THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN

THỬGIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN TÀI LIỆU THAM KHẢO Hội đồng Dược điển Việt Nam (2009), Dượcđiển Việt Nam 4, phụ lục 13.6 – Thử giới hạnnhiễm khuẩn, tr. PL258266 British pharmacopoeia Commision (2014),British pharmacopoeia 2014, Appendix VI BTestfor Microbial Contamination The United State of America PharmacopeiaCommision (2014), The United StatesPharmacopeia 37, Vol 1, and . MỤC ĐÍCH Đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm,Enterobacteria có khả năng sống lại được Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh có trong thuốc: Enterobacteria S. aureus P. aeruginosa Salmonella sp. E. coli C. albicans. Tụ cầu vàngTrực khuẩn mủ xanhVi khuẩn đường ruộtgây bệnhVi khuẩn đại tràngNấm sinh dụcGIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CHO PHÉP ĐỐI VỚI THUỐCDĐVN 4Mức Loại chế phẩm Yêu cầu1 Các chế phẩm dùng cho bỏng vàcác vết loét sâuKhông có các vi sinh vật có thể sống lại được trong 1 g(ml) mẫuthử2 Các chế phẩm dùng tại chỗ nhưchữa sưng tấy, tổn thương và cácmàng nhày (mũi, họng, tai, âmđạo...) Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 100 trong 1g(ml) Mẫu thử phải không có Enterobacteria, P. aeruginosa, S.aureus, nấm trong 1 g(ml)3 Các chế phẩm dùng tại chỗ choda như kem bôi, nước thơm, dầu,dung dịch, bột... Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 500 trong 1g(ml) Mẫu thử phải không có Enterobacteria, P. aeruginosa, S.aureus, nấm trong 1 g(ml)4 Các chế phẩm dùng uống, quatrực tràng, thấm qua da Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 104trong 1g(ml) Tổng số Enterobacteria không quá 500 trong 1 g(ml) Tổng số nấm không quá 100 trong 1 g(ml) Mẫu thử phải không có E. coli, Salmonella sp., P. aeruginosa, S.aureus trong 1 g(ml)5 Các chế phẩm có chứa cácnguyên liệu có nguồn gốc thựcvật, động vật không thể xử lýtheo qui trình làm giảm số lượngvi khuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 5x104trong1 g(ml) Tổng số Enterobacteria không quá 500 trong 1 g(ml) Tổng số nấm không quá 500 trong 1 g(ml) Mẫu thử phải không có E. coli, Salmonella sp., P. aeruginosa, S.aureus trong 1 g(ml)GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CHO PHÉP ĐỐI VỚI THUỐCBP 2014ĐỐI TƯỢNG ÁP DỤNG Các thuốc có nguồn gốc từ DL: bao gồm tất cả cácdạng bào chế (viên nén, nang cứng, nang mềm…), cácloại đường dùng (uống, dán, dùng ngoài da…) Các thuốc có nguồn gốc sinh học: men, chế phẩmprobiotics... Các thuốc có TP là thuốc tân dược nếu: Thuốc uống dạng dung dịch (nước, dầu) Thuốc dùng ngoài da Thuốc dùng cho niêm mạc: âm đạo, nhỏ mũi... Thuốc có dạng bào chế là viên nang mềmYÊU CẦU VỀ PTN Thao tác với mẫu: Biosafety cabinet BSC(bảo vệ người, mẫu, môi trường thí nghiệm) Phòng đặt BSC: nên đạt class D (theo phânloại của WHO)Biosafety cabinet (BSC)THIẾT BỊ CẦN THIẾT Tủ an toàn sinh học class II (BSC) 02 Nồi hấp Tủ nuôi cấy (02 loại: 3035oC; 2025oC) Tủ sấy (160oC) Máy lắc Vortex (dùng cho ống nghiệm) Máy lắc cơ học (đồng nhất mẫu) Kính hiển vi (có vật kính dầu) Bơm chân không Cân kĩ thuật ± 0,01gNồi hấp tiệt trùng (Autoclave)Tủ nuôi cấy (Oven)Máy lắc cơ họcMáy lắc ống nghiệmDỤNG CỤ CẦN THIẾT Đĩa petri đường