Nghiên cứu nấm alternaria spp gây bệnh đốm nâu trên chanh dây (passiflora edulis) TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM PHAN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NẤM Alternaria spp GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis) Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9.62.01.12 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP TP HCM – Năm 2021 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đình Đơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Vào hồi ……giờ … ngày …… tháng … năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh - Thư viện Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Chanh dây (Passiflora edulis) loại trồng từ kỷ XIX Châu Âu (CABI, 2007) Chanh dây trồng nhiều Việt Nam chủ yếu tập trung Đắk Nông Lâm Đồng; sau tỉnh Đắk Lắk, Gia Lai, Kon Tum, Sơn La, Nghệ An, Cao Bằng Theo Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập II (2011), có nhiều tác nhân gây bệnh chanh dây; đó, bệnh nấm Alternaria spp có tần suất xuất nhiều nhất, làm ảnh hưởng đến suất chất lượng chanh dây Theo Nguyễn Văn Tuất cộng (2019), năm 2015 - 2016 phát 11 bệnh gây hại chanh dây 11 loài vi sinh vật gây (5 loài nấm, loài vi khuẩn, loài virus loài tuyến trùng), số bệnh hại ghi nhận chanh dây khơng nhiều có tới 10/11 loại bệnh có mức độ xuất từ trung bình (++) đến nhiều (+++); đó, bệnh đốm nâu Alternaria passiflorae bệnh xuất nhiều gây hại nguy hiểm Alternaria passiflorae Alternaria alternata hai loài nấm gây bệnh chanh dây vào giai đoạn trước thu hoạch Mauritius (Đông Phi) Bệnh đốm nâu lá, thân Alternaria spp gây bệnh quan trọng phổ biến (CABI, 2007; Rheinlander, 2010) Ngành trồng chanh dây Kenya bị giảm 80 – 100 % suất tác nhân Fusarium oxysporum f sp passiflorae, Fusarium spp., Phytophthora spp., Alternaria passiflorae, Fusarium solani, Colletotrichum passiflorae phức hợp virus passion fruit woodiness virus (Amata cộng sự, 2009) Alternaria chi nấm có phổ ký chủ rộng, nấm xâm nhập gây bệnh cho trồng giai đoạn trước sau thu hoạch Nhiều loài Alternaria mô tả, hầu hết gây bệnh trồng số khác gây hại thực phẩm (Ostry, 2008) Ngồi ra, cịn có lồi sinh độc tố như: acid tenuazonic, alternariol monomethylether, alternariol, altenuene, tenuazonic acid altertoxin I, II, III loại sản phẩm thực phẩm bị nhiễm Alternaria làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Alternaria chi nấm lớn khó định danh đến loài, theo Simmons (2007), riêng Alternaria gây hại thuộc chi Passiflora có đến chín lồi khác Hiện diện tích trồng chanh dây phát triển đến 10,5 nghìn ha, chưa nghiên cứu sinh vật gây hại biện pháp phòng trừ cách Có thể xem chanh dây trồng với nguồn giống nhập nội, nghiên cứu bệnh hại chanh dây đáp ứng thực tiễn sản xuất tương lai cần thiết Kết điều tra thành phần bệnh hại chanh dây Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập II (năm 2011) cho thấy Alternaria spp tác nhân gây bệnh đốm nâu, loại bệnh cần nghiên cứu xây dựng sở liệu tác nhân, ký chủ phụ nguồn gốc nguồn gây bệnh nhằm cung cấp số liệu khoa học làm sở cho việc nghiên cứu biện pháp phòng trừ giúp sản xuất bền vững chanh dây Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án Xác định tác nhân gây bệnh đốm