Nghiên cứu nấm alternaria spp gây bệnh đốm nâu trên chanh dây (passiflora edulis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM PHAN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NẤM Alternaria spp GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP HCM – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM PHAN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NẤM Alternaria spp GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Đình Đơn TP HCM – Năm 2021 i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Nghiên cứu nấm Alternaria spp gây bệnh đốm nâu chanh dây (Passiflora edulis)”, Tôi nhận nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện nhiều cá nhân, tổ chức để hoàn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành giúp đỡ đó: - PGS TS Lê Đình Đơn, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh (ĐHNL TP HCM), người Thầy trực tiếp tận tình hướng dẫn xây dựng nội dung, phương pháp, lý luận khoa học đúc kết kết luận án Thầy luôn động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho tơi q trình thực luận án - Ban giám hiệu trường ĐHNL TP HCM tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình triển khai thực đề tài bảo vệ luận án - Lãnh đạo Cục Bảo vệ thực vật hỗ trợ kinh phí tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận án - TS Bùi Ngọc Hùng tập thể cán Phòng Đào tạo sau đại học trường ĐHNL TP HCM nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hồn tất luận án - Ban chủ nhiệm Khoa Nơng học, môn Bảo vệ thực vật trường ĐHNL TP HCM tạo điều kiện thuận cho nghiên cứu thực đề tài - Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường Trường Đại học Nông ĐHNL TP HCM, đặc biệt ThS Phùng Võ Cẩm Hồng - Phó Viện trưởng tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm liên quan đến luận án - Lãnh đạo Trung tâm Kiểm định Khảo nghiệm thuốc Bảo vệ thực vật phía Nam, đặc biệt ThS Lê Phạm Đoan Trang tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm liên quan đến luận án - Các em sinh viên Khoa Nông học Bộ môn Công nghệ sinh học trường ĐHNL TP HCM cộng tác triển khai thu thập kết thí nghiệm - Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp Tôi công tác Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập II, Chi Cục Kiểm dịch thực vật vùng II gia đình động viên, khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ Tôi suốt q trình thực hồn thành luận án - Cảm ơn anh Huỳnh Tiến Cảnh (là chồng tơi) ln động viên, khích lệ giúp đỡ nhiều vật chất lẫn tinh thần để tơi hồn thành luận án - Cảm ơn TS Nguyễn Vũ Phong, ThS Đàng Nguyên Lưu Vi Vy, ThS Đinh Thị Ánh Tuyết, ThS Nguyễn Thị Huyền hỗ trợ suốt thời gian thực luận án Tác giả luận án ii Phan Thị Thu Hiền LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Phan Thị Thu Hiền iii TÓM TẮT Alternaria chi nấm đa ký chủ, gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại trồng có giá trị kinh tế Ở Việt Nam, nghiên cứu phân loại, mơ tả đặc điểm sinh học, tính độc di truyền Alternaria chưa nghiên cứu cách hệ thống Chanh dây (Passiflora edulis) loại trồng du nhập vào Việt Nam từ năm 1998 hình thành vùng chanh dây rộng lớn tập trung tỉnh Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắk Lắk, Gia Lai, Kon Tum, Sơn La, Nghệ An, Cao Bằng Sự gia tăng diện tích trồng chanh dây làm gia tăng sâu bệnh hại chanh dây Năm 2011 ghi nhận có loại bệnh đốm nâu lá, chanh dây Alternaria spp gây Bệnh có tần suất xuất nhiều chưa mô tả nghiên cứu cách Do đó, nghiên cứu bệnh đốm nâu Alternaria gây hại chanh dây cần thiết có ý nghĩa; Để từ đề xuất biện pháp phòng trừ hiệu an toàn sinh học nhằm đảm bảo suất chất lượng chanh dây hàng hóa phục vụ tiêu thụ nội địa xuất Chín mươi bảy mẫu phân lập nấm có đặc điểm hình thái Alternaria phân lập từ chanh