kính 10,0 cm Pipet thủy tinh các loại Micropipet các loại Bộ phễu lọc chuyên dụng Màng lọc mix cellulose kích thước lỗ lọc khôngquá 0,45 µm (0,45 µm0,22 µm) Panh, kéo, que cấy, đèn cồnChú ý: Tất cả dcụ phải được tiệt trùng theo qtrìnhđã được thẩm địnhMÔI TRƯỜNG Đếm TS VK hiếu khí: Mtr thạch casein đậu tương Đếm tổng số nấm: Mtr thạch Sabouraud có bổ sungcloramphenicol Tăng sinh tìm VSV gây bệnh: Mtr lỏng caseinsoyabean XĐ Enterobacteria: Mtr lỏng EnterobacteriaMossel Mtr thạch muối mật violetred Tìm E. coli: Mtr MacConkey Mtr thạch Levine Eosin xanh methylenMÔI TRƯỜNG Tìm S. aureus: Mtr thạch muốimanitol Tìm P. aeruginosa: Mtr thạch Cetrimid Mtr thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin Mtr thạch pseudomonas để phát hiện pyocyanin Tìm Salmonella sp. Mtr lỏng tetrathionat Mtr xanh brilliant Mtr thạch Bismuth sulfit Mtr thạch sắt 3 đườngHÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ Natri clorid Pepton Kali dihydrophosphat Dung dịch tím tinh thể (có sẵn) Dung dịch iod (có sẵn) Dung dịch Safranin (có sẵn) Cồn tuyệt đối Nước oxy già 310% Huyết tương thỏ hoặc ngựa Thuốc thử Ehrlich Kovacs (có sẵn) N,Ndimethylphenylen diamin dihydrocloridKIT SINH HÓA (BIO MÉRIEUX) API 20 E: XĐ E. coli, Salmonella sp. API 20 NE: XĐ P. aeruginosa API 20 Staph: XĐ S. aureus API 20C AUX: XĐ C. albicansCHỦNG VI SINH VẬT CHUẨN Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacilus subtilis ATCC 6633 Aspergilus niger ATCC 16404 Candida albicans ATCC 10231 Escherichia coli ATCC 8739 Salmonella enterica subsp. entericaserovar Typhimurium ATCC 14028 Tần suất: mỗi lần pha chế Các chỉ tiêu: Độ vô khuẩn: ủ ở 3035oC3 ngày, tiếp tục ủ2025oC5 ngày pH Khả năng kích thíchức chế vi sinh vậtKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNGKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG ĐẾM TS VSVVi sinh vật Chuẩn bịchủng vi sinhvậtKtra chất lượng mtr Ktra sự phù hợp của PPĐếm TS VKhiếu khíĐếm TSnấmĐếm TS VKhiếu khíĐếm TSnấmS. aureusATCC 6538NCIMB 9518CIP 4.83NBRC 13276Mtr thạchcasein đậutương hoặcmtr lỏngcasein đậutương30–35 oC18–24 giờMtr thạchcasein đậutương hoặcmtr lỏngcasein đậutương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngày Mtr thạchcasein đậutươngMPNmtr lỏngcasein đậutương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngàyP. aeruginosaATCC 9027NCIMB 8626CIP 82.118NBRC 13275Mtr thạchcasein đậutương hoặcmtr lỏngcasein đậutương30–35 oC18–24 giờMtr thạchcasein đậutương hoặcmtr lỏngcasein đậutương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngày Mtr thạchcasein đậutươngMPNmtr lỏngcasein đậutương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngàyKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG ĐẾM TS VSVVi sinh vật Chuẩn bị chủngvi sinh vậtKtra chất lượng mtr Ktra sự phù hợp của PPĐếm TS VK HK Đếm TS nấm Đếm TS VK HK Đếm TS nấmB. subtilisATCC 6633NCIMB 8054CIP 52.62NBRC 3134Mtr thạchcasein đậu tươnghoặc mtr lỏngcasein đậu tương30–35 oC18–24 giờMtr thạch caseinđậu tương hoặcmtr lỏng caseinđậu tương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngày Mtr thạchcasein đậutươngMPN mtrlỏng casein đậutương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 3 ngàyC. albicansATCC 10231NCPF 