Để nghiên cứu sự đóng góp của miễn dịch sơ cấp và lymphocyte dựa trên miễn dịch kháng lại virus nhiễm trên cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) và đột biến (Rag1 mutant, không có tế bào lymphocyte T và B) được cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, bằng cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá ở các độ tuổi khác nhau và nhiệt độ khác nhau.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHÁC BIỆT TRONG SỰ MẪN CẢM VỚI NOVIRHABDO VIRUS CỦA ZEBRAFISH DÒNG HOANG DẠI VÀ ĐỘT BIẾN VÀ VAI TRÒ CỦA LYMPHOCYTES Nguyễn Ngọc Du1*, Lorelei Ford2, Lora Petri- Hanson2, Larry Hanson2 TĨM TẮT Để nghiên cứu đóng góp miễn dịch sơ cấp lymphocyte dựa miễn dịch kháng lại virus nhiễm cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) đột biến (Rag1 mutant, khơng có tế bào lymphocyte T B) cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá độ tuổi khác nhiệt độ khác Cả hai dòng mẫn cảm cao với SHRV Cá bệnh có biểu lồi mắt, xuất huyết gốc vây thân, vảy dựng Dịng hoang dại có mẫn cảm với virus giảm dần theo độ tuổi Cá tháng tuổi chết nhiều cá tháng tuổi cho cảm nhiễm với virus Nhiệt độ gây ảnh hưởng quan trọng mẫn cảm chủng hoang dại Ở 24°C, tỷ lệ cá chết cao 28°C Trong nuôi cấy tế bào, SHRV có đường cong tăng trường tương tự 20°C, 24°C, 28°C, cho thấy tăng sinh virus không bị ảnh hưởng nhiệt độ thấp Ngược lại, độ tuổi nhiệt độ không cho thấy có ảnh hưởng chủng đột biến (Rag1 mutant) Tỷ lệ chết khác dòng hoang dại đột biến Dòng hoang dại bắt đầu chết từ ngày thứ sau gây nhiễm kéo dài đến ngày thứ 10, dòng đột biến tiếp tục chết vịng tuần tiếp sau Sự khác đáp ứng miễn dịch tế bào natural killer (NK) tế bào T chủng đột biến hoang dại đánh giá thông qua mức biểu interferon gamma (IFNγ) gene từ mẫu thận trước kỹ thuật quantitative reverse transcriptase PCR (qRT PCR) Gene biểu mức thấp lô đối chứng âm tăng mạnh hai dòng cảm nhiễm với SHRV IFNγ tăng 400 lần 100 lần Rag1 mutant nhiệt độ 24°C 28°C; tăng 40 lần 80 lần dòng hoang dại nhiệt độ 24°C 28°C Sự gia tăng mạnh mẽ IFNγ dòng đột biến khuyết lymphocyte chứng tỏ có hoạt động tế bào NK Sự biểu MxA (Myxovirus Resistance gene A) gene gia tăng nhóm khơng gây nhiễm (ngày thứ 8) nhóm có gây nhiễm với virus (ngày thứ ngày thứ 8) Ngoài ra, biểu Blimp- CD40L gene đánh giá ngày thứ 8, thứ thứ sau cơng cường độc, nhiên khơng có khác biệt Kết cho thấy tầm quan trọng miễn dịch sơ cấp việc kiểm soát xâm nhiễm virus thời gian đầu, sau hệ miễn dịch thứ cấp tiêu diệt xâm nhiễm Hơn nữa, độ tuổi nhiệt độ mơi trường có ảnh hưởng lớn đến hệ miễn dịch thứ cấp Các kết giúp cho việc giải thích nhiệt độ lứa tuổi có liên quan đến kháng lại bệnh novirhabdovirus cá Từ khóa: Zebrafish, Rag1, T and B lymphocyte deficient, Snakehead Rhabdovirus, interferon gamma, MxA, Blimp-1, CD40 ligand I ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ miễn dịch cá đáp ứng miễn dịch biết cá trưởng thành Nhiệt độ gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch cá Ở cá mang xanh cá nheo, tế bào T nhạy cảm với nhiệt độ thấp tế bào B có khả chịu nhiệt độ (Cuchens & Clem, 1977), (Miller & Clem, 1984) Ở 10°C, tỷ lệ Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Mississippi State University *Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 67 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II tế bào miễn dịch lớn lymphocytes, granulocytes, macrophages gia tăng cá chép, tế bào lymphocyte nhỏ bị giảm so sánh tỷ lệ tế bào cá nuôi 25°C(Kurata et al., 1995) Nhiệt độ cao làm gia tăng immunoglobulins kháng thể tự nhiên cá tuyết Atlantic, giảm tổng protein huyết hoạt tính kháng protease (Magnadóttir et al., 1999) Ở cá vược sọc, số lượng leukocytes, lymphocytes, monocytes thấp nuôi cá 10ºC so với cá nuôi 18ºC, 24ºC, 29ºC (Hrubec, 1997) Gần đây, cá zebrafish sử dụng mơ hình quan trọng cho nghiên cứu đáp ứng miễn dịch (Yoder et al., 2002) thể mô hình tin cậy nghiên cứu miễn dịch động vật có xương (Trede et al., 2004) Rag1-/mutant zebrafish dòng cá đột biến bị khuyết lymphocytes Ở dòng đột biến, thành phần lymphocytes gồm có tế bào không gây độc (non-cytotoxic cells) tế bào NK (natural killer cells), khơng có tế bào chức T B khơng có T cell receptor biểu mã immunoglubulin cá (Lora PetrieHanson et al., 2009) Dòng cá đột biến gây nhiễm với Edwardsiella ictaluri có bảo hộ miễn dịch, chứng tỏ tế bào NK có vai trị quan trọng việc bảo vệ vật chủ (Hohn & Petrie-Hanson, 2012) Vì miễn dịch thứ cấp chưa phát triển cá giai đoạn nhỏ (Petrie-Hanson & Ainsworth, 2001) (Petrie-Hanson & Ainsworth, 1999) (Lam et al., 2004) xâm nhiễm virus phổ biến cá giai đoạn nhỏ, mong muốn xác định xem thành phần tế bào lympho hệ thống miễn dịch có vai trị đề kháng với xâm nhiễm virus độ tuổi khác Hơn nữa, liên quan việc đề kháng virus nhiệt độ mơ tả cá hồi Do mong muốn xác định xem việc đề kháng virus cá có liên quan đến nhiệt độ có phải điều hịa lymphocytes hay khơng Trong nghiên