dây trồng Đắk Nông, Lâm Đồng giống nhập từ Đài Loan Trong số này, 61 mẫu phân lập nhận dạng loài Alternaria passiflorae, 35 mẫu Alternaria tenuissima mẫu thu thập từ vùng trồng chanh dây Đài Loan định danh A tenuissima Phân tích trình tự vùng gen rDNA-ITS, actin glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase 15 mẫu phân lập loài A passiflorae mẫu thuộc loài A tenuissima với hệ số bootstrap 1.000 lần lặp lại, chứng minh có tồn quần thể A passiflorae, A tenuissima khác biệt tìm thấy đáng tin cậy dựa vào vùng rDNA-ITS, actin glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase Trong đó, A passiflorae phân lập từ Lâm Đồng Đắk Nông gần gũi mặt di truyền, mẫu phân lập A tenuissima có tỷ lệ tương đồng cao từ 98,7 – 99,4% Nhiệt độ thích hợp cho phát triển hai loài A tenuissima A passiflorae 25 – 30ºC; Bào tử nấm có khả sống sót ngưỡng nhiệt độ 45 – iv 48ºC (A tenuissima) 45 – 50ºC (A passiflorae), A tenuissima có khả kháng nhiệt A passiflorae Mơi trường PCA mơi trường thích hợp cho sinh trưởng A tenuissima A passiflorae Ánh sáng pH ảnh hưởng đến sinh trưởng A tenuissima A passiflorae Các mẫu phân lập A tenuissima, A passiflorae gây bệnh giống Đài Nông chủng bệnh nhân tạo với nồng độ 107 bào tử/ml, vết thương giúp A tenuissima, A passiflorae xâm nhiễm dễ dàng gây vết bệnh có kích thước lớn so với chủng bệnh không gây vết thương Khảo sát cỏ dại vườn chanh dây, thu thập mẫu bệnh chủng bệnh nhân tạo ghi nhận cỏ song nha lơng (Bidens pilosa) có khả nguồn lưu tồn phát tán nguồn bệnh sơ cấp vườn chanh dây Tính gây bệnh A passiflorae A tenuissima xác định cách chủng bệnh nhân tạo 10 loại 12 loại trồng điều kiện nhà lưới Kết cho thấy A tenuissima có khả gây bệnh điều (Anacardium occidentale), bưởi (Citrus grandis), cao su (Hevea brasiliensis), bầu (Lagenaria siceraria), bí đỏ (Cucurbita maxima), cải (Brassica integrifolia), cải bẹ xanh (Brassica juncea) cà chua (Solanum lycopersicum); không gây bệnh ca cao (Theobroma cacao), cà phê (Coffea canephora), mít (Artocarpus heterophyllus), nhãn (Dimocarpus longan), sầu riêng (Durio zibethinus), vú sữa (Chrysophyllum cainito), xoài (Mangifera indica), khổ qua (Momordica charantia), khoai lang (Ipomoea batatas), khoai tây (Solanum tuberosum), ớt (Capsicum annuum L.), lúa (Oryza sativa), ngô nếp (Zea mays var amylacea), ngô thức ăn gia súc (Zea mays var andentata) Lồi A passiflorae có khả gây bệnh cao su (Hevea brasiliensis), nhãn (Dimocarpus longan), sầu riêng (Durio zibethinus), bầu (Lagenaria siceraria), bí đỏ (Cucurbita maxima), khổ qua (Momordica charantia), cải bẹ xanh (Brassica juncea), khoai lang (Ipomoea batatas), ớt (Capsicum annuum L.), cà chua (Solanum lycopersicum ); không gây bệnh cải (Brassica integrifolia), khoai tây (Solanum tuberosum), lúa v (Oryza sativa), ngô nếp (Zea mays var amylacea), ngô thức ăn gia súc (Zea mays var andentata), bưởi (Citrus grandis L.), điều (Anacardium occidentale L.), ca cao (Theobroma cacao), cà phê (Coffea canephora), mít (Artocarpus heterophyllus), vú sữa (Chrysophyllum cainito) xồi (Mangifera indica) Tìm hiểu độc tố alternariol (AOH) thông qua việc xác định diện độc tố AOH xác định phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) cho thấy hai loài A tenuissima A passiflorae có khả sinh độc tố AOH Tuy nhiên, chưa tìm chứng cho thấy AOH tham gia vào trình hình thành vết bệnh lá, dung dịch nuôi nấm Alternaria gây nên tượng rụng chanh dây ghi nhận nghiên cứu Kết nghiên cứu làm sở cho nghiên cứu phòng trừ bệnh đốm nâu đặc biệt định hướng cho việc tầm soát nguồn bệnh giống chanh dây nhập vi SUMMARY STUDIES ON ALTERNARIA SPECIES CAUSING BROWN SPOT DISEASE OF PASSIONFRUIT (Passiflora edulis) Alternaria is a genus with wide hosts range, causing serious harm to many crops