3179IP 48.72NBRC 1594Mtr thạchsabouraud hoặcmôi trường lỏngsabouraud20–25 oC2–3 ngàyMtr thạch caseinđậu tương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 5 ngàyMtr thạchsabouraud≤ 100 CFU20–25 oC≤ 5 ngàyMtr thạchcasein đậu tương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 5 ngàyMPN: Ko ADMtr thạchsabouraud≤ 100 CFU20–25 oC≤ 5 ngàyA. nigerATCC 16404IMI 149007IP 1431.83NBRC 9455Mtr thạchsabouraud hoặcmtr thạch khoaitây dextrose20–25 oC5–7 ngày, hoặcđến khi thu đượcbào tửMtr thạch caseinđậu tương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 5 ngàyMtr thạchsabouraud≤ 100 CFU20–25 oC≤ 5 ngàyMtr thạchcasein đậu tương≤ 100 CFU30–35 oC≤ 5 ngàyMPN: Ko ADMtr thạchsabouraud≤ 100 CFU20–25 oC≤ 5 ngày Tiến hành: Cấy riêng rẽ vào mtr thạch casein đậu tương hoặcmtr lỏng casein đậu tương (đếm TS VK HK) mộtlượng nhỏ VSV (ko quá 100 CFU) theo chỉ dẫn trongbảng Cấy riêng rẽ vào mtr thạch sabouraud (đếm TSnấm) một lượng nhỏ VSV (ko quá 100 CFU, nên: koquá 50 CFU) theo chỉ dẫn trong bảng Ủ mtr theo ĐK ghi trong bảngKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG ĐẾM TS VSV Yêu cầu: Đv mtr thạch:+ SL VSV ptr trên lô mtr mới ko được khác quá 2 lầnso với SL hỗn dịch chủng TCH (50200%)+ Đv chủng được pchế khi SD, sự ptr của VSV trênlô mtr mới được so sánh với sự ptr của VSV trên lômtr đã đạt yc CL: ko khác quá 2 lần (50200%) Đối với mtr lỏng: sự ptr rõ ràng của VSV trên lô mtrmới giống với sự ptr của VSV trên lô mtr đã đạt ycchất lượngKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG ĐẾM TS VSVKIỂM TRA MÔI TRƯỜNG XÁC ĐỊNH VSV GÂY BỆNHMôi trường Tính chất Chủng thử nghiệmVi khuẩnGram âmdung nạpmậtMtr lỏng tăng sinhEnterobacteriaMosselKT ptr E. coli, P. aeruginosaƯC ptr S. aureusMtr thạch muối mậtViolet RedKT ptr+ đặc hiệuE. coli, P. aeruginosaE. coli Mtr thạch MacConkey KT ptr+ đặc hiệuE. coliSalmonella Mtr lỏng tetrathionat KT ptr Salmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium hoặc Salmonella enterica subsp.enterica serovar AbonyƯC ptr S. aureusMtr thạch xanhBriliantKT ptr+ đặc hiệuSalmonella enterica subsp. enterica serovarTyphimurium hoặc Salmonella enterica subsp.enterica serovar AbonyP.aeruginosaMtr thạch Cetrimid KT ptr P. aeruginosaƯC ptr E. coliS. aureus Mtr thạch muốiMannitolKT ptr+ đặc hiệuS. aureusƯC ptr E. coli Mtr lỏng KT sự ptr VSV: Cấy vào mtr lỏng một lượng nhỏ VSV ko quá 100CFU. Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian ko lớn hơnkhoảng thời gian ngắn nhất mà phép thử qui định Yêu cầu: VSV ptr tốt, rõ ràng trên lô mtr mới khi sosánh với sự ptr của VSV trên lô mtr đã đạt yêu cầuchất lượngKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MTR XĐ VSV GÂY BỆNH Mtr thạch KT sự ptr VSV Dùng kĩ thuật cấy trải bề mặt, cấy vào mỗi đĩa mtrđặc một lượng nhỏ VSV ko quá 100 CFU. Ủ ở nhiệtđộ xác định trong thời gian ko lâu hơn khoảng thờigian ngắn nhất mà phép thử qui định Yêu cầu: Sự ptr của VSV trên lô mtr mới giống vớisự ptr của VSV trên lô mtr đã đạt yêu cầu chấtlượng (ko đg số lượng)KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MTR XĐ VSV GÂY BỆNH Mtr lỏng hoặc thạch ƯC sự ptr VSV Cấy vào mtr loại VSV phù hợp với lượng ít nhất là100 CFU. Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian khôngít hơn khoảng thời gian lớn nhất mà phép thử quiđịnh Yêu cầu: VSV phải ko ptr trên mtrKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MTR XĐ VSV GÂY BỆNH Mtr đặc hiệu Dùng kĩ thuật cấy trải bề mặt, cấy vào mỗi đĩa mtrmột lượng nhỏ VSV ko quá 100 CFU. Ủ ở nhiệt độxác định trong thời gian mà phép thử qui định Yêu cầu: Hình thái khuẩn lạc và pứ đặc hiệu củaVSV trên lô mtr mới giống với hình thái khuẩn lạc vàpứ đặc hiệu của VSV trên lô mtr đã đạt yc chấtlượng (ko đgiá số lượng)KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MTR XĐ VSV GÂY BỆNHPHƯƠNG PHÁP THỬ Phương pháp đĩa thạch: áp dụng đv cácthuốc ko có chất ức chế hoặc thuốc có chứachất ức chế nhưng mất tác dụng khi bị phaloãng bởi ĐK thí nghiệm Phương pháp màng lọc: áp dụng đv cácthuốc có chất ức chế tan được trong nước, kobị mất tác dụng khi bị pha loãng bởi ĐK thínghiệmPHƯƠNG PHÁP THỬ: CHUẨN BỊ MẪU PP đĩa thạch: dd đệm phosphat pH 7,2PP màng lọc: dd pepton 1‰ Chế phẩm tan trong nướcphân tán đều trong nước:Cân 10 g hoặc 10 ml chế phẩm, thêm ddpl thu được HDcó nồng độ 101. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ 102,103 Chế phẩm khó hòa lẫn trong nước: Cân 10 g chế phẩm,thêm ddpl (có thêm polysorbat 80 với tỷ lệ 1 gl) thuđược HD có nồng độ 101. Tiếp tục pha loãng đến nồngđộ 102,103.PHƯƠNG PHÁP THỬ: CHUẨN BỊ MẪU Chế phẩm khó ko hòa lẫn trong nước (dầu, kem, sáp): Cân10 g chế phẩm, thêm polysorbat 80 vô khuẩn với lượng koquá KL chế phẩm thử hoặc pha mẫu trong isopropylmyristat. Dùng pp khuấy trộn cơ học vàhoặc làm ấm bằngnhiệt (ko quá 45oC), thêm ddpl để thu được HD có nồng độ101. Tiếp tục pha loãng bằng ddfl (có thêm polysorbat 80 với tỷlệ 1 gl) đến nồng độ 102,103 Miếng dán: Lấy 10 miếng dán, loại bỏ lớp bảo vệ, phaloãng bằng ddpl + polysorbat 80 tỷ lệ 1 gl vàhoặc lecithinvới tỉ lệ từ 0,11% Chế phẩm dạng khí dunglỏng: Làm lạnh bình để các khíhóa lỏng rồi mở nắp để lấy một lượng thích hợp mang thử(10 ml)ĐẾM SỐ LƯỢNG VKHK VÀ NẤM BẰNGPHƯƠNG PHÁP ĐĨA THẠCH Cấy 1,0 ml DD thử nghiệm (độ pha loãng thích hợp)vào đĩa petri vô trùng. 2 đĩa 1 độ pha loãng1 mtr Đếm TS VKHK: 101, 102,103 Đếm TS Nấm: 101, 102 Thêm 15 20 ml mtr thạch casein đậu tương (VKHK)mtrSabouraud (Nấm), trộn đều (xoay thuận rồi xoay ngượcchiều kim đồng hồ), để mtr đông ở nhiệt độ phòng, lật úpđĩa Ủ đĩa chứa mtr phát hiện VKHK ở 3035oC35 ngày (BP:35 ngày) (DĐVN 4: 4872h) Ủ đĩa chứa mtr phát hiện nấm ở 2025oC57 ngày (BP:57 ngày) (DĐVN 4: 5 ngày)ĐẾM SỐ LƯỢNG VKHK VÀ NẤM BẰNGPHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Dùng 2 màng lọc, hút chính xác một thể tích nhấtđịnh của HD thử có độ pha loãng thích hợp lên mỗimàng lọc, rửa màng 3 lần, 100ml lần bằng ddpl Chuẩn bị 2 đĩa petri có sẵn 1520 ml mtr thạch caseinđậu tương (VKHK)mtr Sabouraud (Nấm) Đặt màng lọc thứ nhất lên bề mặt đĩa mtr thạchcasein đậu tương, ủ ở 3035oC35 ngày Đặt màng lọc thứ hai lên bề mặt đĩa mtr Sabouraudvà ủ 2025oC57 ngàyTÍNH KẾT QUẢ Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc mọctrên đĩa Ưu tiên chọn các đĩa có số lượng khuẩn lạc lớnnhất nhưng ko quá: 250 khuẩn lạc (VK) 50 khuẩn lạc (Nấm) Tính trung bình số lượng vi sinh vật trong 1gmlchế phẩm và so sánh với giới hạn chấp nhận đểkết