nâu lá, chanh dây Việt Nam số đặc điểm sinh học, khả gây bệnh làm sở cho đề xuất biện pháp phòng trừ Những đóng góp luận án Kết luận án xác định có hai lồi thuộc Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh dây, A passiflorae A tenuissima, triệu chứng đặc điểm gây bệnh có khác biệt Trong đó, A tenuissima lồi phân lập nguồn giống chanh dây nhập nội Trình tự vùng rDNA-ITS, ACT, GPDH 23 mẫu phân lập Alternaria đưa vào genbank nguồn liệu cho nghiên cứu so sánh dịch tễ phân tử Xác định phổ ký chủ nấm A passiflorae A tenuissima giúp việc quản lý phịng trừ bệnh đốm nâu; cơng tác quy hoạch vùng trồng cấu trồng phù hợp với chanh dây nhằm hạn chế thiệt hại nấm Alternaria spp gây Ý nghĩa khoa học luận án Xác định hai loài Alternaria gây bệnh chanh dây Việt Nam A passiflorae A tenuissima với triệu chứng đặc điểm gây bệnh khác biệt Trong đó, A tenuissima phát nguồn nhập gốc ghép chanh dây giống Đã cơng bố 23 trình tự DNA vùng rDNA-ITS (ribosomal DNA internal transcribed spacer), ACT (actin) GPDH (glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase) genbank nguồn sở liệu phân tử Alternaria phân lập Việt Nam, phục vụ cho nghiên cứu so sánh dịch tể phân tử bệnh đốm nâu chanh dây Đặc điểm gây bệnh hai loài thuộc Alternaria loại trồng sở khoa học cho nghiên cứu tính gây bệnh chọn lọc ký chủ nấm ký sinh Ý nghĩa thực tiễn luận án Định danh đến loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh dây, đóng góp vào sở liệu tác nhân gây bệnh trồng Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cơng tác kiểm dịch thực vật xác định nguồn bệnh ban đầu cho vùng trồng chanh dây Xác định ký chủ hai lồi A passiflora A tenuissima có ý nghĩa quan trọng quy hoạch cấu trồng, vùng trồng phòng trừ bệnh Alternaria gây Đối tƣợng nghiên cứu luận án Chi Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh dây Phạm vi nghiên cứu luận án Phân lập, định danh mẫu nấm Alternaria dựa vào đặc điểm hình thái trình tự vùng rDNA-ITS, ACT GPDH Khảo sát số đặc điểm sinh học mẫu phân lập đại diện cho loài Alternaria, đánh giá khả gây bệnh loài thuộc Alternaria chanh dây giống Đài Nông số loại ký chủ phổ biến Bố cục luận án Luận án thức gồm có chương ,149 trang Các phần: Mở đầu (4 trang), tổng quan (23 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (23 trang), kết thảo luận (88 trang), kết luận đề nghị (2 trang); 42 bảng số liệu 40 hình Luận án tham khảo tổng cộng 106 tài liệu 13 tài liệu tiếng Việt 93 tài liệu tiếng Anh Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh hại chanh dây Theo CABI (2007), ghi nhận bệnh quan trọng chanh dây bệnh đốm nâu Alternaria passiflorae gây hại lá, cành Một số bệnh quan trọng khác Xanthomonas campestris pv passiflorae, Phytophthora nicotianae, Cladosporium cladosporioides làm giảm suất chất lượng Bệnh nấm Septoria passiflorae gây hại lá, thân chanh dây Bệnh héo Fusarium oxysporum f.sp passiflorae gây héo chồi, sau gây héo Trong giai đoạn vườn ươm chanh dây bị bệnh héo cành nấm Thanatephorus cucumeris Pythium spp gây Một số bệnh virus, đáng ý virus gây hóa gỗ Passionfruit woodiness virus (PWV), virus gây bệnh tiềm ẩn Passiflora latent virus (PLV) Passionfruit ringpot virus Các bệnh lây lan rệp (Aphis gossypii, Myzus persicae) dao