In Vietnam, Alternaria has not been systematically studied on classification and description of biological characteristics, toxicity and population genetics Passion fruit (Passiflora edulis) is a crop introduced in Vietnam since 1998 and now has formed large areas of passion fruit concentrated in the provinces of Lam Dong, Dak Nong, Dak Lak, Gia Lai, Kon Tum, Son La, Nghe An, Cao Bang The development in cultivated area has increased pests and diseases on passion fruit In 2011, there was appearance brown spot disease on leaves, of passion fruit, caused by Alternaria spp The disease has had a high frequency but has not been described and studied methodically Therefore, the research on brown spot disease caused by Alternaria on passion fruit is very necessary and meaningful; From there, proposing effective control measures, biosafety to ensure productivity and quality of passion fruit goods for domestic consumption and export Ninety-seven Alternaria isolates were obtained from leaves and passion fruit grown in Dak Nong, Lam Dong and seedlings imported from Taiwan Among them, 61 isolates were identified as Alternaria passiflorae, 35 isolates were Alternaria tenuissima and isolate collected from passion fruit growing areas in Taiwan was also identified as A tenuissima Sequence analysis of the rDNA-ITS, actin and glyceraldehyde - - phosphate dehydrogenase regions of 15 isolates of A passiflorae, and isolates of A tenuissima with a bootstrap coefficient of 1,000 replicates, were demonstrated the presence of populations of A passiflorae, and A tenuissima in the passion fields and the difference of them was found very reliably Of which, A passiflorae isolates from Lam Dong and Dak Nong were genetically close, while A tenuissima isolates were a high similarity rate of 98.7 - 99.4% vii The favorite temperature for A tenuissima and A passiflorae isolates on artificial nutrients is recorded as 25 – 30°C; meanwhile spores is recorded to survive at a temperature of 45 - 48°C (A tenuissima) and at 45 - 50°C (A passiflorae), suggesting that A tenuissima species has less heat resistance than A passiflorae species The A tenuissima and A passiflorae species were less affected by light and pH during the course of study Isolates of A tenuissima and A passiflorae caused the disease symptoms on leaves and on fruits of Dai Nong seedling when inoculating with the concentration 107 spores/ml The isolates of A tenuissima and also isolates of A passiflorae infected easily and created a larger lesion when inoculation by wound technique as compared to the non-wound one By field surveys, diseased sample collection and artificial inoculation, results indicated that the beggarticks (Bidens pilosa) was a source of persistence and spread of disease in orchards The pathogenicity of A passiflorae and A tenuissima was determined by the spores inoculation on cut leaves of 10 differential crop plants and on seedlings of 12 plants grown under a greenhouse condition The results showed that isolates of A tenuissima caused the disease symptoms on cashew leaves (Anacardium occidentale), pomelo leaf (Citrus grandis), rubber leaf (Hevea brasiliensis), gourd plant (Lagenaria siceraria), pumpkin plant (Cucurbita maxima), choy sum (Brassica integrifolia), leaf mustard (Brassica juncea) and tomato plants (Solanum lycopersicum); Non-pathogenic on cocoa leaves (Theobroma cocoa), coffee leaves (Coffea canephora), jackfruit leaves (Artocarpus heterophyllus), longan leaves (Dimocarpus longan), durian leaves (Durio zibethinus), star apple leaves (Chrysophyllum cainito), mango leaves (Mangifera indica) and the non - disease symptoms in bitter melon plant (Momordica charantia), sweet potato plant (Ipomoea batatas), potato