luậnQT XÁC ĐỊNH ENTEROBATERIA VÀ CÁC VK Gr() KHÁCCân 10,0 gml chế phẩm90 ml mtr lỏng casein soyabean,ủ 3537oC25h (hồi phục VSV, nhưng ko tăng SL VSV)Cấy chuyển 10 ml sang 100 ml mtr EnterobacteriaMossel,ủ 3537oC1848hNếu VSV mọc: Cấy chuyển sang bề mặt môi trường thạchmuối mật violetred, ủ 3537oC1848hNếu VSV mọc: Nhuộm Gram: trực khuẩn Gram âmCó Enterobacteria và các VK Gram () khácHình ảnh E. coli trên mtr EE brothQT XÁC ĐỊNH ENTEROBACTERIAHình ảnh E. coli trên mtr thạchmuối mật violetred (Himedia)QT ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBATERIA VÀ CÁC VK Gr() KHÁCCân 10,0 gml chế phẩm90 ml mtr lỏng casein soyabean,ủ 3537oC25h (hồi phục VSV, nhưng ko tăng SL VSV)Cấy lượng tương ứng 0,2; 0,02; 0,002gml vào mtrEnterobacteriaMossel, ủ 3537oC1848hNếu VSV mọc: Cấy chuyển từ sang bề mặt môi trường thạchmuối mật violetred, ủ 3537oC1848hNếu VSV mọc: Nhuộm Gram: trực khuẩn Gram âmTra bảng để kết luận về SL Enterobacteria và các VK Gram ()khácSỐ LƯỢNG ENTEROBACTERIA VÀ CÁC VK GR() KHÁCKQ đối với mỗi lượng sản phẩm Số lượngEnterobacteria cótrong 1gmlchế phẩm0,2gml 0,02gml 0,002gml+ + + > 500+ + 50 500+ 5 50 < 5QT XÁC ĐỊNH E. COLILấy 1 lượng tương đương 1,0 gml chế phẩmMtr lỏng casein soyabean (thể tích gấp ít nhất 9 lần)ủ ở 3035oC2448hNếu VSV mọc: Cấy chuyển sang mtr thạch MacConkey, ủ ở 3537oC1872hNếu có KL màu hồng đến đỏ, có vòng đỏ bao quanh do VSV lên menlactoseCấy chuyển sang mtr thạch Levine Eosin xanh methylen (EMB), ủ ở3537oC1872h.Nếu KL màu đen có ánh kimPhản ứng sinh indol: Nhỏ TT Ehrlich Kovacs vào HD VSV trong mtrlỏng soyabean casein. Nếu tạo vòng màu đỏ ngay lập tức ở trên bềmặt mtr (VSV có men tryptophanase khử tryptophan có trong peptoncủa mtr thành indol, indol phản ứng với TT tạo sản phẩm Rosindol cómàu đỏ)Nghi ngờ có E. coli: Khẳng định bằng kit API 20E Hình ảnh E. coli trên mtr thạch MacConkeyHình ảnh E. coli trên kính hiểnvi quang học, vật kính dầuQT XÁC ĐỊNH E. COLIHình ảnh E.coli trên mtr EMB(KL có màu đen, ánh kim)QT XÁC ĐỊNH E. COLI(+) ()Phản ứng sinh indolcủa E. coliNguyên tắc chung: Kit 20E: gồm 20 giếng, đánh số thứ tự từ 0 đến 19 Mỗi giếng chứa một chất nền khác nhau. VSV phân giải chất nền trong giếng. Sự phân giải này cóthể phát hiện được nhờ: Sự thay đổi màu của môi trường Sau khi thêm thuốc thử vào giếngXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EThêm 5 ml nước vào các lỗ trên khaycủa kit để tạo độ ẩm thích hợp cho VSVLấy 1 KL tách biệt từ mtr EMB,cho vào 5ml nước vô trùng, lắc đều, được hỗn dịch gốcNhỏ hỗn dịch gốc vào các giếng của kit: Nhỏ vào toàn bộ 20 giếng của kit Nhỏ cả vào phần tube và phần miệng (cupule)giếng CIT, VP và GEL Nhỏ vào phần tube đối với các giếng còn lại Nhỏ dung dịch dầu khoáng lên trên bề mặt giếngADH, LDC, ODC, H2S, và UREXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EỦ ở 35370C khoảng 1824hGhi lại các kết quả (+) thu đượcngay trên các giếngThực hiện thêm một số phản ứngrồi đọc kết quả tiếpXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20E Giếng TDA: Thêm một giọt TT TDA, pư (+) nếu xuấthiện màu vàng nâu Giếng IND: Thêm một giọt TT JAMES, pứ (+) nếuxuất hiện vòng đỏ sau 2 phút Giếng VP: Thêm một giọt TT VP1 và VP2: phản ứng (+) nếu xuất hiện