Bài viết xác định tên nấm ở cấp độ loài dựa các đặc điểm hình thái, sinh học, phân tử và đánh giá tính độc của nấm Colletotrichum gây hại trên lá, hoa và quả xoài bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo.
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 NGHIÊN CỨU NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY XOÀI Study on Colletotrichum spp Causing Anthracnose on Mango Trần Đức Thắng , Đào Uyên Trân Đa , Nguyễn Ngọc Linh , Lê Đình Đơn Ngày nhận bài: 04.10.2019 Ngày chấp nhận: 06.11.2019 Abstract The anthracnose samples on leaf, flower and fruit of mango were collected at mango farms in Dong Thap, Tien Giang, Hau Giang, Can Tho, Ba Ria-Vung Tau, Dong Nai, Khanh Hoa province Based on morphological characteristics, gene sequence of four TUB2, ACT, GS and GPDH genes, ability of causing anthracnose on green berry of arabica coffee to indentify Colletotrichum species on mango; examining the biological properties of Colletotrichum species isolated; assessing pathogencity of Colletotrichum isolates to leaf and fruit of mango in artificial condition Results showed that 24 isolates of Colletotrichum isolated from leaf, flower and fruit of mango are two species Colletotrichum asianum and Colletotrichum acutatum Keywords: mango anthracnose, Colletotrichum asianum, Colletotrichum acutatum * ĐẶT VẤN ĐỀ Cây xoài coi ăn quan trọng hàng đầu nghề trồng ăn giới (Paull Daurate, 2011) Các vùng sản xuất xoài trọng điểm Việt Nam nằm vùng địa lý có điều kiện mơi trường thích hợp cho nấm Colletotrichum phát triển thời tiết nóng ẩm quanh năm lượng mưa cao, kèm theo kiến thức hiểu biết cách quản lý bệnh thán thư hạn chế Theo Hồng Thị Lệ Thuỷ Phạm Văn Kim (2009), bệnh thán thư gây hư hại 100% hoa xoài điều kiện ẩm ướt kéo dài làm thất thu hoàn toàn suất Đề tài nhằm xác định tên nấm cấp độ loài dựa đặc điểm hình thái, sinh học, phân tử đánh giá tính độc nấm Colletotrichum gây hại lá, hoa xoài phương pháp lây nhiễm nhân tạo PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phƣơng pháp phân lập định danh nấm Colletotrichum spp Phân lập: Các mẫu bệnh lá, hoa, xoài (xanh chín) có triệu chứng bệnh thán thư Cơng ty Cổ phần Phân bón Dầu khí Cà Mau Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường 24 thu thập vùng canh tác xoài thuộc tỉnh thành phố gồm: huyện Cao Lãnh - Đồng Tháp (CL-ĐT); huyện Cái Bè - Tiền Giang (CBTG); huyện Châu Thành A - Hậu Giang (CTAHG); huyện Cờ Đỏ - Cần Thơ (CĐ-CT); huyện Tân Thành - Bà Rịa Vũng Tàu (TT-BRVT); huyện Cam Lâm - Khánh Hòa (CL-KH) Các mẫu bệnh o rửa khử trùng mẫu 70 Cấy mẫu mơi trường WA (20 g agar; 1000 ml nước cất) môi trường PGA (Potato Glucose Agar, 200 g khoai tây, 20 g Glucose, 20 g agar), môi trường B (0,0005 g Brocemocresol, 1% muối Citrate, g NH4H2PO3, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO4, 25 g agar) Định danh dựa vào đặc điểm hình thái: Xác định mơ tả đặc điểm nấm Colletotrichum dựa vào hình thái màu sắc tản nấm, kích thước bào tử, hình dạng, màu sắc, kích thước giác bám định danh nấm dựa theo khóa phân loại Sutton (1995) Định danh kỹ thuật phân tử: DNA tổng nguồn nấm ly trích thực phản ứng PCR khuếch đại dựa trình tự vùng gen β - tubulin (Tub2), Partial actin (Act), Glutamine synthetase (Gs) Glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase (Gpdh) (bảng 1) Li trích DNA thực theo qui trình Lee Taylor (1990) Các sản phẩm PCR giải trình tự so sánh với ngân hàng gen Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 Bảng Danh