Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nghiên cứu truyền thống kết hợp với phương pháp nghiên cứu hiện đại để xác định tỷ lệ nhiễm, một số đặc tính sinh vật học, xác định gene sản sinh độc tố của vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi đang tiêu thụ tại một số chợ trong thành phố Lào Cai, từ đó làm cơ sở đề xuất các giải pháp khống chế nhằm bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm góp phần nâng cao bảo vệ sức khỏe con người.
ISSN: 1859-2171 e-ISSN: 2615-9562 TNU Journal of Science and Technology 202(09): 205 - 211 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA Ở THỊT LỢN TIÊU THỤ TẠI THÀNH PHỐ LÀO CAI Nguyễn Quang Tính1*, Nguyễn Văn Giang2 Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên Chi cục Kiểm dịch động vật Lào Cai TÓM TẮT Nghiên cứu sử dụng phương pháp nghiên cứu truyền thống kết hợp với phương pháp nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm, số đặc tính sinh vật học, xác định gene sản sinh độc tố vi khuẩn Salmonella thịt lợn tươi tiêu thụ số chợ thành phố Lào Cai, từ làm sở đề xuất giải pháp khống chế nhằm bảo đảm an tồn vệ sinh thực phẩm góp phần nâng cao bảo vệ sức khỏe người Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella 17,28%, mẫu không đạt vệ sinh an tồn thực phẩm; tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella vào thời điểm lấy mẫu ngày có khác rõ rệt theo thời gian lấy mẫu sau giết mổ; chủng vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt lợn có tính sinh hóa học đặc trưng, điển hình, có độc lực mạnh gây chết 100% chuột thí nghiệm sau thời gian 48 gây nhiễm; vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt mẫn cảm với số loại kháng sinh mang thử; xác định 5/5 chủng Salmonella dương tính với gene Stn, InvA chiếm 10% khơng có chủng mang yếu tố DT104 Từ khóa: Đặc tính sinh học, thịt lợn, Lào Cai, Vi khuẩn Salmonella Ngày nhận bài: 08/7/2019; Ngày hoàn thiện: 27/7/2019; Ngày đăng: 29/7/2019 STUDY BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF SALMONELLA ORIGINATED FROM PORKS IN LAO CAI CITY Nguyen Quang Tinh1*, Nguyen Van Giang2 University of Agriculture and Forestry - TNU Animal Quarantine Department of Lao Cai Province ABSTRACT Biological characteristics and genes related to creation of toxology of Salmonella in raw porks at the markets in Lao Cai were determined based on traditional methods as well as advanced method, such as molercular biological method in order to prevent the infection of Salmonella in pork and control food sacurity Firstly, the results of this study shown that, the ratio of pork infected Salmonella was 17.28% and all the samples were not quality assureance Secondly, the proportion of pork infected Salmonella depend on the sampling time after slaughter In addition, all Salmonella strains isolated from pork have specific biochemical characteristics, with strong virulence causing 100% of rats' death after 48 hours of infection Besides that, they were very sensitive with some tested antibiotics Last but not least, this study determined 5/5 strains (100%) were positive with gene Stn, InvA, but no strain was responded with the factor DT104 Keywords: Biological characteristics; Pork; Lao Cai; Salmonella Received: 08/7/2019; Revised: 27/7/2019; Published: 29/7/2019 * Corresponding author Email: nguyenquangtinh@tuaf.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 205 Nguyễn Quang Tính Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Giới thiệu Hiện vấn đề ô nhiễm thực phẩm hay thực phẩm khơng an tồn tồn xã hội đặc biệt quan tâm Thực phẩm có nguồn gốc từ động vật không đảm bảo chất lượng như, thịt nhiễm bụi bẩn, nhiễm vi khuẩn trình giết mổ, vận chuyển, bày bán chợ vấn đề nóng xã hội Theo số liệu thống kê tổ chức Nông lương giới (FAO) tổ chức Y tế giới (WHO), số bệnh nhân ngộ độc thịt có đến gần 90% thịt bị nhiễm bẩn nhiễm khuẩn q trình giết mổ, có 10% thịt gia súc bị bệnh Điều chứng tỏ rằng, trình giết mổ gia súc chế biến thịt cịn nhiều