cắt tỉa (CABI, 2020) Ở Việt Nam, nghiên cứu ghi nhận có loài A passiflorae, A sesami gây bệnh đốm nâu chanh dây (Võ Thị Dung, 2019; Nguyễn Văn Tuất cộng sự, 2019) 1.2 Triệu chứng gây hại Alternaria chanh dây Triệu chứng Alternaria passiflorae Alternaria alternata gây bệnh chanh dây khác biệt Alternaria passiflorae gây đốm có màu nâu đỏ lá, đường kính vết bệnh mm, phát triển rộng điều kiện độ ẩm cao, bào tử cành bào tử nấm tìm thấy trung tâm vết bệnh Bệnh làm cho bị rụng, vết bệnh nhỏ, thuôn dài, màu tối, có vịng đồng tâm; bệnh xuất cuống lá, cành, làm cho khô dẫn đến chết cành Ngồi ra, bệnh cịn gây hại quả, vết bệnh đốm trịn, màu nâu đỏ, đường kính lớn cm, xuất giai đoạn phát triển gây thiệt hại đến chất lượng thương phẩm Ngược lại, triệu chứng nấm A alternata gây đốm nhỏ, đường kính vết bệnh – mm, với quầng vàng Trên đốm có màu xanh đậm, mép trịn Alternaria alternata lồi mang tính độc cao nguyên nhân gây tượng rụng chanh dây (Manicom cộng sự, 2003) 1.3 Các độc tố sinh từ Alternaria Alternaria sản sinh 70 độc tố nhờ chuyển hóa thứ cấp, tỷ lệ nhỏ độc tố thực vật (phytotoxin) xác định đặc tính hóa học báo cáo tác động độc tố nấm (mytotoxin) đến người động vật Dựa tác dụng Alternaria trồng, độc tố Alternaria chia làm loại: độc tố khơng chun tính ký chủ (Non host specific toxins) độc tố chuyên tính ký chủ (Host specific toxins) Một số độc tố không chọn lọc ký chủ alternariol (AOH), alternariol monomethyl ether (AME), acid tenuazonic (TeA) altertoxins thử nghiệm riêng lẻ mơ tả có khả gây tác động có hại cho động vật, bao gồm tác động gây độc cho thai nhi gây quái thai ( Trích dẫn EFSA, 2011) 1.4 Một số kết nghiên cứu di truyền định danh Alternaria Phân tích di truyền quần thể tác nhân gây bệnh thực vật tảng cho hiểu biết dịch tễ học, q trình tiến hóa ký chủ tác nhân gây bệnh quản lý tính kháng (Kusaba Tsuge, 1994, 1995; Milgroom Fary, 1997) Nghiên cứu đa dạng di quần thể Alternaria thị phân tử RFLP, AFLP, RAPD, rDNA-ITS, rDNA SSU chứng minh có đa dạng di truyền lớn mẫu phân lập Alternaria chí nhóm lồi (Keissler, 1912; William cs, 1990; Welsh McClelland, 1990; Morris cs, 2000; Peever cs, 2000; Pryor Gilberton, 2000; Chou Wu, 2002; Iram Ahmad, 2005; Gherbawy, 2005; Philipp cs, 2007; Valdir, 2009; Francisco cs, 2009; Linde cs, 2010; Maria cs, 2010; Nasim, 2012; Bashir cs, 2014; Woudenberg cs, 2015) Nghiên cứu mức độ phân tử cho thấy phức hợp Alternaria nhánh loài Alternaria chi lúc tương quan với nhóm lồi dựa đặc tính hình thái (Simmons, 2007; Mmbaga, 2011; Lawrence, 2012; Woudenberg, 2013) Zur cộng (2002) phát triển primer PCR vùng ITS phát A alternata A solani, thất bại việc phân biệt hai loài Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 1) Xác định tên lồi khảo sát số đặc tính sinh học, đặc điểm hình thái mẫu phân lập Alternaria spp gây bệnh đốm nâu chanh dây 2) Xác định khả gây bệnh loài Alternaria spp chanh dây xác định cỏ dại, trồng nhiễm Alternaria vườn chanh dây bị bệnh đốm nâu 3) Đánh giá khả gây bệnh mẫu phân lập Alternaria spp số loại ký chủ 4) Xác định diện độc tố alternariol sinh từ Alternaria spp khảo sát ảnh hưởng hợp chất thứ cấp sinh từ Alternaria spp đến khả gây bệnh lá, chanh dây 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Đề