cứu này, chúng tơi dùng SHRV làm mơ hình cho novirhabdovirus virus nhạy zebrafish nhiệt độ thích hợp để virus tăng 68 sinh nằm khoảng nhiệt độ thích hợp cho phát triển zebrafish Hơn nữa, đánh giá biểu số gene chọn lọc có liên quan đến đáp ứng miễn dịch nhằm xác định cách zebrafish trả lời lại xâm nhiễm novirhabdovirus vào thể II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị dịch gốc SHRV SHRV có nguồn gốc từ ATCC nuôi môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma- Aldrich Co., MO) bổ sung thêm 10% FCS (Fetal calf serum, Biowest, Nuaille, France), 100 đơn vị Penicillin/ 100 µg of Streptomycin (Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc, MA), 4mM Glutamine (Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc, MA), nuôi cấy 28°C quan sát 80% tượng bệnh lý tế bào (CPE) Thu hoạch tế bào có chứa virus ly tâm 200 xg phút Dịch có chứa virus chia vào ống giữ -80°C sử dụng Dùng ống để chuẩn độ, sử dụng điã 96 giếng chứa tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini) Quan sát CPE xác định nồng độ nhiễm tế bào 50% (TCID50) phương pháp Reed Muench (Reed & Muench, 1938) 2.2 Zebrafish thí nghiệm cảm nhiễm Cá dùng cảm nhiễm dòng Tubingen hoang dại đột biến Rag1 mutant có xuất xứ từ tế bào nên gene mang tính đồng (L Petrie-Hanson et al., 2009) Tất cá cho sinh sản chăm sóc trại ni cá với hệ thống kiểm sốt khơng có mầm bệnh đặc biệt (SPF) đại học bang Mississippi, khoa thú y Tất thí nghiệm cảm nhiễm thực bể nhựa 40 lít hình trụ, hệ thống nước chảy liên tục Cá quan sát hàng ngày cho ăn vừa đủ thức ăn viên Để gây nhiễm xử lý, cá gây mê trong100 mg/L MS222 tiêm với 10µL huyền dịch kim tiêm syringe Cá hấp hối chết vớt đếm Theo dõi thí nghiệm cá ngừng chết Cá hấp hối lấy mẫu phân lập TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II lại SHRV dịng tế bào EPC Não cá cấy thạch máu, ủ nhiệt độ phòng để kiểm tra, loại trừ tác nhân gây chết cá vi khuẩn 2.3 Thí nghiệm liên quan độ tuổi Zebrafish 2, 4, tháng tuổi dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm thực bể hình trụ 40 lít có hệ thống nước chảy liên tục Cá thí nghiệm cho sinh sản thời gian để hai dòng cá hoang dại đột biến có độ tuổi, 15 cá/ bể Trong suốt thời gian thí nghiệm, cá trì 24°C Cá cảm nhiễm cách tiêm xoang bụng với 10µL SHRV liều khác 100,5,101,5, 102,5, 103,5, 104,5 TCID50 Nhóm đối chứng tiêm với mơi trường ni cấy 2.4 Thí nghiệm liên quan đến nhiệt độ Sử dụng cá có độ tuổi tháng tuổi hai dòng cá (hoang dại đột biến) Nhiệt độ mơi trường trì 24°C, 28°C ± 0.5°C tuần trước tiến hành cảm nhiễm Cá bố trí thí nghiệm tương tự thí nghiệm trì nhiệt độ theo yêu cầu thí nghiệm 2.5 Đường cong tăng trưởng SHRV SHRV tăng sinh tế bào EPC MOI 10 đĩa 24 giếng Một sau hấp phụ 4°C, tế bào rửa ba lần với 1X PBS 1mL môi trường nuôi cấy bổ sung vào giếng ủ nhiệt độ khác 20°C, 24°C, 28°C Mẫu lấy thời điểm khác 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96 h Lặp lại lần thời điểm lấy mẫu Toàn tế bào có chứa virus dịch ni cấy giếng thu, đông lạnh -80°C sau rã đơng, lặp lại lần để phá vỡ hết tế bào Ly tâm 500 xg/ phút Dịch thu được dùng cho chuẩn độ Dịch virus pha loãng 10 lần theo dãy nồng độ, sau cấy ủ tế bào EPC đĩa 96 giếng 28°C Theo dõi CPE ngày thứ Tính TCID50 phương pháp Reed - Muench (Reed & Muench, 1938) 2.6 Tinh RNA Mỗi dịng cá chia làm nhóm Mỗi nhóm cảm nhiễm với 100,5 TCID50 SHRV, nhóm đối chứng tiêm với môi trường nuôi cấy Thu mẫu thận cá nhóm vào ngày 0, 2, 4, sau gây nhiễm Mẫu thận sử dụng cho tách chiết RNA Mẫu giữ tri-reagent đồng chày nghiền mẫu Kont Dịch đồng dùng để tách chiết RNA Zymo kit theo hướng dẫn nhà sản xuất (Zymo Research Corp., CA) Mẫu giữ -80°C dùng để tổng hợp cDNA Cũng phương pháp này, số lượng cá dòng hoang dại bổ sung thêm để lấy mẫu sau cá vaccine với 100,5 TCID50 sau tiêm lần với 102,5 TCID50 SHRV ngày 14 Mẫu thận lấy riêng cho cá (6 cá nhóm) ngày sau tiêm lần 2.7 Tổng hợp cDNA kỹ thuật qPCR 200 ng RNA tổng dùng để tổng hợp cDNA SuperScript III First Strand Synthesis (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc., MA) theo hướng dẫn nhà sản xuất, dùng mồi ngẫu nhiên hexamer cDNA giữ -20° C Mồi mẫu dò thử nghiệm biểu gene ghi bảng 1, mồi mẫu dò cho interferon γ (IFN γ) acidic ribosomal protein (ARP- dùng làm gene tham khảo) cơng bố (Vojtech et al., 2009), mồi mẫu dị cho SHRV, Myxovirus resistance gene A (MxA) thiết kế phần mềm Beacon designer (Premier Biosoft, CA) Mồi mẫu dò Blimp-1 dùng từ TaqMan Gene expression assays (AB applied biosystems, CA), CD40 ligand dùng từ PrimePCR probe assays SsoAdvanced universal probes supermix (Biorad, CA), với mẫu PCR chuẩn cho CD40 ligand Phản ứng Real-time PCR thực máy Stratagene MX 3005P theo chu trình: chu kỳ 50ºC phút, chu kỳ 95 ºC 10 phút, 40 chu kỳ 95 ºC 15 giây 61ºC phút (đối với ARP, IFNγ, MxA) Chu trình cho Blimp-1 (1 chu kỳ 50ºC phút, chu kỳ 95ºC 10 phút, 40 chu kỳ 95ºC 15 giây 60ºC phút) CD40 ligand (1 chu kỳ 95ºC