sách mồi trình tự vùng gen Vùng gen Tub Act Gs Gpdh Cặp mồi Bt2a Bt2b ACT512F ACT783R GSF1 GSR1 GD92F1 GDR1 ‟ ‟ Trình tự (5 - ) GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC TACGAGTCCTTCTGGCCCAT ATGGCCGAGTACATCTGG GAACCGTCGAAGTTCCAC GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT Đánh giá khả gây bệnh cà phê arabica mẫu phân lập Colletotrichum: Để khẳng định kết định danh cấp loài mẫu Colletotrichum gây hại xồi, thí nghiệm xác định khả gây bệnh 24 mẫu phân lập Colletotrichum trái cà phê arabica xanh thực Lây nhiễm vị trí thân phần giáp cuống cà phê arabica xanh cắt rời khỏi cây, nồng độ bào tử lây nhiễm 10 bào tử/ml, vết lây nhiễm cà phê Theo dõi bệnh sau 24h/lần, có nghiệm thức xuất 50% trái bị bệnh ngưng quan sát Tỷ lệ bệnh nghiệm thức tính theo cơng thức: TLB (%) = (số bị bệnh/tổng số lây nhiễm bệnh)*100 2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học lồi nấm Colletotrichum Thí nghiệm đánh giá khả sử dụng nguồn carbon từ muối citrate môi trường B (Lynch cs, 1981) Hợp chất citrate sử dụng nguồn carbon, chuẩn bị cách thay glucose từ môi trường B với 1% muối citrate, thay đổi màu sắc bromocresol thị cho khả sử dụng carbon mẫu Colletotrichum Phản ứng dương tính đĩa thạch chuyển từ màu vàng đến màu xanh đen màu tím; phản ứng âm tính đĩa thạch giữ nguyên màu vàng đĩa thạch chuyển sang không màu Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại, lần lặp lại đĩa petri có đường kính 90mm Cấy khoanh nấm có đường kính mm có độ tuổi (lấy từ mép sợi nấm ngày tuổi) vào trung tâm đĩa petri Than khảo Glass cs, 1995 Johnston cs, 1997 Guerber cs, 2003 Peres cs, 2008 Quan sát màu sắc, đường kính phát triển tản nấm 3, 6, 9, 12 15 ngày sau cấy Đo đường kính tản nấm (mm) theo cơng thức: d = (d 1+d2)/2 Trong d1 d2 độ dài hai đường chéo tản nấm 2.3 Đánh giá tính gây bệnh mẫu Colletotrichum giống xoài Đài Loan phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo điều kiện phòng thí nghiệm Mẫu xồi 10 ngày tuổi, lây nhiễm bệnh điều kiện có vết thường khơng có vết thương xồi (3 điểm vết thương, điểm khơng vết thương đối diện nhau) Đối với mẫu trái lấy tháng tuổi, lây nhiễm điều kiện có gây vết thương không gây vết thương đối diện Mẫu lá, hoa dùng đối chứng sử dụng nước cất, mẫu lây nhiễm giữ ẩm, đặt nhiệt độ phòng điều kiện tối hoàn toàn Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát mắt thường để xác định biểu triệu chứng sau lây nhiễm Thời gian xuất bệnh tính từ lây nhiễm đến có triệu chứng xuất Tính tỷ lệ bệnh NSC NSC, đo kích thước vết bệnh NSC TLB (%) = (số vết bị bệnh/tổng vết lây nhiễm bệnh)*100 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum gây bệnh thán thƣ xoài Kết phân lập định danh dựa đặc điểm hình thái kỹ thuật phân tử xác định loài nấm gây hại xoài gồm Colletotrichum asianum thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides loài Colletotrichum acutatum 25 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 Tuy nhiên, loài Colletotrichum asianum xuất tất tỉnh, thành phố thu mẫu, lồi Colletotrichum acutatum ghi nhận Tiền Giang Loài Colletotrichum asianum: mặt đĩa thạch có tản nấm tản nấm màu trắng, mọc phân bố bề mặt thạch, có nhiều vòng tròn đồng tâm, sợi nấm từ màu trắng đến xám hay màu nâu; mặt đĩa thạch có màu trắng, vàng nhạt, màu xanh xám đen xen kẻ lẫn có nhiều vòng tròn đồng tâm Sợi nấm sinh dưỡng đường kính từ 2-5 µm (hình 3.3 B1), suốt Khơng hình thành cấu trúc sinh sản hữu tính thể mơi trường ni cấy Bào tử hình trụ, hai đầu tròn chiếm đa