tài tiến hành từ tháng 12 năm 2013 đến tháng năm 2020 Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập II, Viện Công nghệ sinh học môi trường thuộc trường Đại học Nông lâm TP.HCM Trung tâm Kiểm định Khảo nghiệm thuốc bảo vệ thực vật phía Nam thuộc Cục Bảo vệ thực vật 2.3 Vật liệu nghiên cứu Cây chanh dây cho màu tím chín (Passiflora edulis f edulis - giống Đài Nơng 1) chanh dây cho màu vàng chín (Passiflora edulis f flavicarpa – giống gốc ghép); Các loại rau màu, ăn quả, công nghiệp; Môi trường nuôi cấy nấm: WA, Modified – CMA, PCA V – juice; 97 mẫu Alternaria phân lập chanh dây bị bệnh đốm nâu Đắk Nông, Lâm Đồng chanh dây giống nhập từ Đài Loan qua cảng hàng không Tân Sơn Nhất 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh bảo quản mẫu Thu thập mẫu bệnh từ vườn trồng chanh dây tỉnh Đắk Nông, Lâm Đồng theo phương pháp McMaugh (2008); Thu thập chanh dây giống nhập từ Đài Loan cảng hàng không Tân Sơn Nhất theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-141: 2013/BNNPTNT 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập tác nhân gây bệnh Áp dụng theo phương pháp Shivas cộng (2005) 2.4.3 Phƣơng pháp thu đơn bào tử Theo phương pháp McKenzie (2008) Siciliano (2017) 2.5 Phƣơng pháp xác định tên loài MPL Alternaria spp dựa vào đặc điểm hình thái 2.5.1 Phƣơng pháp đo kích thƣớc bào tử Đo kích thước bào tử nấm theo chiều dài chiều rộng vị trí lớn kính hiển vi quang học; đo ngẫu nhiên 30 bào tử, 10 cành bào tử có kích thước lớn nhỏ khác 2.5.2 Phƣơng pháp ni ủ nấm lam kính Ni ủ nấm lam kính thực theo phương pháp Eric (2008) 2.5.3 Mô tả định danh lồi Alternaria dựa vào đặc điểm hình thái chụp hình kính hiển vi điện tử quét (SEM) Sử dụng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái định danh dựa vào khóa phân loại, định danh Simmons (2007) Các MPL Alternaria chọn gửi mẫu chụp hình kính hiển vi điện tử quét SU3500 Công ty TNHH Sao Đỏ (Hà Nội) 2.6 Xác định tên loài MPL Alternaria spp dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS, actin glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase 2.6.1 Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số DNA tổng số ly trích theo quy trình Lee Taylor (1990) có cải tiến 2.6.2 Phƣơng pháp khuếch đại vùng rDNA-ITS, actin glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase Sử dụng ba cặp primer: ITS4, ITS5; ACT512F, ACT783R GDF1, GDR1 để khuếch đại vùng rDNA-ITS, actin glyceraldehyde – – phosphate dehydrogenase Sản phẩm PCR gửi mẫu giải trình tự nucleotide công ty MacroGen Hàn Quốc 2.7 Khảo sát số đặc tính sinh học MPL Alternaria spp 2.7.1 Khả sinh trƣởng Alternaria spp số môi trƣờng dinh dƣỡng khác Sáu mươi mốt mẫu nấm loài A passiflorae 36 mẫu A tenuissima nuôi cấy loại môi trường: Modified – CMA, PCA V – juice Nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần với lồi A passiflorae lần với loài A tenuissima, lần lặp lại đĩa petri, đo đường kính tản nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau cấy 2.7.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh trƣởng Alternaria spp 2.7.