phút, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 69 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 40 chu kỳ 95ºC giây 60ºC 30 giây) Mức độ biểu gene đánh giá phương pháp Pfaffl dùng cho định lượng real-time PCR (Pfaffl, 2001) Bảng Mồi mẫu dò dùng qPCR Gene Primers/ Probes ARP Forward Reverse Probe IFNγ Forward Reverse Probe SHRV Forward MxA qPCR primers and probes Sequence (5’ → 3’) CTG CAA AGA TGC CCA GGG A NM_131580 TTG GAG CCG ACA TTG TCT GC TTC TGA AAA TCA TCC AAC TGC TGG ATG ACT ACC CTT TCC AGG CAA GAG TGC AGA NM_212864 TCA GCT CAA ACA AAG CCT TTC G ACC GCT ATG GGC GAT CAA GGA AAA CGA C CATCCCTGTCCCGTTGATTCTC NC_000903.1 Reverse TACCAATGCCCTCTATGCTTTCC Probe Forward Reverse Probe CCTGGCTCCTTGCTGGGTCTCTGGC GCATCATTAGTTCAGACAGTCG AAATTATCGATAGTGTCGATACAAG TGCTGACTGAACGTGTAACTCAACT 2.8 Phân tích thống kê Sử dụng ANCOVA SPSS phiên 22 (IBM corp., NY) để so sánh chuyển động đường cong tăng trưởng SHRV thời điểm khác Bonferroni’s test Biểu gene so sánh twoway ANOVA với Bonferroni’s test Sự khác biệt có ý nghĩa nhóm giá trị p < 0,05 III KẾT QUẢ 3.1 Thí nghiệm cảm nhiễm nhiệt độ Cả hai dịng cá nhạy cảm với SHRV Cá bệnh có biểu lồi mắt, xuất huyết gốc vây thân, vảy dựng Ở dòng hoang dại, cá chết bắt đầu vào ngày thứ sau tiêm kéo dài đến ngày thứ 10 Ở dòng đột biến, cá tiếp tục chết sau tuần Cá chết diễn có khác biệt hai dịng cá tùy thuộc vào độ tuổi nhiệt độ môi trường ni (Hình 1) Điều đáng ý dịng hoang dại, cá mẫn cảm với SHRV 24°C cá có sức đề kháng tốt 28°C 70 GenBank accession no NM_182942.4 Điều không xảy dịng đột biến, chí cá chết nhiều 28°C so với 24°C 3.2 Thí nghiệm khác biệt độ tuổi Khi so sánh hai dòng đột biến hoang dại tháng tuổi 24°C ± 0,5°C, cá chết tương tự Tỷ lệ chết dòng đột biến 76% hoang dại 73,4%, so sánh khơng có khác biệt (p > 0,05) (Hình 2) Ở cá tháng tuổi, dịng đột biến giữ tỷ lệ chết cao (66,8%), dòng hoang dại giảm chết đáng kể (7,8%) với khác biệt có ý nghĩa (p = 0,012) (Hình 3) Kết tương tự cá tháng tuổi, với tỷ lệ chết cao dòng đột biến (86%), có 10% dịng hoang dại, khác biệt có ý nghĩa (p = 0,004) (Hình 4) Ở dịng đột biến, độ tuổi cá không ảnh hưởng đến nhạy cảm cảm nhiễm với virus Khơng có liên quan tuổi cá với liều lượng SHRV gây nhhiễm (p = 0,295) khơng có khác biệt thống kê nhóm 2, 4, tháng tuổi (Hình 2; 3; 4) Hơn nữa, việc TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II so sánh theo cặp cá tháng tuổi, tháng tuổi, tháng tuổi khơng cho thấy khác biệt có ý nghĩa (p =1, p = 0,727, p = 0,267, tương ứng) Ở dịng hoang dại, độ tuổi có ảnh hưởng quan trọng đến nhạy cảm với SHRV (Hình 2; 3; 4) có tương quan độ tuổi tỷ lệ chết cá (p= 0,032) Hơn nữa, khác biệt số (độ tuổi) thể cá chết có khác biệt độ tuổi khác (p = 0,009) So sánh cặp cho thấy tỷ lệ chết khác biệt cá hoang dại tháng tuổi, tháng tuổi (p < 0,01) không khác biệt cá tháng (p = 1) Hình 1: Đường cong sống sót dịng đột biến hoang dại sau cảm nhiễm với SHRV 102,5TCID50 Cá thí nghiệm tháng tuổi, trì 24°C (hình trái) 28°C (hình phải) cho thấy dòng hoang dại cá ngưng chết dòng đột biến cá tiếp tục chết thêm thời gian Hình 2: Cá chết liên quan đến độ tuổi Tỷ lệ chết gia tăng tăng liều gây nhiễm cá tháng tuổi, nhiệt độ mơi trường 24°C Dịng đột biến (xanh biển), dịng hoang dại (xanh cây) LD50 dòng đột biến 100,9 TCID50, LD50 dòng hoang dại 101,11 TCID50 Hình 3: Cá chết liên quan đến độ tuổi Tỷ lệ chết gia tăng tăng liều gây nhiễm cá tháng tuổi, nhiệt độ mơi trường 24°C Dịng đột biến (xanh biển), dòng hoang dại (xanh cây) LD50 dòng đột biến 100,9 TCID50, LD50 dịng hoang dại lớn 104,5 TCID50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 71 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4: Cá chết liên quan đến độ tuổi Tỷ lệ chết gia tăng tăng liều gây nhiễm cá tháng tuổi, nhiệt độ mơi trường 24°C Dịng đột biến (xanh biển), dòng hoang dại (xanh cây) LD50 dòng đột biến 100,3 TCID50, LD50 dòng hoang dại lớn 104,5 TCID50 3.3 Nhiệt độ Không có ảnh hưởng nhiệt độ lên nhạy cảm với SHRV dòng đột biến tháng tuổi (Hình 5) Tỷ lệ chết 66,8% 84% 24°C 28°C, tương ứng tương quan nhiệt độ nhạy cảm với SHRV tương tự dòng đột biến (p > 0,05) Ở dòng hoang dại, tỷ lệ chết 7,8% 1,2% 24ºC 28ºC (Hình 6) Tỷ lệ chết có khác biệt đáng kể cá trì 24ºC 28ºC (p = 0,009) sau cảm nhiễm với virus nồng độ khác So sánh cặp cho khác biệt có ý nghĩa hai nhiệt độ (p = 0,005) Hình 5: Cá chết liên quan đến nhiệt độ Dịng đột Hình 6: Cá chết liên quan đến nhiệt độ Dòng biến tháng tuổi, thí nghiệm thực 24ºC hoang dại tháng tuổi, thí nghiệm thực (màu vàng) 28ºC (màu đỏ) 24ºC (màu vàng) 28ºC (màu đỏ) 3.4 Đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng theo dõi 96 để đánh giá ảnh hưởng nhiệt 72 độ lên chép SHRV (Hình 7) Khơng có khác biệt tương tác thời gian nhiệt độ (p = 0,977) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 7: Đường tăng trưởng SHRV dòng tế bào EPC 20ºC, 24ºC, 28ºC 3.5 Biểu gene Để đánh giá hoạt hóa chế bảo