sai phạm Qua lý giải hàng năm có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm nhiễm vi sinh vật độc tố chúng sinh thịt Theo Cynthia A Roberts (2001) [1] cho biết, có số vi sinh vật có khả gây ngộ độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm, gây tỷ lệ tử vong cao Listeria monocytogen, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella Lào Cai năm đón triệu du khách nước đến thăm quan, với gần triệu dân 25 dân tộc anh em nên có nhiều điều kiện thuận lợi sản xuất tiêu thụ sản phẩm chăn nuôi, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Lào Cai ngày trở nên cấp thiết quan tâm đặc biệt Hiện cơng tác vệ sinh an tồn thực phẩm cấp quyền đặc biệt quan tâm, đạo, kết hoạt động cịn nhiều hạn chế, tình trạng nhiễm từ khâu chăn nuôi đến giết mổ, chưa giải triệt để Xuất phát từ tình hình thực tế trên, thực đề tài Phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung Nghiên cứu ô nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn số chợ thành phố Lào Cai gồm: xác định tiêu vi 202(09): 205 - 211 khuẩn Salmonella nhiễm thịt lợn tươi, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn theo thời gian lấy mẫu, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tươi theo tháng lấy mẫu; giám định số đặc tính sinh vật, hóa học, gene quy định sản sinh độc tố, độc lực, tính mẫn cảm với kháng sinh số chủng vi khuẩn Salmonella phân lập (5 chủng thử là: S - CL08, S - CL25, S - ND01, S - ND34, S - KT35) 2.2 Nguyên liệu Các mẫu thịt lợn tươi lấy thời điểm khác thành phố Lào Cai; môi trường thông thường môi trường chế biến sẵn dạng tổng hợp, hóa chất dùng để nhuộm Gram; hóa chất dùng để thử phản ứng sinh hóa; thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm để thực phản ứng PCR, giấy tẩm kháng sinh, chuột thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu;phương pháp xác định tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí thịt lợn - Phương pháp phát Salmonella: xác định tiêu vi khuẩn Salmonella thịt lợn, xác định tiêu vi khuẩn Salmonella phân lập được; xác định độc lực chủng vi khuẩn phân lập theo Quinn P J (1994) [2]; xác định gene quy định sản sinh độc tố đường ruột chủng vi khuẩn Salmonella phương pháp PCR; xác định tính mẫn cảm với số loại kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập theo Quinn.P.J (1994) [2] Kết bàn luận Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella số địa bàn thành phố Lào Cai trình bày bảng Bảng Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tươi Địa điểm (chợ) Cốc Lếu Nguyễn Du Kim Tân Tính chung 206 Số mẫu kiểm tra 45 39 36 120 Số mẫu nhiễm 21 Tỷ lệ (%) 20,0 17,95 13,89 17,28 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Nguyễn Quang Tính Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 205 - 211 Trong 120 mẫu thịt lợn thu thập, có 17,28% số mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella Cụ thể: Tại chợ Cốc Lếu: Kiểm tra 45 mẫu thịt lợn thấy có mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 20,0% Tại chợ Nguyễn Du, kiểm tra 39 mẫu thịt lợn có mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 17,95% Tại chợ Kim Tân, có 5/36 mẫu thịt lợn kiểm tra nhiễm vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 13,89% Kết nghiên cứu cao với công bố Phùng Văn Mịch (2008) [3], cho biết, có 12,5% mẫu thịt thu thập số lò mổ thuộc tỉnh Quảng Ninh dương tính với vi khuẩn Salmonella Bảng Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella theo thời gian sau giết mổ Thời gian sau giết mổ Chợ Cốc Lếu Nguyễn Du Kim Tân Tính chung Số mẫu kiểm tra 15 13 12 40 - 3h Số mẫu (+) 2 Tỷ lệ (%) 13,33 15,38 8,33 12,34 Số mẫu kiểm tra 15 13 12 40 - 10h Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) 26,67 23,08 16,67 22,14 Bảng Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn theo tháng lấy mẫu Tháng năm Tháng - 10 Chợ Cốc Lếu Nguyễn Du Kim Tân Tính chung Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) 15 26,67 13 23,08 12 25,00 40 10 24,91 