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh trƣởng Alternaria Mỗi loài Alternaria thử nghiệm với mức nhiệt độ 15ᵒC, 20ᵒC, 25ᵒC, 30ᵒC, 35ᵒC 38ᵒC mơi trường PCA; Nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần với loài A passiflorae lần với loài A tenuissima, lần lặp lại đĩa petri, đo đường kính tản nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau cấy 2.7.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sống sót bào tử nấm Alternaria Chọn 10 MPL đại diện cho A passiflorae A tenuissima Dùng micropipette hút 10 ml dịch bào tử nồng độ 105 bào tử/ml cho vào ống nghiệm nhúng ống nghiệm vào bồn gia nhiệt 10 phút với mức nhiệt độ: 35ᵒ C, 36ᵒ C, 37ᵒ C, 38ᵒ C, 39ᵒ C, 40ᵒ C, 41ᵒ C, 42ᵒ C, 43ᵒ C, 44ᵒ C, 45ᵒ C, 46ᵒ C, 47ᵒ C, 48ᵒ C, 49ᵒ C 50ᵒ C, nghiệm thức đối chứng nhúng ống nghiệm bồn không gia nhiệt Sử dụng micropipette hút ml dịch bào tử nấm ủ vào đĩa petri có chứa mơi trường PCA đặt đĩa petri nhiệt độ phòng (25 2ᵒ C) Nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại đĩa petri Quan sát khả phát triển khuẩn ty sau ủ xác định khả sống sót bào tử 1, 2, 3, 4, ngày sau cấy 2.7.3 Ảnh hƣởng thời gian chiếu sáng đến khả sinh trƣởng Alternaria spp Chọn 10 mẫu đại diện cho A passiflorae A tenuissima thử nghiệm với nghiệm thức tương ứng với chế độ ánh sáng: tối liên tục, sáng liên tục 12 sáng: 12 giớ tối mơi trường PCA Nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại đĩa petri, đo đường kính tản nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau ủ 2.7.4 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh trƣởng Alternaria spp Mỗi loài Alternaria thử nghiệm 11 mức pH: 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; môi trường PCA Nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần, lần lặp lại đĩa petri, đo đường kính tản nấm 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau cấy 2.8 Xác định khả gây bệnh MPL Alternaria spp lá, 11 Sử dụng chanh dây Đài Nơng 1, có thật rửa cồn 70ᵒ, sau rửa lại nước cất vô trùng lần Nhân nuôi nấm bình thủy tinh có chứa 100ml dung dịch môi trường Modified Fries No.3, PG PC Sau 7, 14 21 ngày nuôi ủ, lọc bỏ khuẩn ty bào tử nấm dung dịch, dùng micropipette hút dung dịch nuôi cấy cho vào ống eppenndorf ly tâm 6.600 vịng/phút vịng 10 phút Sau đó, dùng đầu lọc 2m để lọc dung dịch Lấy 10ml dung dịch lọc cho vào ống nhựa vô trùng để tiến hành cắm chanh dây Thí nghiệm bố trí với dung dịch ni cấy tương ứng với mức thời gian nuôi nấm 7, 14 21 ngày Mỗi thời gian nuôi cấy môi trường chủng với lần lặp lại, lần lặp lại gồm chanh dây Cắm vào ống chứa 10ml dung dịch nuôi cấy Theo dõi số rụng 3, 5, ngày sau cắm 2.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng hợp chất thứ cấp sinh từ Alternaria spp độc tố alternariol đến khả gây bệnh lá, chanh dây Thí nghiệm chủng chanh dây Đài Nông với lần lặp lại, lần lặp lại gồm Sử dụng kim ghim côn trùng số để gây vết thương vị trí khác Hút 20 µl dung dịch SS, AAS, AOH, nước cất vô trùng (H2O), dung dịch môi trường nuôi cấy (MT); tiến hành nhỏ dung dịch lên vị trí gây vết thương Đặt vừa chủng nhiệt độ 25ᵒC, tối Theo dõi biểu triệu chứng bệnh nghiệm thức ghi nhận kết ngày sau chủng 2.11 Phƣơng pháp xử lý số liệu Tính giá trị trung bình, SD vẽ đồ thị phần mềm Excel Số liệu trình tự DNA gióng cột, sử dụng phần mềm BioEdit version 7.0.5.3, MEGA X version 10.1.7 12 