vệ, mức độ biểu IFNγ MxA xác định Hơn nữa, Blimp-1 dùng để đánh giá biệt hóa tế bào plasma CD40 ligand thăm dò để đánh giá hoạt hóa tế bào CD4+T Mẫu thận cá thể cá nhóm thu riêng rẽ ngày thứ 0, 2, 4, sau vaccine với SHRV ngày thứ 1, sau gây nhiễm (lần thứ cách lần thứ 14 ngày) Two- way ANOVA SPSS dùng để phân tích biểu gene 3.6 Interferon gamma Ở dòng đột biến, biểu IFNγ xảy cao ngày thứ sau vaccine nhanh chóng giảm ngày (Hình 8) Ở 24°C, biểu IFNγ cao so với biểu gene 28°C (trên 400 lần 24°C 100 lần 28°C) Nhiệt độ thời gian xâm nhiễm có ảnh hưởng lên mức biểu IFNγ (p = 0,004 p < 0,001) Ngồi ra, khơng có khác biệt biểu IFNγ cá không cảm nhiễm với virus Tương tự dòng đột biến, dòng hoang dại biểu IFNγ gia tăng ngày thứ sau vaccine, sau giảm nhanh ngày Ngược lại với dòng đột biến, biểu gene 28°C cao 24°C Mức độ biểu tăng 40 lần 24°C 80 lần 28°C Khơng có khác biệt thay đổi mức độ biểu gene nhiệt độ môi trường ni khác (p > 0,05) (Hình 8) Hình 8: Biểu IFNγ dòng độ biến dòng hoang dại ngày sau cá vaccine với SHRV sau cảm nhiễm lần TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 73 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.7 B lymphocyte- induced maturation protein - (Blimp-1) Sự gia tăng Blimp-1 liên quan đến tế bào plasma thị cho hoạt hóa hệ miễn dịch thứ cấp, chúng tơi đánh giá biểu Blimp-1 ngày thứ sau vaccine ngày thứ 1, sau cảm nhiễm để đánh giá xem biểu gene có tương quan với kháng virus xảy dịng hoang dại trì cá 28°C 24°C hay khơng Khơng có khác biệt có ý nghĩa biểu gene Blimp-1 dịng đột biến khơng cảm nhiễm với virus 24°C Ở 28°C, biểu gene có gia tăng ngày ngày (4,1 3,5 lần) so với ngày 0, nhiên khơng có khác biệt có ý nghĩa Nhiệt độ cao có ảnh hưởng đến biểu Blimp-1 (p = 0,044) Ở dịng đột biến có gây nhiễm với SHRV, biểu Blimp-1 khơng rõ ràng Đối với dịng hoang dại, khơng có khác biệt biểu gene Blimp-1 cá không gây nhiễm Ở cá gây nhiễm với SHRV, Blimp-1 có biểu giảm nhẹ ngày thứ (0,4 24°C 0,3 28°C) gia tăng ngày thứ sau cảm 74 nhiễm lần 2, nhiên khơng có khác biệt đáng kể (Hình 9) 3.8 CD40 ligand Sự tương tác CD40- CD40 ligand quan trọng việc phát triển đáp ứng miễn dịch CD40 ligand thị cho việc tế bào CD40+ T hoạt hóa Trong nghiên cứu này, chúng tơi mong nuốn xác định xem có biểu CD40L dòng hoang dại sau gây nhiễm với SHRV ngày thứ ngày thứ sau lần gây nhiễm thứ hay khơng Sự biểu gene thị cho phát triển đáp ứng miễn dịch thứ cấp thể cá Ở dòng đột biến không gây nhiễm với virus, biểu CD40L gia tăng ngày thứ sau gây nhiễm (p < 0,01) (14,1 7,5 lần 24°C 28°C) Ở lơ có gây nhiễm với SHRV, CD40L gia tăng đáng kể ngày thứ (13,7 6,2 24°C 28°C) Tương tự dòng hoang dại, CD40L tăng biểu ngày thứ (11 6,6 lần 24°C 28°C) Tuy nhiên, CD40L giảm biểu ngày ngày sau cảm nhiễm lần (Hình 10) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 9: Biểu Blimp-1 dòng đột biến hoang dại khơng gây nhiễm với virus (hình trên) có gây nhiễm với SHRV (hình dưới) sau lần cảm nhiễm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 75 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 10: Biểu CD40 ligand dịng đột biến hoang dại khơng gây nhiễm virus (hình trên) có gây nhiễm virus (hình dưới) sau lần cảm nhiễm 3.9 MxA Khi so sánh biểu MxA gene cá không cảm nhiễm, MxA tăng đáng kể hai dòng vào ngày thứ (mean_mutant 7,46, mean_WT = 8,49 at 24°C; mean_mutant = 8,21, mean_WT = 9,33 at 28°C) (p < 0,01) Ở cá có 76 cảm nhiễm SHRV, MxA gia tăng mạnh từ ngày thứ (mean_mutant = 11,2, mean_WT = 13,9) 24°C, sau giảm dần mức cao (Hình 11) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 11: Biểu MxA dòng đột biến hoang dại khơng gây nhiễm virus (hình trên) có gây nhiễm virus (hình dưới) sau lần cảm nhiễm IV THẢO LUẬN Zebrafish dùng mơ hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn virus Hơn nữa, công bố gần cho thấy dòng zebrafish đột biến Rag1 mơ hình động vật phù hợp cho nghiên cứu đáp ứng miễn dịch khuyết tế bào T B lymphocytes (Hohn & Petrie-Hanson, 2012) Trong nghiên cứu này, chúng tơi nhận thấy zebrafish khuyết lymphocytes có cách chết tương tự dòng cá hoang dại ngày đầu bị xâm nhiễm virus, sau dịng hoang dại hồi phục cịn dịng đột biến khơng Điều giải thích độ trễ hệ miễn dịch trả lời miễn dịch mắc phải phải nhận biết kháng nguyên đặc hiệu Ở dòng hoang dại, cá tháng tuổi có nhạy cảm với SHRV tương tự dòng đột biến Rag1 Điều bổ sung cho nghiên cứu khác cho thấy miễn dịch dựa lymphocytes hoạt động yếu giai đoạn đầu phát triển Hơn nữa, chúng tơi nhận thấy dịng hoang dại nhạy cảm với SHRV 24°C 28°C Ở dòng đột biến khuyết lymphocytes khơng cho thấy có nhạy cảm khác biệt cá nhiệt độ khác nhau, tăng sinh virus tế bào khơng có khác biệt đáng kể nhiệt độ khác Việc kết hợp liệu cho thấy đề kháng virus liên quan đến yếu tố nhiệt độ cá chức thành phần lymphocytes hệ thống miễn dịch cá Độ tuổi cơng bố có liên quan đến đáp ứng miễn dịch cá vược sọc lai (Hrubec et al., 2004) Độ tuổi ảnh hưởng đến thông số huyết học