màu hồng đến đỏ sau 10’ phản ứng () nếu chỉ xuất hiện màu hồng nhạt sau1012’XÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20E Giếng GLU: Thêm 1 giọt TT NIT 1 và NIT 2 Phản ứng (+) nếu xhiện màu hồng đến đỏ sau 25’ Phản ứng () có thể xảy ra do nitrat biến đổi thànhnitơ (biểu hiện bằng bọt khí trong giếng). Tiến hànhthêm 2 – 3 mg bột Zn vào: Sau 5’ nếu giếng vẫn có màu vàng chứng tỏcó sự tạo thành nitơ: Phản ứng NO2(+) Sau 5’ nếu giếng chuyển sang màu hồngđến đỏ chứng tỏ nitrat ko bị chuyển thànhnitơ: Phản ứng NO2()XÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EGiếng Âm tính Dương tínhONPG Không màu VàngADH Vàng Đỏ camLDC Vàng Đỏ camODC Vàng Đỏ camCIT Vàng –xanh lá nhạt Xanh da trờiH2S Không màu – xám ĐenURE Vàng Đỏ camTDAThêm thuốc thử TDAVàng Đỏ nâuINDThêm thuốc thử JAMESKhông màu xanh lá nhạtvàng Đỏ hồngVPThêm thuốc thử VP1 + VP210 phútKhông màuhồng nhạt Đỏ hồngXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EGiếng Âm tính Dương tínhGEL Không khuếch tán Khuếch tán màu đenGLU Xanh da trờixanh da trời+xanh lá Vàngvàng xámMAN Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngINO Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngSOR Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngRHA Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngSAC Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngMEL Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngAMY Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngARA Xanh da trờixanh da trời+xanh lá VàngOX Tiến hành phản ứng oxydase và ghi kết quả vào bảngXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EGiếng CƠ CHẤT ENZYMPHẢN ỨNGNGUYÊN TẮCONPG 2nitrophenylβDgalactopyranoseΒgalactosidase VSV có Enzym này phân hủy cơ chất→ onitrophenol có mầu vàngADH Larginin Arginindihydrolase VSV có enzym này phân hủy cơ chấttạo ra sản phẩm làm thay đổi pH →thay đổi màu mtrLDC Llysin LysinedecarboxylaseODC Lormithin OrnithindecarboxylaseCIT Trisodium citrat Thử nghiệm xác định knăng VSV sửdụng citrate, sinh ra CO2 → kiềm hóamtrXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EGiếng CƠ CHẤT ENZYMPHẢN ỨNGNGUYÊN TẮCH2S SodiumthiosulfatThiosulfat reductase Enzym này phân giải cơ chất giải phóngH2S. H2S tạo tủa màu đen với ion sắt, chìURE Ure Urease VSV có Enzym này phân hủy cơ chấtthành NH3 và CO2 → thay đổi pH mtr →thay đổi màu của chỉ thị đỏ phenol từvàng sang đỏTDA Ltryptophan TryptophanDeaminaseVSV có Enzym này phân giải cơ chất →SP. SP này pư với FeCl3(TT TDA) → chấtcó màu đỏ nâuIND Ltryptophan TryptophanedeaminaseVSV có Enzym này phân giải cơ chất →indol. Indol pư với TT Jame → phức màuđỏ hồngVP SodiumpyruvatVSV lên men glucose tạo ra sản phẩm làacetoin. Acetoin + TT VP1,VP2 (KOH vànaphtol) → phức màu hồngGEL Gelatin gelatinase VSV có Enzym này phân giải gelatin →polypeptid và acid aminXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20ETest CƠ CHẤT ENZYMPHẢN ỨNGNGUYÊN TẮCGLU DglucoseLênmenoxihóa cácđườngThay đổi pH môi trường →thay đổi màu của chỉ thịMAN DmanitolINO InositolSOR DsorbitolRHA LrhamnoseSAC DsucroseMEL DmelibioseAMY AmygdalinARA Larabinose• Nhập số liệu của kit vừa thu được vào phần mềm ApiwebTM để đưa ra tên VSV thu được trong chế