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định tên lồi, đặc tính sinh học đặc điểm hình thái mẫu phân lập (MPL) Alternaria spp 3.1.1 Phân lập định danh loài Alternaria dựa vào đặc điểm hình thái Kết ghi nhận có loài Alternaria passiflorae A tenuissima gây bệnh gây bệnh đốm nâu chanh dây A C B D E Hình 3.1 Triệu chứng bệnh đốm nâu chanh dây Alternaria spp gây (A, C): Triệu chứng bệnh A passiflorae; (B, D): Triệu chứng bệnh A tenuissima; (E): Triệu chứng bệnh A tenuissima gây chanh dây giống nhập từ Đài Loan A B C D Hình 3.2 Hình bào tử A tenuissima A passiflorae kính hiển vi điện tử quét SU3500, gia tốc kV, hình ảnh thu đầu dị SE (A, B): Bào tử A tenuissima (mẫu CDNK7.13); (C, D): Bào tử A passiflorae (mẫu LD16L-01.1) 3.1.2 Phân tích trình tự vùng rDNA-ITS, actin glyceraldehyde - phosphate dehydrogenase DNA tổng số 23 MPL ly trích theo quy trình Lee Taylor (1990) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm Sản phẩm DNA khuếch đại PCR với ba cặp primer ITS4 – ITS5, ACT512F – ACT783R GDF1 – GDR1 tương ứng với ba vùng rDNAITS, actin glyceraldehydes – – phosphate dehydrogenase So sánh trình tự tƣơng đồng 13 Bảng 3.1 Số lượng vị trí đa hình mẫu phân lập tương ứng vùng gen Mẫu phân lập Vùng gen ACT GPDH ITS Tổng Chiều dài so dòng (bp) 243 177 622 1.042 Chiều dài trung 243 174 591 1.008 bình (bp) CDNK1.13 CDNK7.13 DL01L-9.14 DN11T-1.16 DN1C-1.18 DN1T-4.11 DN2C-1.18 DN3C-1.18 DN8L-2.11 DN8T-4.11 DN9L-1.10 LD11L-1.10(2) LD12T-5.10 LD16L-1.14 LD17L-1.10 LD18L-14(2) LD1C-1.18 LD1L-2.11(2) LD1T-1.15 LD1T-1.16 LD2T-1.16 LD4C-1.18 LD4T-3.10 0 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 3 17 17 23 22 23 22 22 22 22 22 22 22 22 44 23 22 7 22 22 31 34 31 29 46 31 33 32 45 32 33 31 30 6 33 30 11 17 10 71 73 71 68 85 70 72 71 84 71 72 67 71 69 17 10 16 72 69 Phần trăm đột biến tổng 1.008 Nu 0,00 1,09 1,69 0,99 7,04 7,24 7,04 6,75 8.43 6,94 7,14 7,04 8,33 7,04 7,14 6,65 7,04 6,85 1,69 0,99 1,59 7,14 6,85 14 Bảng 3.2 Số vị trí đa hình vùng gen 23 MPL Alternaria Vùng gen ACT GPDH rDNA-ITS Tổng Chiều dài so hàng 243 177 622 1.042 Chiều dài trung bình (bp) 243 174 591 1.008 Vị trí đa hình 17 47 81 145 Phân tích đa hình Trình tự kết hợp vùng gen sau so hàng có chiều dài 1.042 nu (chiều dài trung bình 1.008 nu) từ 23 mẫu phân lập Alternaria spp Có tổng cộng 145 vị trí đa hình, tương đương với 14,4% so với tổng chiều dài đoạn không gián đoạn Sự khác biệt nucleotide cố định không cố định nhánh di truyền quan sát thể vị trí (bảng 3.2) Phân tích tƣơng quan di truyền Các mẫu phân lập (MPL) từ chanh dây nhập có mối tương quan di truyền gần gũi với MPL từ Lâm Đồng Đắk Nông Các MPL từ vùng Lâm Đồng có mức đa dạng di truyền cao Các MPL từ vùng Đắk Nơng có mức đa dạng di truyền thấp hơn, tần suất xuất MPL nhánh phân loại so với phân lập từ vùng Lâm Đồng Vùng ACT vùng gen có mức ổn định di truyền cao nhất, khả phân nhánh thấp so với vùng rDNA-ITS có mức biến động di truyền cao nhất, khả phân nhánh cao Dựa vào kết nghiên cứu này, vùng gen ACT sử dụng để nghiên cứu tính ổn định di truyền quần thể ngược lại vùng rDNA-ITS áp dụng nghiên cứu sâu đặc tính đa dạng quần thể (Hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5) Kết nghiên cứu cho thấy mẫu nấm Alternaria có