số, bên có chứa chất nhân màu vàng, kích thước trung bỡnh 11,66 - 22,50 ì 3,4 5,20 àm, tỷ lệ D/R từ 3,8 đến 3,9 Giác bám đơn, màu nâu nhạt đến nâu, hình dạng tròn đến bất định, mép phẳng khơng phân thuỳ kích thước trung bỡnh 5,38 - 8,19 ì 3,33 - 5,34 àm, t lệ D/R từ 1,5 đến 1,7 (hình 3.3 A1; 3.3 A2 3.3 A3) Loài Colletotrichum acutatum: mặt đĩa thạch, sợi nấm màu xám, mọc bề mặt thành cụm, phân bố không đồng đều; mặt đĩa thạch có nâu màu đen, vòng tròn đồng tâm khơng rõ, vùng quanh điểm cấy có màu nâu đen (hình 3.2) Sợi nấm suốt non xuất nhiều hạt màu xám bên sợi nấm già, đường kính từ sợi nấm 1,5-5,5 µm Khơng hình thành cấu trúc sinh sản hữu tính thể mơi trường ni cấy Bào tử hình bầu dục, nhọn hai đầu, suốt chất nhân màu vàng bên trong, khơng có vách ngăn, vách bào tử thẳng mịn (hình 3.3 A4) Kích thước bào tử trung bỡnh 7,0511,66 ì 3,33-5 àm, t l D/R 2,5, ngắn so với nhóm I, II, III Giác bám màu nâu, có hình e líp đến dạng hình trứng, vách mỏng thẳng khơng phân thuỳ, bên có nhiều chất nhân màu vàng phân bố bất định (hình 3.3 C4); kớch thc trung bỡnh 7,29-10 ì 3,54-5 àm, tỷ lệ D/R 2,0 Hình Hình dạng màu sắc tản nấm môi trƣờng PGA (14 NSC) Colletotrichum asianum: A, B, C, D, E, F; Colletotrichum acutatum: G, H; A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 H1 mặt tản nấm, A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2 H2 mặt tản nấm Hình Hình dạng bào tử giác bám, bào tử nảy mầm giác bám bốn nhóm Colletotrichum phân lập Mũi tên hình bào tử, ống mầm giác bám; ví dụ A1 mũi tên hình bào tử, B1 mũi tên đầu ống mầm C1 mũi tên hình dạng giác bám nhóm I (độ phóng đại 400 lần) 26 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 3.1.2 Định danh mẫu phân lập Colletotrichum trình tự vùng gen Tub2, Act, Gs Gpdh Từ kết so sánh độ tương đồng trình tự nucleotic vùng gen Act, Tub2 Gpdh đề xuất Damm cs (2012); ba vùng gen Tub2, Gs Gpdh đề xuất Weir cs (2012), kết luận mẫu phân lập có mẫu CH-ĐT-B12, CH-TG-B16, CH-CT-B19, CT-HG-B23 CCKH-L24 thuộc loài Colletotrichum asianum mẫu CH-TG-T14 thuộc lồi Colletotrichum acutatum Hình K t điện di sản phẩm PCR khu ch đại vùng gen mẫu Colletotrichum phân lập gel agarose 1,5% thực U = 110 V, I = 400 mA 25 phút A: Tub2, B: Act, C: Gs D: Gpdh Sử dụng công cụ BLAST NCBI để so sánh độ tương đồng trình tự nucleotic vùng gen Tub, Act, Gs, Gpdh mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotic lồi Colletotrichum spp liệu Genbank, kết tương đồng thể bảng sau Bảng Tỷ lệ tƣơng đồng trình tự DNA vùng gen Tub2, Act, Gs, Gpdh Mẫu Vùng gen CH-ĐT-B12 CH-TG-B16 CH-CT-B19 CT-HG-B23 CC-KH-L24 CH-TG-T14 Độ tương đồng (%) Tub2 Act Gs Gpdh 91 100 99 98 90 99 86 88 93 99 90 97 93 99 84 98 95 89 99 99 94 90 98 98 Mẫu so sánh Genbank C asianum phân lập xoài Braxin (Vieira cs., 2013), C asianum phân lập cà phê Thái Lan (Prihastuti cs., 2009) C.asianum phân lập xoài Autraslia (Weir cs., 2012) C.asianum, phân lập xoài Thái Lan (Weir cs., 2012) C.acutatum, gây bệnh ô liu (Talhinhas cs., 2005) C.acutatum, xuất Cynanchum paniculatum Trung Quốc (Wang cs., 2013) C asianum phân lập xoài Autraslia (Weir ctv, 2012) C acutatum KC703007.1 FJ907424.1 JX010073 JX010073 AJ748632.1 KF488580.1 KF488580.1 EF593349.1 27 Kết nghiên cứu Khoa học 3.1.2 Khả gây bệnh cà phê arabica mẫu phân lập Colletotrichum Từ kết định danh dựa đặc điểm hình thái, trình tự bốn vùng gen Tub2, Act, Gs, Gpdh dựa khả gây bệnh ký chủ chuyên biệt khẳng định loài C asianum thuộc phức hợp loài C gloeosporioides (Weir cs., 2012) loài