sinh hoá cá hồi vân Oncorhynchus mykiss (Charoo, 2014) Những nghiên cứu ảnh hưởng độ tuổi đến miễn dịch thứ cấp chuột cho thấy kích cỡ động nhóm tế bào B gia tăng với tuổi (Cancro & Smith, 2003) Nhiệt độ có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch cá nheo (Ainsworth et al., 1991) Tổng số B T lymphocyte bị giảm mẫu thận trước cá nuôi 10°C Tế bào T thấy nhạy cảm với nhiệt độ thấp tế bào B TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 77 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II cá mang xanh cá nheo (Cuchens & Clem, 1977), (Miller & Clem, 1984) Các công bố cho thấy cấu trúc protein thay đổi cá nuôi nhiệt độ khác với nhiệt độ cho sản xuất kháng thể (Fields, 2001) (Somero, 2004) Proteins glucides, thành phần màng plasma tế bào, bị ảnh hưởng nhiệt độ môi trường (Sharon & Lis, 1989) Nghiên cứu leukocytes cá chép cho thấy glucides nhạy cảm với nhiệt độ, dẫn đến việc làm thay đổi cấu trúc chức màng plasma (Le Morvan et al., 1998) Tế bào NK nhóm thuộc lymphocytes có khả nhận biết tiêu diệt tế bào nhiễm virus tế bào bị biến đổi Trong nghiên cứu này, quan tâm đến trả lời thành phần tế bào cá bị nhiễm virus giai đoạn nhỏ Vì IFNγ sản xuất tế bào NK cytotoxic T lymphocytes, việc đánh giá mức biểu gene dùng để đánh giá hoạt động tế bào lymphocytes cá Kết nghiên cứu cho thấy IFNγ gene tăng biểu dòng đột biến hoang dại sau gây nhiễm với virus Sự gia tăng biểu IFNγ dòng đột biến khuyết lymphocyte chứng tỏ có hoạt động tế bào NK Do đó, chúng tơi kết luận miễn dịch sơ cấp đóng vai trò quan trọng việc tiêu diệt virus giai đoạn đầu xâm nhiễm Blimp-1 có vai trị quan trọng biệt hoá tế bào plasma (Turner et al., 1994) (Lin et al., 2000) (Shapiro-Shelef et al., 2003) Trong thí nghiệm này, chúng tơi mong đợi Blimp-1 có biểu gene mạnh dòng cá hoang dại sau nhiễm với SHRV Tuy nhiên điều không xảy ra, mơ thận khơng phải nơi phát triển tế bào plasma zebrafish mà mô lách Sự tương tác CD40- CD ligand (CD40L CD154) có vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch tế bào T (Noelle et al., 1992) (Lane et al., 1992) CD40L có chức truyền tín hiệu cho tế bào T helper để hoạt hoá tế bào B (Noelle et al., 1992) CD40 ligand 78 biểu tế bào CD4 T hoạt hoá số tế bào miễn dịch khác (van Kooten & Banchereau, 2000) Trong thí nghiệm này, biểu CD40L không mong đợi, chí miễn dịch thứ cấp Điều tế bào T helper trưởng thành (mature Th cells) diện mơ thận Sự biểu gene MxA gia tăng cá sau hai ngày gây nhiễm cá, dòng hoang dại cao so với dịng đột biến MxA biết có vai trò kháng virus ởngười phụ thuộc chặt chẽ vào biểu interferon dạng I dạng III (Haller et al., 1980) Ở cá Selegalese sole, phân tử Mx có mức biểu cao thời điểm 48 sau gây nhiễm với sole aquabirnavirus (Fernandez-Trujillo et al., 2008) Mx gene gia tăng cá hồi cho nhiễm với virus (Saint-Jean & Perez-Prieto, 2007) Điều giải thích kết chúng tơi MxA gia tăng biểu sau cảm nhiễm với virus giúp thể cá tiêu diệt virus V KẾT LUẬN Dòng cá hoang dại đột biến khuyết lymphocyte sử dụng mô hình để nghiên cứu bệnh novirhabdovirus cá để đánh giá vai trị lymphocyte Ở thí nghiệm cảm nhiễm, cá chết tương tự hai dòng cá vào giai đoạn đầu sau ngày, dòng hoang dại có khả kháng với virus cá dòng đột biến tiếp tục chết Độ tuổi nhiệt độ môi trường nuôi ảnh hưởng đến phát triển bệnh dịng hoang dại khơng có ảnh hưởng lên dòng đột biến Dòng hoang dại nhạy cảm với virus 24°C đề kháng 28°C Sự khác biệt tăng sinh virus thay đổi nhiệt độ khác đường cong tăng trưởng virus nhiệt độ 20°C, 24°C, 28°C Nhiệt độ liên quan đến cách phát triển bệnh dòng hoang dại cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả tiêu diệt virus tế bào T B Trong thí nghiệm liên quan đến độ tuổi, tỷ lệ chết cao xảy dòng hoang dại tháng tuổi, thấp cá tháng tuổi, nhiên khơng có khác TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II biệt dịng đột biến Điều chứng tỏ giai đoạn nhỏ, hệ miễn dịch dòng hoang dại chưa phát triển đầy đủ để bảo vệ cá khỏi công tác nhân gây bệnh, cá tháng tuổi, hệ miễn dịch phát triển đủ để phản ứng lại xâm nhiễm bên Ngược lại, dịng đột biến khơng có tế bào B T khơng có khả miễn dịch giai đoạn nhỏ lớn, thành phần tế bào khác tương tự hai dòng cá Các gene liên quan đến đáp ứng miễn dịch khảo sát hai dòng cá Mức độ biểu IFNγ tăng cao hai dòng ngày sau cảm nhiễm với virus sau giảm dần Ở dòng đột biến, biểu IFNγ cá nuôi nhiệt độ 24°C cao 28°C (trên 400 lần 24°C 100 lần 28° C), dòng hoang dại, IFNγ biểu cao 28° C so với 24°C (40 lần 24°C so với 84 lần 28°C) Điều giải thích cho việc 24°C, dịng đột biến có tỷ lệ chết thấp 28°C Sự gia tăng TÀI LIỆU THAM KHẢO Ainsworth, A J., Dexiang, C., Waterstrat, P R., & Greenway, T (1991) Effect of temperature on the immune system of channel catfish (Ictalurus punctatus) I Leucocyte distribution and phagocyte function in the anterior kidney at 10 degrees C Comp Biochem Physiol A Comp Physiol, 100(4), 907-912 Alter, G., Malenfant, J M., Delabre, R