phẩm• Phép thử chỉ được chấp nhận khi % ID ≥ 80% và T ≥ 0XÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EKết quả phân lập E. coli bằng kit API 20EXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EXÁC ĐỊNH E. COLI BẰNG KIT API 20EQT XÁC ĐỊNH P. AERUGINOSALấy 1 lượng tương đương 1,0 gml chế phẩmMtr lỏng casein soyabean (thể tích gấp ít nhất 9 lần)ủ ở 3035oC2448hCấy chuyển sang mtr Cetrimid, ủ ở 3035oC1872hNếu KL có màu lục nhạtNhuộm Gram: trực khuẩn Gram âmPhản ứng oxydase:Lấy KL nghi ngờ cho lên khoanh giấy đã tẩm trướcNdimethylphenylen diamin dihydroclorid 1%. Nếu thuốc thử từ ko màuchuyển sang màu đỏ hồng, rồi sang màu tímPhản ứng sinh sắc tố: Cấy KL lên mtr thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin, ủ ở 3337oCít nhất 72h: nếu KL màu vàng nhạt, sắc tố xanh vàng Cấy KL lên mtr thạch pseudomonas để phát hiện pyocyanin, ủ ở 3337oCít nhất 72h: KL màu vàng nhạt, sắc tố xanh nâuNghi ngờ có P. aeruginosa : Khẳng định bằng kit API 20NE Hình ảnh P. aeruginosa trênKHV quang họcQT XÁC ĐỊNH P. AERUGINOSAHình ảnh P. aeruginosa trên mtrthạch CetrimidHình ảnh P. aeruginosa trên mtrthạch pseudomonas để phpyocyanin (King A)Kết quả phân lập P. aeruginosa bằng kit API 20NEQT XÁC ĐỊNH P. AERUGINOSAQT XÁC ĐỊNH S. AUREUSLấy 1 lượng tương đương 1,0 gml chế phẩmMtr lỏng casein soyabean (thể tích gấp ít nhất 9 lần)ủ ở 3035oC2448hCấy chuyển sang mtr thạch manitolmuối, ủ ở 3035oC1872hNếu KL màu vàng, có vòng vàng bao quanh do VSV đồng hoá đườngmanitol, sinh acid hữu cơ, làm chuyển màu của đỏ phenolNhuộm Gram: cầu khuẩn Gram dươngPhản ứng coagulase (đông huyết tương): Cấy KL nghi ngờ vàohuyết tương thỏ hoặc ngựa, ủ ở 37oC24 giờ, 3 giờ theo dõi 1 lầnĐồng thời làm ống chứng âm tính và dương tính(đông huyết tương ở bất kì mức độ nào do VSV có men coagulase)Phản ứng catalase: lấy 1 KL, nhúng vào dung dịch nước oxy già 310%. Nếu có bọt khí nổi lên là pư (+) do VSV có catalase làm phângiải H2O2Nghi ngờ có S. aurreus : Khẳng định bằng kit API StaphHình ảnh S. aureus trên kínhhiển vi quang họcQT XÁC ĐỊNH S. AUREUSHình ảnh S. aureus trên mtrthạch manitolmuốiKết quả thử nghiệm coagulase:(+): khi xuất hiện khối đông huyết tương(): ko xuất hiện khối đông, dung dịch đồng nhấtQT XÁC ĐỊNH S. AUREUSHình ảnh phản ứng CATALASEQT XÁC ĐỊNH S. AUREUSKết quả phân lập S. aureus bằng Kit API STAPHQT XÁC ĐỊNH SALMONELLA SP.Lấy 1 lượng tương đương 1,0 gml chế phẩmmtr lỏng casein soyabean (thể tích gấp ít nhất 9 lần)ủ ở 3035oC2448hCấy chuyển sang mtr tetrathionat lỏng và ủ ở 3035oC2448h(mtr làm giàu salmonella và ức chế các VSV khác do có natri thiosulfat) Cấy sang mtr thạch xanh Briliant, ủ ở 3537oC1872giờ: KL nhỏ khôngmàu hoặc hồng nhạt có vòng màu hồng bao quanh Cấy sang mtr thạch Bismuth sulfit, ủ ở 3537oC1872h: KL màu đenNhuộm Gram: trực khuẩn Gram âmCấy chuyển sang mtr thạch sắt 3 đường (cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, sauđó cấy đâm sâu vào phần đứng của ống thạch), ủ 3537oC1872h : Nếu bề mặtthạch nghiêng có màu hồng. Phần thạch đứng có màu vàng (VSV lên menLactose sinh acid làm giảm pH của mtr và chuyển màu của chỉ thị đỏ phenol).Chỗ cấy có màu đen (VSV phân giải acid amin có chứa S như methionin,cystein tạo thành khí H2S, khí