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt theo thời gian sau giết mổ trình bày bảng Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella vào thời điểm sau giết mổ có khác rõ rệt Tỷ lệ nhiễm khuẩn Salmonella mẫu thịt lợn thu thập sau giết mổ từ - 10h 22,14% - 3h 12,34% Cụ thể: Trong tổng số 40 mẫu thu thập sau giết mổ từ - 3h, có mẫu nhiễm Salmonella, chiếm tỷ lệ 12,34% Trong đó, mẫu thịt lợn thu thập chợ Nguyễn Du có tỷ lệ nhiễm cao (15,38%) so với mẫu thu thập chợ Kim Tân (8,33%) Trong 40 mẫu thịt lợn thu thập sau giết mổ từ - 10h, có mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 22,14% Trong đó, mẫu thịt lợn thu thập chợ Cốc Lếu có tỷ lệ nhiễm 26,67%; sau đến chợ Nguyễn Du (23,08%) thấp chợ Kim Tân (16,67%) http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Tháng 12 - 01 15 13,33 13 7,70 12 8,33 40 9,78 Tháng 4–5 15 20,00 13 15,39 12 16,67 40 17,35 Sở dĩ có chênh lệch tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn theo thời gian lấy mẫu do: Thời gian giết mổ lợn thường diễn vào lúc sáng sớm (3 - giờ), nên thời điểm lấy mẫu cách thời điểm giết mổ khoảng - tiếng vào buổi sáng - 12 tiếng vào buổi chiều tối Thời gian bày bán bảo quản không yêu cầu kỹ thuật tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật nói chung vi khuẩn Salmonella nói riêng sinh trưởng phát triển Mức độ nhiễm khuẩn phụ thuộc lớn vào phương thức bảo quản thân thịt Ngoài ra, điệu kiện vệ sinh khu vực xung quanh quầy bán thịt, dụng cụ sử dụng (cân, dao, thớt…) yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ cường độ nhiễm khuẩn thân thịt Vào buổi sáng, mức độ nhiễm khuẩn có thấp so với buổi chiều song tỷ lệ 207 Nguyễn Quang Tính Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN cao (12,34%) Buổi sáng, thịt giết mổ, cơng đoạn q trình giết mổ chồng chéo lên Hơn việc thọc tiết, làm lòng, pha lọc thịt thực chỗ dẫn đến khơng đảm bảo vệ sinh Ngồi ra, dao cạo lơng, làm lịng khơng khử trùng lại dùng để pha thịt, dụng cụ chứa đựng thịt bẩn q trình vận chuyển khơng đảm bảo yêu cầu Điều phù hợp với nhận định Trần Thị Hạnh cs (2009) [4] cho rằng, lò mổ mắt xích quan trọng có nguy cao gây ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ, mức độ ô nhiễm tùy thuộc vào điều kiện vệ sinh sở giết mổ, hoạt động, thao tác giết mổ FAO (1994) [5] cho biết, trang thiết bị, dụng cụ phục vụ giết mổ không đảm bảo vệ sinh nguyên nhân làm ô nhiễm vi sinh vật vào thịt Từ mơi trường lị mổ bao gồm trang thiết bị giết mổ, từ tay cơng nhân giết mổ có nhiều loại vi khuẩn, nấm mốc nấm men, vi khuẩn Salmonella Chính vi khuẩn nhiễm bẩn vào thịt qua giết mổ, pha chế, vận chuyển, bầy bán bảo quản thịt Kết phù hợp với nghiên cứu Đào Thị Thanh Thủy (2012) 202(09): 205 - 211 [6], tỷ lệ thịt lợn nhiễm Salmonella vào buổi sáng cao so với buổi chiều Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt theo tháng lấy mẫu trình bày bảng Mẫu thịt lợn thu thập từ tháng - 10 tháng - nhiễm vi khuẩn Salmonella cao so với mẫu thu thập từ tháng 12 - 01 Tỷ lệ nhiễm có khác tháng lấy mẫu rõ rệt Cụ thể: 40 mẫu thu thập từ tháng - 10, có 10 mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella Trong đó, có 26,67% số mẫu thu thập chợ Cốc Lếu; 23,08% số mẫu thu thập chợ Nguyễn Du 25,00% số mẫu thu thập chợ Kim Tân nhiễm Salmonella Trong 40 mẫu thu thập từ tháng 12 - 01, có 4/40 mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella (chiếm 9,78%) Trong đó, tỷ lệ mẫu dương tính cao chợ Cốc Lếu (13,33%), sau đến chợ Kim Tân (8,33%) thấp chợ Nguyễn Du (7,7%) Từ tháng - 5, thu thập 40 mẫu chợ nghiên cứu thấy có mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella (17,35%) Trong đó, tỷ lệ nhiễm cao chợ Cốc Lếu (20,0%), sau đến chợ Kim Tân (16,67%) thấp chợ Nguyễn Du (15,39%) Bảng So sánh mức độ nhiễm Salmonella thịt với tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm theo TCVN 7046:2009 Địa điểm (chợ) Cốc Lếu Nguyễn Du Kim Tân Số mẫu kiểm tra (n) 45 39 36 Số mẫu không đạt TCVN (n) Tỷ lệ (%) 20,00 17,95 13,89 Chỉ tiêu cho phép (CFU/25g) 0 Mức độ nhiễm Salmonella thịt với tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm theo TCVN trình bày bảng Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella thu thập chợ Cốc Lếu, Nguyễn Du Kim Tân vượt tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm 13,89 - 20,00% Trong 120 mẫu kiểm tra, có 21 mẫu khơng đạt tiêu cho phép số lượng vi khuẩn Salmonella so sánh với TCVN 7046, 2009 [7] quy định khơng phép có mặt vi khuẩn Salmonella sản phẩm thịt tươi (0 CFU/25g) Cụ thể: chợ Cốc Lếu, có 9/45 mẫu khơng đạt tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm, chiếm tỷ lệ 20,00% Tại chợ Nguyễn Du, có 7/39 mẫu khơng đạt tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm, chiếm tỷ lệ 17,95% Tại chợ Kim Tân, có 5/36 mẫu khơng đạt tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm, chiếm tỷ lệ 13,89% Kết cao so với công bố Đào Thị Thanh Thủy (2012) [6] tác giả cho biết có 14,8% số mẫu thịt lợn thu thập Thành phố Thái Nguyên không đạt tiêu vi khuẩn Salmonella theo Tiêu chuẩn Việt Nam 7046, 2002 [4] Kết xác định số đặc tính sinh vật, hóa học vi khuẩn trình bày bảng Vi khuẩn Salmonella phân lập bắt màu Gram (-), có khả lên men glucose, dương tính với phản ứng catalase có khả sản sinh H2S (100%) Các chủng vi khuẩn âm tính với phản ứng oxidase, lactose, sản sinh urease indol có khả di động Như vậy, chủng Salmonella phân lập thể đặc tính sinh vật, hóa 208 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Nguyễn Quang Tính Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN học đặc trưng giống Salmonella phù hợp với đặc điểm hình thái, ni cấy vi khuẩn, đặc tính sinh hóa mà số tác giả khác cơng bố (Lê Huy Chính, 2007) [8] Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn Salmonella phân lập trình bày bảng Sau thời gian 48h cơng cường độc, có 15/16 chuột tiêm canh khuẩn qua phúc xoang chết, chiếm tỷ lệ 93,75%; Có chủng gây chết 50 - 100% số chuột 24 48h Chủng S - CL43 có độc lực mạnh, gây chết 100,0% số chuột vòng 12 giờ, chuột cịn lại chết sau 24 - 72h cơng cường độc Chuột chết có biểu bụng chướng to, lưng đen Mổ khám chuột chết quan sát bệnh tích thấy, nơi tiêm phát sinh thủy thũng, gan, lách sưng, tụ máu, ruột chướng hơi, viêm ruột Phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm (máu tim, gan, lách, ruột non ) chuột chết cho kết dương tính với Salmonella Lê Huy Chính (2007) [8] cho 202(09): 205 - 211 biết, người nhiễm độc Salmonella có thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 đến 48 Sau thời gian ủ bệnh, bệnh nhân có sốt, nôn ỉa chảy, người lớn, rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ đến ngày tự khỏi Một số bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn, kéo dài nhiều tháng Một số loài Salmonella gây nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn người lớn lại gây tình trạng bệnh lý nặng trẻ nhỏ trẻ sơ sinh nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm xương Vì vậy, độc lực chủng Salmonella phân lập từ thịt lợn khu chợ nghiên cứu tình trạng báo động sức khỏe tính mạng người tiêu dùng Kết phù hợp với công bố Đào Thị Thanh Thủy (2012) [6], sau 24 - 48h kể từ công cường độc, vi khuẩn Salmonella gây chết 87,5% số chuột thí nghiệm Bảng Kết xác định số đặc tính sinh vật, hố học vi khuẩn Salmonella phân lập Một số đặc tính sinh vật, hóa học Tính chất bắt màu Gr (-) Tính di động Phản ứng oxidase Lên men glucose Lên men lactose Sản sinh urease Khả dung huyết Sản sinh indole Phản ứng catalase Đặc điểm sản sinh H2S Kết xác định Số lượng chủng giám định Số chủng dương tính (+) 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 Tỷ lệ (%) 100 100 0,0 100 0,0 0,0 0,0 0,0 100 100 Bảng Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn Salmonella phân lập Ký hiệu chủng S - CL08 S – CL25 S - CL43 S - ND01 S - ND23 S - ND34 S - KT06 S - KT35 Vị trí tiêm Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Phúc xoang Liều tiêm (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Số chuột tiêm 2 2 2 2