mối liên quan đa dạng di truyền cao Trình tự vùng rDNA-ITS, ACT, GPDH 23 mẫu phân lập Alternaria đưa vào genbank nguồn liệu cho nghiên cứu so sánh (bảng 3.3) 15 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loài 23 mẫu phân lập Alternaria xây dựng dựa vùng rDNA-ITS sử dụng phần mềm MEGA X với hệ số bootstrap 1.000 lần lặp lại Hình 3.4 Cây phát sinh chủng lồi 23 mẫu phân lập Alternaria xây dựng dựa vùng ACT sử dụng phần mềm MEGA X với hệ số bootstrap 1.000 lần lặp lại 16 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loài 23 mẫu phân lập Alternaria xây dựng dựa vùng GPDH sử dụng phần mềm MEGA X với hệ số bootstrap 1.000 lần lặp lại Bảng 3.3 Mã số ngân hàng gen (GenBank accession number) 23 MPL Alternaria xác định nghiên cứu Loài Alternaria Mẫu phân lập A tenuissima A tenuissima A tenuissima A tenuissima A tenuissima A tenuissima A tenuissima A tenuissima A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae LD1T-1.15 DL01L-9.14 CDNK-7.13 CDNK-1.13 LD18L-14(2) LD2T-1.16 LD1T-1.16 DN11T-1.16 DN8L-2.11 DN9L-1.10 LD17L-1.10 DN1T4.11 DN8T-4.11 LD4C-1.18 LD1C-1.18 DN2C-1.18 DN1C-1.18 Accession number a ITS ACT GPDH MN955453 MT479099 MT479121 MN955454 MT479098 MT479120 MN955455 MT479094 MT479117 MN955456 MT479093 MT479116 MT239522 MT479097 MT479136 MN955459 MT479100 MT479122 MN955460 MT479095 MT479119 MN955461 MT479096 MT479118 MN955463 MT479105 MT479128 MN955464 MT479107 MT479130 MN955465 MT479115 MT479136 MN955466 MT479102 MT479126 MN955467 MT479106 MT479129 MN955468 MT479110 MT479134 MN955469 MT479110 MT479125 MN955470 MT479103 MT479124 MN955471 MT479101 MT479123 17 A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae A passiflorae DN3C-1.18 LD4T-3.10 LD1L-2.11sp(2) LD16L-01.14 LD11L-1.10sp(2) LD12T-5.10 MN955472 MN955473 MN955474 MN955475 MN955476 MT239521 MT479104 MT479111 MT479109 MT479114 MT479112 MT479112 MT479127 MT479132 MT479131 MT479135 MT479136 MT479133 3.2 Đặc tính sinh học MPL Alternaria Kết ghi nhận loài A tenuissima A passiflorae sinh trưởng tốt mơi trường PCA; Nhiệt độ thích hợp 25 – 30oC; Bào tử nấm có khả sống sót ngưỡng nhiệt độ 45 – 48 oC (loài A tenuissima) 45 – 50oC (loài A passiflorae); Ánh sáng pH ảnh hưởng đến khả sinh trưởng A tenuissima A passiflorae 3.3 Tính gây bệnh MPL Alternaria spp lá, chanh dây xác định cỏ dại, trồng nhiễm Alternaria vƣờn chanh dây bị bệnh đốm nâu 3.3.1 Khả gây bệnh MPL Alternaria chanh dây 3.3.1.1 Kết chủng bệnh chanh dây A B C D E F G H I Hình 3.6 Triệu chứng bệnh đốm nâu chanh dây A passiflorae A tenuissima gây sau ngày chủng bệnh (A, D, G): đối chứng không bệnh; (B, E, H): chủng bệnh có gây vết thương; (C, F, I): chủng bệnh không gây vết thương;(B, C): A passiflorae gây bệnh; (E, F, H, I): A tenuissima gây bệnh; (A-F): giống Đài Nông 1; (G-I): giống mắt ghép Thí nghiệm chủng bệnh có gây vết thương, 98,59% số mẫu A passiflorae gây bệnh chanh dây sau ngày chủng bệnh 1,41% mẫu khả gây bệnh điều kiện chủng bệnh nhân tạo Các MPL 18 A passiflorae tạo vết bệnh với kích thước khác Khi chủng bệnh khơng gây vết thương 69,01% MPL A passiflorae có khả gây bệnh với đường kính vết bệnh dao động từ 0,19 – 5,78 mm 30,99% khơng có khả gây bệnh A tenuissima xác định gây hại chanh dây trồng Đắk