H2S kết hợp với Fe++ tạo thành FeS có màu đen)Nghi ngờ có Salmonella : Khẳng định bằng kit API 20EQT XÁC ĐỊNH SALMONELLA SP.Hình ảnh Salmonella sp. trênmtr thạch Bismuth sulfitMtr thạch xanh Brilliant:A) Escherichia coli; B) Salmonella spp.Nguồn: Department of Microbiology and ParasitologyUniversity of Navarra, Edificio de InvestigaciónC Irunlarrea nº 1, 31008 Pamplona Spain(+) ĐCQT XÁC ĐỊNH SALMONELLA SP.Hình ảnh Salmonella sp. Trênmtr thạch sắt 3 đườngHình ảnh Salmonella sp.trên KHV quang họcKết quả phân lập Salmonella sp.bằng Kit API 20EQT XÁC ĐỊNH SALMONELLA SP.QT XÁC ĐỊNH CANDIDA ALBICANSLấy 1 lượng tương đương 1,0 gml chế phẩmmtr lỏng casein soyabean (thể tích gấp ít nhất 9 lần)ủ ở 3035oC2448hCấy chuyển sang mtr thạch Sabouraud ủ ở 30350C5 ngày:KL có màu trắngNghi ngờ có C. albicans : Khẳng định bằngkit API 20 C AUXHình ảnh C. albicans trênmtr thạch SabouraudQT XÁC ĐỊNH CANDIDA ALBICANSQT XÁC ĐỊNH CANDIDA ALBICANSCHỨNG ÂM TÍNH Mục đích: kiểm tra xem quá trình thử nghiệm có bịnhiễm VSV bên ngoài ko? Tiến hành: Thay mẫu thử bằng nước cất đã được hấp vô khuẩn Tiến hành thử nghiệm song2 giống với chế phẩm Nếu có sự phát triển của VSV trên các đĩa mtr: quátrình thử nghiệm đã bị nhiễm VSV. TH này cần tiếnhành lại thử nghiệm trên mẫu thử đã tiến hành cùngngày với chứng âm tính đó Thêm chủng VSV vào mẫu thử: Thêm vào mẫu thử ở nồng độ pha loãng ít nhất cóthể (thường là 101) và thêm vào ống chứng (ko cómẫu thử) một lượng HD VSV để thu được nồng độVSV trong mẫu thử đã pha loãng ko quá 100 CFUml Thể tích của HD VSV ko quá 1% thể tích mẫu thử đãpha loãng VD: thêm 0,1 ml HD VSV có nồng độ từ 103 ÷ 104CFUml vào 9,9 ml dd thử ở nồng độ 101KIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP ĐẾM TS VSV PP màng lọc: Đv mỗi VSV ở bảng, SD 1 màng lọc riêng Chuyển 1 lượng tư với 1 g (hoặc nhỏ hơn nếunồng độ VSV quá lớn) mẫu thử lên màng lọc, lọcngay và rửa màng lọc theo qui trình thử GHNK đãlựa chọn Đếm TS VKHK: chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa mtrthạch casein đậu tương Đếm TS nấm: chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa mtrthạch SabouraudKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP ĐẾM TS VSV PP màng lọc: Ủ các đĩa mtr theo ĐK ở bảng. Sau đó, đếm SLkhuẩn lạc Yêu cầu: số lượng VSV phải ko được khác quá 2lần so với KQ của ống chứng ko chứa mẫu thử (50200%)KIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP ĐẾM TS VSV PP đĩa thạch: Phương pháp cấy trộn Thêm vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử ở nồng độ 101 đãchuẩn bị ở trên và 1520 ml mtr thạch casein đậutương hoặc mtr thạch Sabouraud, cả hai mtr cónhiệt độ < 45 oC Đv mỗi VSV ghi trong bảng, SD ít nhất 2 đĩa petri. Ủcác đĩa mtr theo ĐK ở bảng. Tính TB SL KL đếmđược đối với mỗi loại mtrKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP ĐẾM TS VSV PP đĩa thạch: Yêu cầu: Số lượng VSV phải ko được khác quá 2lần so với KQ của ống chứng ko chứa mẫu thử(50200%) Chú ý phải trừ đi lượng VSV sẵn có trong chếphẩmKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP ĐẾM TS VSV Th chuẩn bị mẫu thử ở độ pha loãng 101 như QT.Cấy chủng VSV chứng vào mtr nc tại thời điểm trộnmẫu thử vào mtr. Cấy các chủng VSV một cáchriêng rẽ. S