plant (Solanum tuberosum), chili plant (Capsicum annuum L.), rice plant (Oryza sativa), glutinous maize plant (Zea mays var amylacea), forage maize plant (Zea mays var andentata) The isolates of A passiflorae produced the typical viii symptoms on rubber leaf (Hevea brasiliensis), longan leaf (Dimocarpus longan), durian leaf (Durio zibethinus), gourd plant (Lagenaria siceraria), pumpkin plant (Cucurbita maxima), bitter melon plant (Momordica charantia), leaf mustard (Brassica juncea), sweet potato plants (Ipomoea batatas), chili plants (Capsicum annuum L.), tomato plants (Solanum lycopersicum); but did not on choy sum (Brassica integrifolia), potato plant (Solanum tuberosum), rice plant (Oryza sativa), glutinous maize (Zea mays var amylacea), forage maize (Zea mays var andentata), pomelo leaf (Citrus grandis L.), cashew leaf (Anacardium occidentale L.), cocoa leaf (Theobroma cocoa), coffee leaf (Coffea canephora), jackfruit leaf (Artocarpus heterophyllus), star apple leaf (Chrysophyllum cainito) and mango leaf (Mangifera indica) The study of alternariol toxin (AOH) through the determination of the presence of AOH toxin by Liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LCMS/MS) was showed that a few isolates of both A tenuissima and A passiflorae produced AOH toxin However, there was no evidence that AOH involved in information of leaf lesions formation, although isolate culture solution causing passion defoliation was noted in this study The research results could be used as the basis for research on brown spot disease prevention and oriented the screening of pathogens on imported passion fruit seedlings, espec sự, 2003) Tổng hợp cho thấy, A alternata chưa ghi nhận chanh dây Việt Nam A passiflorae loài phổ biến, bên cạnh A tenuissima ghi nhận nghiên cứu Đây lồi ký sinh chanh dây làm gốc ghép, nhập nội vào Việt Nam phân lập lưu giữ Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập II Kết nghiên cứu cho thấy A passiflorae thể triệu chứng bệnh chanh dây khác biệt so với triệu chứng bệnh loài A tenuissima gây Điều có ý nghĩa việc nhận dạng tác nhân gây bệnh phát triển phương pháp định danh phục vụ công tác kiểm dịch thực vật Những liệu hình thái học, đặc biệt hình ảnh kính hiển vi điện tử xác nhận A tenuissima với đặc điểm khác A sesami ghi nhận Võ Thị Dung cộng (2019) Phân nhóm phân tử với vùng DNA ITS, ACT GPDH cho thấy mẫu phân lập thuộc lồi A passiflorae ln tạo thành nhóm phân biệt với loài A tenuissima với số thay đổi tùy thuộc vào vùng DNA phân tích Dữ liệu phân tử cơng bố genbank nguồn liệu hữu ích dùng so sánh xác định biến đổi di truyền tác nhân gây bệnh tương lai Đặc điểm phân tử vùng ITS, ACT GPDH hai loài giúp theo dõi biến động quần thể theo thời gian, ký chủ môi trường, sử dụng cho xác định nguồn gốc tác nhân, đặc biệt cho trường hợp A tenuissima Một yếu tố quan trọng bảo vệ thực vật thông tin đầy đủ cấu trúc di truyền quần thể sinh vật gây hại nhiều thông tin đảm bảo hiệu chọn lựa chiến lược kiểm sốt Ví dụ nghiên cứu xác định độc tố AOH sinh từ A passiflorae A tenuissima nhằm cung cấp thêm sở liệu tác nhân gây bệnh mối liên quan độc tố tính độc Alternaria ... ghi nhận có loại bệnh đốm nâu lá, chanh dây Alternaria spp gây Bệnh có tần suất xuất nhiều chưa mô tả nghiên cứu cách Do đó, nghiên cứu bệnh đốm nâu Alternaria gây hại chanh dây cần thiết có... vào trình hình thành vết bệnh lá, dung dịch nuôi nấm Alternaria gây nên tượng rụng chanh dây ghi nhận nghiên cứu Kết nghiên cứu làm sở cho nghiên cứu phòng trừ bệnh đốm nâu đặc biệt định hướng... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM PHAN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NẤM Alternaria spp GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 LUẬN