M., Burgett, N C., Yu, X G., Lichterfeld, M., Altfeld, M (2004) Increased natural killer cell activity in viremic HIV-1 infection J Immunol, 173(8), 5305-5311 Bryceson, Y T., & Long, E O (2008) Line of attack: NK cell specificity and integration of signals Curr Opin Immunol, 20(3), 344-352 doi: 10.1016/j.coi.2008.03.005 Cancro, M P., & Smith, S H (2003) Peripheral B cell selection and homeostasis Immunol Res, 27(2-3), 141-148 doi: 10.1385/ir:27:2-3:141 Charoo, Samina Qadir; Salman Rauoof; Qureshi, T.A (2014) Rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss) Journal of Science and Technology, 9(2), 29 Cuchens, Marvin A., & Clem, L William (1977) Phylogeny of lymphocyte heterogeneity: II IFNγ cho thấy tế bào NK hoạt hóa dịng đột biến giai đoạn đầu xâm nhiễm, miễn dịch sơ cấp có vai trò quan trọng việc bảo vệ vật chủ khỏi cơng virus Thêm vào đó, MxA, protein kháng virus, có biểu cao hai dòng cá sau gây nhiễm với SHRV Biểu gene mã hóa cho Blimp-1 CD40 ligand, gene thị cho hoạt hóa đáp ứng miễn dịch thứ cấp, kiểm tra Các gene kiểm tra ngày sau cảm nhiễm virus vào cá Đây thời gian lượng cá chết giảm dần dịng hoang dại, từ đánh giá xem kháng virus cá có liên quan đến hoạt hóa lymphocyte hay khơng Tuy nhiên gia tăng biểu gene thị khơng có nhiều khác biệt Điều lymphocyte chiếm lượng nhỏ mẫu thận dùng kiểm tra (có thể mơ lách cho kết tốt hơn) thời gian lấy mẫu sớm so với đáp ứng miễn dịch cá Differential effects of temperature on fish T-like and B-like cells Cell Immunol, 34(2), 219-230 doi: http://dx.doi.org/10.1016/00088749(77)90245-3 Degli-Esposti, M A., & Smyth, M J (2005) Close encounters of different kinds: dendritic cells and NK cells take centre stage Nat Rev Immunol, 5(2), 112-124 doi: 10.1038/nri1549 Dexiang, C., & Ainsworth, A J (1991) Effect of temperature on the immune system of channel catfish (Ictalurus punctatus) II Adaptation of anterior kidney phagocytes to 10 degrees C Comp Biochem Physiol A Comp Physiol, 100(4), 913-918 Doody, G M., Stephenson, S., & Tooze, R M (2006) BLIMP-1 is a target of cellular stress and downstream of the unfolded protein response Eur J Immunol, 36(6), 1572-1582 doi: 10.1002/ eji.200535646 Fernandez-Trujillo, A., Ferro, P., Garcia-Rosado, E., Infante, C., Alonso, M C., Bejar, J., Manchado, M (2008) Poly I:C induces Mx transcription and promotes an antiviral state against sole aquabirnavirus in the flatfish Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup) Fish Shellfish Immunol, 24(3), 279-285 doi: 10.1016/j.fsi.2007.11.008 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 79 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Fields, Peter A (2001) Review: Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 129(2–3), 417-431 doi: http:// dx.doi.org/10.1016/S1095-6433(00)00359-7 Garcia, J F., Roncador, G., Garcia, J F., Sanz, A I., Maestre, L., Lucas, E., Piris, M A (2006) PRDM1/BLIMP-1 expression in multiple B and T-cell lymphoma Haematologica, 91(4), 467-474 Gong, Y F., Xiang, L X., & Shao, J Z (2009) CD154CD40 interactions are essential for thymusdependent antibody production in zebrafish: insights into the origin of costimulatory pathway in helper T cell-regulated adaptive immunity in early vertebrates J Immunol, 182(12), 77497762 doi: 10.4049/jimmunol.0804370 Gray, D., Siepmann, K., van Essen, D., Poudrier, J., Wykes, M., Jainandunsing, S., Dullforce, P (1996) B-T lymphocyte interactions in the generation and survival of memory cells Immunol Rev, 150, 45-61 Gyory, Ildiko, Wu, Jian, Fejer, Gyorgy, Seto, Edward, & Wright, Kenneth L (2004) PRDIBF1 recruits the histone H3 methyltransferase G9a in transcriptional silencing Nat Immunol, 5(3), 299-308 Haller, O., Arnheiter, H., Lindenmann, J., & Gresser, I (1980) Host gene influences sensitivity to interferon action selectively for influenza virus Nature, 283(5748), 660-662 Hilleman, M R (2004) Strategies and mechanisms for host and pathogen survival in acute and persistent viral infections Proc Natl Acad Sci U S A, 101 Suppl 2, 14560-14566 doi: 10.1073/ pnas.0404758101 Hohn, C., & Petrie-Hanson, L (2012) Rag1/- mutant zebrafish demonstrate specific protection following bacterial re-exposure PLoS One, 7(9), e44451 doi: 10.1371/journal pone.0044451 Hrubec, T C., Ward, D., Smith, S A., & Robertson, J L (2004) Age related changes in humoral immune response of hybrid striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis) Vet Immunol Immunopathol, 101(1-2), 103-108 doi: 10.1016/j.vetimm.2004.04.020 Kurata, Osamu, Okamoto, Nobuaki, Suzumura, Eri, Sano, Natsumi, & Ikeda, Yayoi (1995) Accommodation of carp natural killer-like cells to environmental temperatures Aquaculture, 80 129(1–4), 421-424 doi: http://dx.doi org/10.1016/0044-8486(94)00282-S Lam, S.H., Chua, H.L., Gong, Z., Lam, T.J., & Sin, Y.M (2004) Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study Dev Comp Immunol, 28, 9-28 