Nông, Lâm Đồng diện nguồn giống nhập từ Đài Loan Các mẫu gây bệnh với kiểu chủng khơng gây vết thương có đường kính vết bệnh nhỏ mẫu gây bệnh với kiểu chủng có gây vết thương 3.3.1.2 Kết chủng bệnh chanh dây Đối chứng Đối chứng A B Hình 3.7 Triệu chứng bệnh chanh dây sau 14 ngày chủng bệnh (A): Chủng A passiflorae (mẫu DN15T-1.10(1)); (B): Chủng A tenuissima (mẫu CDNK7.13) Trong 29 MPL A passiflorae có 65,52% mẫu khả gây bệnh chanh dây 34,48% MPL khơng gây bệnh có gây bệnh Các MPL A passiflorae gây bệnh với kích thước vết bệnh khác nhau, từ 2,00 – 8,39 mm sau 14 ngày theo dõi MPL A tenuissima gây bệnh với kích thước vết bệnh nhỏ MPL A passiflorae, dao động từ 2,11 – 7,56 mm có MPL A tenuissima khơng có khả gây bệnh sau 14 ngày chủng bệnh 3.4 Xác định cỏ dại, trồng nhiễm Alternaria vƣờn chanh dây bị bệnh đốm nâu Có lồi nấm gây bệnh đốm cỏ trồng xen, trồng xung quanh vườn chanh dây Đắk Nông Lâm Đồng, bao gồm: Alternaria spp., Curvularia sp., Puccinia sp., Septoria sp., Nigrospora sp., Pseudocercospora sp., Colletotrichum sp Phoma sp., Helminthosporium sp Puccinia sp Vùng trồng chanh dây Lâm Đồng, Alternaria spp diện cỏ cứt lợn, cỏ song nha lông; Đắk Nơng xuất cỏ cứt lợn, cỏ song nha lông cỏ mần trầu Quan sát hình thái, phân tích di truyền 19 vùng rDNA-ITS, ACT, GPDH chủng bệnh nhân tạo bước đầu xác nhận Alternaria spp gây hại loại cỏ vườn chanh dây loài A passiflorae 3.5 Đánh giá khả gây bệnh MPL Alternaria spp số trồng phổ biến A F B G C D H E I Hình 3.8 Triệu chứng bệnh A passiflorae gây loại trồng sau 20 ngày chủng bệnh (A): Cây bí đỏ; (B): bầu; (C): khổ qua; (D, E): khoai lang; (F, I): ớt; (G): cải xanh; (H): cà chua Tính gây bệnh A passiflorae A tenuissima xác định cách chủng bệnh nhân tạo cắt rời 10 loại 12 loại trồng điều kiện nhà lưới Kết cho thấy A tenuissima có khả gây bệnh điều, bưởi, cao su, bầu, bí đỏ, cải ngọt, cải bẹ xanh cà chua Trong đó, A passiflorae có khả gây bệnh cao su, nhãn, sầu riêng, bầu, bí đỏ, khổ qua, cải bẹ xanh, khoai lang, ớt, cà chua 3.6 Xác định diện độc tố alternariol ảnh hƣởng hợp chất thứ cấp sinh từ Alternaria spp 3.6.1 Xác định diện độc tố alternariol Alternaria spp phƣơng pháp LC-MS/MS Kết phân tích bảng 3.4 cho thấy 10 số 13 mẫu Alternaria spp thí nghiệm cho kết dương tính độc tố alternariol Mẫu DN3T2.17 cho khả sinh độc tố cao (0,46 µg/ml), 3/13 mẫu mang tính chất định tính, bao gồm mẫu CDNK7.13, mẫu CDNK1.13; LD16L-1.14 với nồng độ mẫu < LOQ khoảng nồng độ 0,01 µg/ml, 3/13 mẫu khơng phát độc tố AOH: mẫu LD1T-1.16; LD2T-1.16 DN11T-1.16 Bảng 3.4 Kết phân tích hàm lượng AOH trung bình mẫu Alternaria 20 Kết chủng bệnh STT Tên loài Mẫu phân lập chanh dây (a) A tenuissima CDNK1.13 + Bệnh A tenuissima CDNK7.13 + Bệnh A tenuissima CDNK18.14(2) 0,03 Bệnh A passiflorae DN9L-1.10 0,065 Bệnh A passiflorae DN8T-4.11 0,045 Bệnh A tenuissima DN11T-1.16 Bệnh A passiflorae DN3T-2.17 0,46 Không Bệnh A passiflorae LD4T-3.10 0,02 Bệnh A passiflorae LD16L-1.14 + Bệnh 10 A tenuissima LD1T-1.16 Bệnh 11 A tenuissima LD2T-1.16 Bệnh 12 A passiflorae DN1C-1.18 0,145 Không bệnh 13 A passiflorae DN3C-1.18 0,02 Bệnh 14 Sclerotium roflsii Mẫu trắng Ghi chú: (+): Phát độc tố AOH nồng độ nhỏ LOQ (< 0,01 µg/ml); (-): Khơng phát độc tố AOH (