C acutatum thuộc phức hợp loài C acutatum (Damm cs., 2012) hai loài gây bệnh thán thư xoài (Magifera indica) miền Nam, Việt Nam Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu nước Lê Hoàng Lệ Thuỷ Phạm Văn Kim (2008), nhóm tác giả xác định BVTV - Số 6/2019 tác nhân gây bệnh thán thư xồi chơm chôm khu vực Đồng sông Cửu Long, Việt Nam C gloeosporioides C acutatum; nghiên cứu Arauz (2000), Ploetz Freeman (2009) Prusky (2011) đề xuất tác nhân gây bệnh thán thư xoài C gloeosporioides C acutatum Kết phù hợp với nghiên cứu phân tử chi Colletotrichum gây bệnh thán thư xoài, nghiên cứu Vieira cs (2013) Braxin, Honger (2014) Ghana, Krishnapillai Wijeratnam (2014) Siri Lanka, Phoulivong cs (2012) Thái Lan xác định tác nhân gây bệnh thán thư xồi C asianum Hình Triệu chứng bệnh mô bị xâm nhiễm Colletotrichum cà phê A1: triệu chứng C asianum gây thân trái; B1 C acutatum gây thân trái; A2: triệu chứng C asianum gây cuống trái; B2 C acutatum gây cuống trái; A3 B3 sợi nấm xâm nhiễm vào mơ bào tử hình thành 28 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 3.2 Một số đặc tính sinh học mẫu C asianum C acutatum Bảng Đƣờng kính tản nấm Colletotrichum mơi trƣờng B chứa citrate Nhóm Mẫu I II TB TB III TB Đường kính tản nấm (mm) 6NSC 9NSC 12NSC Colletotrichum asianum 20,8 26,6 32,1 44,2 25,0 34,5 43,8 65,5 Colletotrichum actutatum 18,7 25,8 33,2 46,8 3NSC 15NSC 55,3 70,73 63,3 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy; TB: trung bình Hình Màu sắc đĩa thạch nhóm Colletotrichum phát triển mơi trƣờng B Nhóm I, bromocresol khơng đơi màu; nhóm II III làm bromocresol đổi màu A1, B1, C1 mặt tản nấm; A2, B2, C2 mặt tản nấm 3.3 Tính gây bệnh mẫu phân lập Colletotrichum Bảng Đƣờng kính v t bệnh xoài Đài Loan mẫu phân lập C asianum C acutatum gây ngày sau lây nhiễm Số vết bệnh/vết lây nhiễm Lồi Khơng vết thương 2NSC 4NSC TB 2,7/9 5,3/9 TB 3,7/9 6,3/9 Đường kính vết bệnh (mm) Vết thương Vết thương Không vết thương thương 2NSC 4NSC 4NSC 4NSC Colletotrichum asianum 7,1/9 8,9/9 6,5 13,4 Colletotrichum acutatum 7,3/9 9/9 3,1 11,6 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy; TB: trung bình 29 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 Hình Triệu chứng gây bệnh nấm C acutatum NSC Hình Triệu chứng gây bệnh nấm C asianum NSC Bảng Số v t bệnh xoài nấm C asianum C acutatum gây Số vết bệnh/vết chủng Lồi nấm Mẫu Khơng vết thương Vết thương 2NSC 4NSC 2NSC 4NSC C asianum TB 5,8/9 6/9 8,9/9 9/9 C acutatum TB 7/9 7/9 9/9 9/9 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy; TB: trung bình Hình Triệu chứng gây bệnh C acutatum C asianum NSC, điều kiện gây v t thƣơng không gây v t thƣơng KẾT LUẬN Dựa vào kết hình thái, sinh học kết sinh học phân tử (trên trình tự vùng gen Tub2, Act, Gs Gpdh) xác định 24 30 chủng nấm bệnh thán thư gây hại lá, hoa giống xồi trồng phổ biến tỉnh phía Nam, Việt Nam hai loài nấm gây Colletotrichum asianum Colletotrichum Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 acutatum, tần suất xuất loài Colletotrichum asianum (20 mẫu) chiếm tỷ lệ cao so với loài Colletotrichum acutatum (4 mẫu) Các mẫu Colletotrichum có khả gây hại lá, hoa giống xoài Đài Loan Nấm Colletotrichum asianum gây hại hoa mạnh so với Colletotrichum acutatum, ngược lại mẫu Colletotrichum acutatum gây hại mạnh so với mẫu Colletotrichum asianum 34 In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M Innis, D Gelfand, J Sninsky and T White , eds.) Academic Press, Orlando, Florida Lynch J M., Slater J