Lane, P., Traunecker, A., Hubele, S., Inui, S., Lanzavecchia, A., & Gray, D (1992) Activated human T cells express a ligand for the human B cell-associated antigen CD40 which participates in T cell-dependent activation of B lymphocytes Eur J Immunol, 22(10), 25732578 doi: 10.1002/eji.1830221016 Le Morvan, C., Troutaud, D., & Deschaux, P (1998) Differential effects of temperature on specific and nonspecific immune defences in fish J Exp Biol, 201(Pt 2), 165-168 Lin, K I., Lin, Y., & Calame, K (2000) Repression of c-myc is necessary but not sufficient for terminal differentiation of B lymphocytes in vitro Mol Cell Biol, 20(23), 8684-8695 Magnadóttir, Bergljót, Jónsdóttir, Halla, Helgason, Sigurður, Bjưrnsson, Bjưrn, Jørgensen, Trond Ø, & Pilström, Lars (1999) Humoral immune parameters in Atlantic cod (Gadus morhua L.): I The effects of environmental temperature Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 122(2), 173-180 doi: http://dx.doi.org/10.1016/ S0305-0491(98)10156-6 Miller, N W., & Clem, L W (1984) Temperaturemediated processes in teleost immunity: differential effects of temperature on catfish in vitro antibody responses to thymus-dependent and thymus-independent antigens J Immunol, 133(5), 2356-2359 Montoya, C J., Velilla, P A., Chougnet, C., Landay, A L., & Rugeles, M T (2006) Increased IFNgamma production by NK and CD3+/CD56+ cells in sexually HIV-1-exposed but uninfected individuals Clin Immunol, 120(2), 138-146 doi: 10.1016/j.clim.2006.02.008 Noelle, R J., Roy, M., Shepherd, D M., Stamenkovic, I., Ledbetter, J A., & Aruffo, A (1992) A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells Proc Natl Acad Sci U S A, 89(14), 6550-6554 O’Leary, J, Mahmoud, G, Drayton, D, & Andrian, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Uv (2006) T cell- and B cell-independent adaptive immunity mediated by natural killer cells Nat Immunol, 7, 507 - 516 Page, D M., Wittamer, V., Bertrand, J Y., Lewis, K L., Pratt, D N., Delgado, N., Traver, D (2013) An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish Blood, 122(8), e1-11 doi: 10.1182/ blood-2012-12-471029 Paust, S., Senman, B., & von Andrian, U H (2010) Adaptive immune responses mediated by natural killer cells Immunol Rev, 235(1), 286-296 doi: 10.1111/j.0105-2896.2010.00906.x Petrie-Hanson, L., & Ainsworth, A J (2001) Ontogeny of channel catfish lymphoid organs Vet Immunol Immunopathol, 81(1-2), 113-127 Petrie-Hanson, L., & Ainsworth, A.J (1999) Humoral immune responses of channel catfish (Ictalurus punctatus) fry and fingerlings exposed to Edwardsiella ictaluri.Fish and Shellfish Immunology, 9, 579-589 Petrie-Hanson, L., Hohn, C., & Hanson, L (2009) Characterization of rag1 mutant zebrafish leukocytes BMC Immunol, 10(1), doi: 14712172-10-8 [pii] 10.1186/1471-2172-10-8 Petrie-Hanson, Lora, Hohn, Claudia, & Hanson, Larry (2009) Characterization of rag1 mutant zebrafish leukocytes BMC Immunology, 10(1), Pfaffl, Michael W (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR Nucleic Acids Research, 29(9), e45-e45 Reed, L.J., & Muench, H (1938) A simple method of estimating fifty per cent endpoints American Journal of Epidemiology, 27(3), 493-497 Reusch, J A., Nawandar, D M., Wright, K L., Kenney, S C., & Mertz, J E (2015) Cellular differentiation regulator BLIMP1 induces Epstein-Barr virus lytic reactivation in epithelial and B cells by activating transcription from both the R and Z promoters J Virol, 89(3), 17311743 doi: 10.1128/jvi.02781-14 Saint-Jean, S R., & Perez-Prieto, S I (2007) Effects of salmonid fish viruses on Mx gene expression and resistance to single or dual viral infections Fish Shellfish Immunol, 23(2), 390400 doi: 10.1016/j.fsi.2006.11.012 Shapiro-Shelef, M., Lin, K I., McHeyzer-Williams, L J., Liao, J., McHeyzer-Williams, M G., & Calame, K (2003) Blimp-1 is required for the formation of immunoglobulin secreting plasma cells and pre-plasma memory B cells Immunity, 19(4), 607-620 Sharon, N., & Lis, H (1989) Lectins as cell recognition molecules Science, 246(4927), 227-234 Somero, George N (2004) Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic “strategies” Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 139(3), 321-333 doi: http://dx.doi.org/10.1016/j cbpc.2004.05.003 Son, B K., Roberts, R L., Ank, B J., & Stiehm, E R (1996) Effects of anticoagulant, serum, and temperature on the natural killer activity of human peripheral blood mononuclear cells stored overnight Clin Diagn Lab Immunol, 3(3), 260-264 Sun, J C., Beilke, J N., & Lanier, L L (2009) Adaptive immune features of natural killer cells Nature, 457(7229), 557-561 doi: 10.1038/ nature07665 Trede, NS, Langenau, DM, Traver, D, Look, AT, & Zon, LI (2004) The use of zebrafish to understand immunology Immunity, 20, 367 - 379 Turner, C A., Jr., Mack, D H., & Davis, M M (1994) Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells Cell, 77(2), 297-306 van