa học lâm nghiệp năm 2016 14 TS Bùi Văn Thắng, “Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiforum Thunb.) tuyển chọn tỉnh Hà Tạp chí KH-CN Lâm số 4-2017 15 V.Đ Trúc, P.N Hoang Sự phát sinh chồi từ mơ Hồn ngọc (Pseuderanthemumpalatiferum (Ness) Radlk) Hội nghị Công nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam TP Hồ Chí Minh NXB Khoa học Kỹ thuật, 312 – 316 (2009) 16 Võ Văn Chi, 2012, Từ điển thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học, Hà Nội 17 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005) Công nghệ sinh học (Tập 2), NXB Giáo Dục 18 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005) Sinh lý thực vật, NXB Giáo Dục Tài liệu tiếng anh 19 P.M Giang, H.V Bao and P.T Son.Phytochemical study on Pseuderanthemum palatiferum Journal of Chemistry, 41,115-118 (2003) 20 P.Padee, S Nualkaew, C.Talubmook, S.Sakuljaitrong Hypoglycemic effect of aleaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocin-induced diabetic rats.Journal of Ethnopharmacol 132, 491 – 496 (2010) PHỤ LỤC Bảng số liệu ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi Hoàn ngọc qua lần lặp CTTN Lần 33,33 60,00 73,33 86,67 93,33 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Tỷ lệ mẫu (%) Lần Lần 36,67 43,33 53,33 53,33 70,00 76,67 90,00 90,00 93,33 90,00 Lần 60,00 83,33 90,91 23,08 3,57 Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) Lần 45,45 87,50 90,48 25,93 7,14 Lần 38,46 87,50 86,96 29,63 3,70 Phụ biểu 1: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi Hoàn ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 Count 3 3 Sum 143,9 258,3 268,3 78,63 Average 47,972 86,1111 89,4473 26,2108 Variance 120,7296 5,787037 4,699712 10,79537 CT5 14,42 4,806 4,100063 Source of Variation Between Groups Within Groups SS 16405 292,22 df 10 MS 4101,37 29,2224 F 140,3506 Total 16698 14 ANOVA P-value 9,70647E-09 F crit 3,48 Bảng số liệu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh chồi Hoàn ngọc CTTN Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Lần 13,33 33,33 53,33 Lần 20,00 40,00 60,00 CT1 CT2 CT3 Lần 20,00 33,33 66,67 Phụ biểu 2: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi Hoàn ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 Count 3 Sum 53,33 106,67 Average 17,78 35,56 Variance 14,81 14,81 CT3 180,00 60,00 44,44 Source of Variation Between Groups Within Groups SS 2696,30 148,15 df MS 1348,15 24,69 F 54,60 Total 2844,44 ANOVA P-value 0,00 F crit 5,14 Bảng số liệu ảnh hƣởng chất ĐHST than hoạt tính đến khả tái sinh chồi Hoàn ngọc CTTN Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Lần 33,33 53,33 73,33 66,67 86,67 Lần 40,00 60,00 66,67 73,33 93,33 ĐC MN1 MN2 MN3 MN4 Lần 33,33 66,67 66,67 66,67 80,00 Phụ biểu 3: Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng chất ĐHST than hoạt tính đến tỷ lệ tái sinh chồi Hoàn ngọc Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC MN1 MN2 MN3 Count 3 3 Sum 106,67 180,00 206,67 206,67 Average 35,56 60,00 68,89 68,89 Variance 14,81 44,44 14,81 14,81 MN4 260,00 86,67 44,44 Source of Variation Between Groups Within Groups SS 4160,00 266,67 df 10 MS 1040,00 26,67 F 39 Total 4426,67 14 ANOVA P-value 4,52E-06 F crit 3,48 ... trình nhân giống in vitro 1.1.5 Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro nhân giống trồng 1.1.6 Ƣu điểm nhƣợc điểm phƣơng pháp nhân giống in vitro 1.1.7 Tình hình nghiên cứu ni cấy in vitro. .. VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm nhân giống in vitro 1.1.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy in vitro 1.1.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro. .. với tiêu đề: “Bƣớc đầu nghiên cứu khả nhân giống Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) nuôi cấy in vitro? ?? cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Thành công nghiên cứu tạo sở khoa học