H., Jacqueline A Bennett and Harper H T., 1981 Cellulase Activities of Some Aerobic Micro-organisms Isolated from Soil Journal of General Microbiology 127: 231 – 236 Ploetz Randy C., 2003 Diseases of Tropical Fruit Crops CAB International 2003 pp 327 – 364 10 Prihastuti, H., Cai, L., Chen, H., McKenzie, E.H.C and Hyde, K.D (2009) Characterization of Colletotrichum TÀI LIỆU THAM KHẢO species associated with coffee berries in northern Thailand Fungal Diversity 39: 89-109 Arauz L.F., 2000 Mango Anthracnose 11 Prusky Dov, Stanley Freeman & Martin B Economic Impact and Current Options for Intergrate Dickman, 2000 Colletotrichum – Host Specificity, Mango Plant Disease, Vol 84 No pp 600 – 611 Pathology, and Host-Pathogen Interaction APS Damm U., Cannon PF., Woudenberg JHC., Crous PW., 2012 The Colletotrichum acutatum Press, the American Phytopathology Society st Paul, Minnesota 393 pp species complex Studies in Mycology 73: 37–113 Cai, L., Hyde, K.D., Taylor, P.W.J., Weir, B.S., Waller, J., Abang, M.M., Zhang, J.Z., Yang, 12 Paull, R.E., Duarte, O., 2011 Tropical Fruits nd CAB International 2011 13 Phoulivong S., 2011 Colletotrichum, Y.L., Phoulivong, S., Liu, Z.Y., Prihastuti, H., naming, control, resistance, biocontrol of weeds and Shivas, R.G., McKenzie, E.H.C and Johnston, P.R current (2009) Environmental & Applied Mycology 1(1), 53–73 A polyphasic approach for studying Colletotrichum Fungal Diversity 39: 183-204 Honger, O., Offei, S.K., Oduro, K.A George, Odamtten, T and Nyaku, T.S., 2014 Identification and species status of the mango biotype of challenges Current Research in 14 Sutton B.C., 1995 The Coelomycetes fungi Imperfecti with pycnidia Acervuli and Stromata, pages 523-537 15 Talhinhas Pedro, Sreenivasaprasad S., Colletotrichum gloeosporioides in Ghana European Martins João Neves-, and Oliveira Helena, 2002 Journal of Plant Pathology , Volume 140: 455-467 Genetic Krishnapillai N, Wilson Wijeratnam RS, 2014 First Report of Colletotrichum asianum causing anthracnose on Willard mangoes in Sri Lanka New Disease Reports 29, 1.2 and Morphological Characterization of Colletotrichum acutatum Causing Anthracnose of Lupins Phytopathology vol.92: 986-996 16 Vieira, A., Hyde, K.D., W P A., S Michereff,S.J., Câmara., P.S., Morais, 2013 Lê Hoàng Lệ Thủy Phạm Văn Kim, 2008 Endophytic species of Colletotrichum associated Phân loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư with mango in northeastern Brazi Fungal Diversity: xoài sầu riêng Đồng sông Cửu long Volume 67, Issue 1, pp 181-202 thử hiệu lực sáu loại thuốc loài 17 Weir BS, Johnston PR, Damm U., 2012 The nấm nầy Tạp chí Khoa học 2008:10, Trường Đại Colletotrichum gloeosporioides species complex học Cần Thơ Studies in Mycology 73: 115–180 Lee S.B and Taylor J.W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, Chapter Phản biện: TS Lê Mai Nhất 31 ... Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 6/2019 Hình Triệu chứng gây bệnh nấm C acutatum NSC Hình Triệu chứng gây bệnh nấm C asianum NSC Bảng Số v t bệnh xoài nấm C asianum C acutatum gây Số vết bệnh/ vết... (2011) đề xuất tác nhân gây bệnh thán thư xoài C gloeosporioides C acutatum Kết phù hợp với nghiên cứu phân tử chi Colletotrichum gây bệnh thán thư xoài, nghiên cứu Vieira cs (2013) Braxin, Honger... nhiễm bệnh) *100 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum gây bệnh thán thƣ xoài Kết phân lập định danh dựa đặc điểm hình thái kỹ thuật phân tử xác định loài nấm gây hại xoài