Kooten, C., & Banchereau, J (2000) CD40CD40 ligand J Leukoc Biol, 67(1), 2-17 Vojtech, L N., Sanders, G E., Conway, C., Ostland, V., & Hansen, J D (2009) Host immune response and acute disease in a zebrafish model of Francisella pathogenesis Infect Immun, 77(2), 914-925 doi: 10.1128/IAI.01201-08 Wang, R., Jaw, J J., Stutzman, N C., Zou, Z., & Sun, P D (2012) Natural killer cell-produced IFN-gamma and TNF-alpha induce target cell cytolysis through up-regulation of ICAM-1 J Leukoc Biol, 91(2), 299-309 doi: 10.1189/ jlb.0611308 Wienholds, E., Schulte-Merker, S., Walderich, B., & Plasterk, R H (2002) Target-selected inactivation of the zebrafish rag1 gene Science, 297(5578), 99-102 Yoder, J A., Nielsen, M E., Amemiya, C T., & Litman, G W (2002) Zebrafish as an immunological model system Microbes Infect, 4(14), 1469-1478 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 81 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II DIFFERENTIAL SUSCEPTIBILITY OF WILD-TYPE AND T AND B LYMPHOCYTE DEFICIENT ZEBRAFISH INFECTED WITH A NOVIRHABDO VIRUS REVEALS THE ROLE OF LYMPHOCYTES Nguyen Ngoc Du1*, Lorelei Ford2, Lora Petri- Hanson2, Larry Hanson2 ABSTRACT In order to study the contribution of innate defenses and lymphocyte based immunity in protection against a primary viral infection in fish, wild-type and Rag1 mutant zebrafish (T and B lymphocyte deficient) were infected with a novirhabdovirus, Snakehead Rhabdovirus (SHRV), by intraperitoneal (IP) injection at different ages and temperatures Both strains of fish were highly susceptible to SHRV Diseased fish demonstrated exophthalmia, hemorrhaged fin bases and protruding scales The susceptibilities of the wild-type decreased as the fish aged; 2-month post hatch fish had significantly more losses than month old and month old fish Also, temperature had a significant effect on the susceptibility of the wild-type The wild-type zebrafish held at 24°C had significantly higher mortality than those held at 28°C In cell culture, SHRV had similar growth kinetics at 20°C, 24°C, and 28°C suggesting that reduced virus replication was not a factor in the lower mortality The age and temperature effects were not seen with the Rag1 mutants There was a difference in mortality pattern between the wild-type and Rag1 mutant All mortalities in the wild-type occurred between day and 10 post-infection, whereas the Rag1 mutant fish continued to die for at least one more week To assess differences in the response of NK and T-cells of Rag1 mutant and wild-type zebrafish we evaluated transcript levels of the interferon gamma (IFNγ) gene in the posterior kidney by quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) Expression was low in un-exposed fish but increased substantially in both strains at day after exposure to SHRV IFNγ over 400-fold and 100-fold in Rag1 mutant at 24°C and 28°C, respectively; and over 40-fold and 80-fold in wild-type at 24°C and 28°C, respectively The strong IFNγ response in lymphocyte deficient fish suggests Natural Killer cell activation MxA (Myxovirus Resistance gene A) expression also increased in non- infected zebrafish (at day 8) and in SHRV- infected fish (both strains) at day and day We attempted to evaluate the initial activation of the acquired responses by evaluating of Blimp-1 and CD40 ligand expression at day 8, and at day and day after a second challenge, but no significant induction was detected at this early time point The infection data suggest that innate immunity is important in controlling virus infection early during the infection, but then the acquired immune system clears the infection Furthermore, age and the environmental temperature have a strong effect on this acquired immune response These results may help explain the temperature and age associated resistance observed in other novirhabdovirus diseases in fish Keywords: Zebrafish, Rag1, T and B lymphocyte deficient, Snakehead Rhabdovirus, interferon gamma, MxA, Blimp-1, CD40 ligand Người phản biện: TS Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 11/12/2017 Ngày thông qua phản biện: 25/12/2017 Ngày duyệt đăng: 30/12/2017 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2 Mississippi State University *Email: ngocduaqua@yahoo.com 82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 ... dịng hoang dại nhạy cảm với SHRV 24°C 28°C Ở dòng đột biến khuyết lymphocytes khơng cho thấy có nhạy cảm khác biệt cá nhiệt độ khác nhau, tăng sinh virus tế bào khác biệt đáng kể nhiệt độ khác. .. khơng có khác biệt biểu IFNγ cá không cảm nhiễm với virus Tương tự dòng đột biến, dòng hoang dại biểu IFNγ gia tăng ngày thứ sau vaccine, sau giảm nhanh ngày Ngược lại với dòng đột biến, biểu... 24°C Dòng đột biến (xanh biển), dòng hoang dại (xanh cây) LD50 dòng đột biến 100,3 TCID50, LD50 dòng hoang dại lớn 104,5 TCID50 3.3 Nhiệt độ Khơng có ảnh hưởng nhiệt độ lên nhạy cảm với SHRV dòng