Công trình này được tiến hành với mục tiêu xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro cây Hoàng cầm qua đó áp dụng trong nhân nhanh, cung cấp cây giống đầu dòng sạch bệnh và chủ động. Hạt Hoàng cầm sau khi khử trùng bằng dung dịch Presept 0,5% với thời gian 15 phút được gieo trên môi trường chỉ cần nước, đường và agar.
Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 3: 301-310 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(3): 301-310 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOÀNG CẦM (Scutellaria baicalensis Georgi.) Đinh Trường Sơn1*, Bùi Huy Hoàng1, Nguyễn Hải Ninh1, Ninh Thị Phíp2, Phạm Ngọc Khánh3, Đặng Thị Thanh Tâm1, Nguyễn Thị Lâm Hải1, Nguyễn Thanh Hải1 Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trạm Nghiên cứu trồng thuốc Sa Pa - Viện Dược liệu, Thị xã Sa Pa - Lào Cai * Tác giả liên hệ: dtson@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 18.05.2020 Ngày chấp nhận đăng: 28.12.2020 TĨM TẮT Hồng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.) thuốc sử dụng phổ biến dân gian Hoàng cầm di thực trồng số vùng nước ta Tuy nhiên, sinh trưởng phát triển chậm nên chưa phát triển vùng trồng Cây Hoàng cầm nhân giống chủ yếu phương pháp gieo hạt Cơng trình tiến hành với mục tiêu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro Hồng cầm qua áp dụng nhân nhanh, cung cấp giống đầu dòng bệnh chủ động Hạt Hoàng cầm sau khử trùng dung dịch Presept 0,5% với thời gian 15 phút gieo môi trường cần nước, đường agar Mơi trường MS có bổ sung 1mg/l BA phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, hệ số nhân chồi Hoàng cầm đạt 7,47 ± 0,57 chồi/mẫu cấy, chất lượng chồi cụm chồi tốt Bổ sung sucrose nồng độ 20-30 g/l cho sinh trưởng phát triển cụm chồi Hoàng cầm tốt Mơi trường MS có bổ sung IBA nồng độ từ 0,8-1,6 mg/l thích hợp cho giai đoạn tạo hoàn chỉnh, tỷ lệ chồi rễ đạt 100% Có thể áp dụng kết nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống Hoàng cầm cấy mơ Từ khóa: Hồng cầm, Scutellaria baicalensis Georgi., ni cấy mô, in vitro Establishment of in vitro Propagation Protocol for Baikal Skullcap (Scutellaria baicalensis Georgi.) ABSTRACT Baikal skullcap (Scutellaria baicalensis Georgi.), a member of the Lamiaceae family has been commonly used in traditional medicine Baikal skullcap (called “Hoang cam” in Vietnamese) was introduced into Vietnam and has been planted in some areas in this country Due to its naturally slow growth and development, large growing areas have not been developed yet Presently, the most common method of propagation of Baikal skullcap is using its seeds This study was conducted to establish a rapid micropropagation protocol that can be applied for multiplication of elite strains and actively provide the disease-free seedlings The seeds were sterilized using 0.5% Presept solution for 15 min, then placed on a medium containing water, sucrose, and agar for germination Microshoots were highly induced and multiplied (7.47 ± 0.57 shoots/explant) on MS medium supplemented with 1mg/l BA The suitable sucrose concentrations for the growth and development of microshoots were 20 g/l or 30 g/l All shoots were rooted by 100% by adding MS medium supplemented with 0.8-1.6 mg/l IBA Therefore, the established protocol can be applied for in vitro micropropagation of Baikal skullcap Keywords: Baikal skullcap, Scutellaria baicalensis Georgi., plant tissue culture, in vitro ĐẶT VẤN ĐỀ Hoàng cầm thực vật thân thảo sống lâu năm, có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học baicalin, flavonoid, wogonosid, wogonin, aglycones baicalein có tác dụng chống ung thư, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa, chống co giật có tác dụng bảo vệ thần 301 Nghiên cứu nhân giống in vitro Hồng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.) kinh Thêm vào đó, Hoàng cầm sử dụng điều trị nhiều loại bệnh khác kiết lị, tiêu chảy, cao huyết áp, xuất huyết, ngủ, viêm, nhiễm trùng đường hô hấp (Zhao & cs., 2016; Wang & cs., 2018) Trong giai đoạn từ 1969-1977, Viện Dược liệu thực số cơng trình nghiên cứu nhằm di thực Hồng cầm trồng số vùng có khí hậu mát nước ta Tuy nhiên, Hoàng cầm sinh trưởng phát triển chậm nên chưa phát triển vùng trồng Chính vậy, nguồn dược liệu Hoàng cầm phải nhập nội từ Trung Quốc Cây Hoàng cầm nhân giống chủ yếu phương pháp gieo hạt Đây phương pháp nhân giống hiệu áp dụng diện rộng Trên giới, quy trình nhân giống in vitro Hồng cầm nghiên cứu cơng bố (Yamamoto & cs., 1986; Yamamoto, 1991; Stojakowska & cs., 1999) Hoàng cầm đối tượng nghiên cứu nhằm chọn tạo giống phù hợp với điều kiện tự nhiên nước ta Trong phương pháp nhân giống áp dụng phổ biến, kỹ thuật nhân nhanh in vitro vừa cho hệ số nhân cao, giống đồng đều, bệnh đồng thời trì đặc tính q mẹ Tuy nhiên, quy trình nhân giống in vitro Hồng cầm chưa cơng bố Việt Nam Chính vậy, cần thiết phải nghiên cứu xây dựng quy trình nhanh nhanh in vitro Hồng cầm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Vật liệu dùng nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu hạt giống Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.) cung cấp Trạm Nghiên cứu trồng thuốc Sa Pa Viện Dược liệu Các vật liệu nuôi cấy giai đoạn nhân nhanh tạo hoàn chỉnh chồi non, cụm vi chồi cụm chồi 2.2 Phương pháp nghiên cứu Môi trường Murashige and Skoog (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung chất 302 điều tiết sinh trưởng như: 6-Benzylaminopurine (BA), kinetin, -Naphthaleneacetic acid (-NAA) nồng độ khác sử dụng nghiên cứu Môi trường bổ sung g/l agar, điều chỉnh pH = 5,8 trước hấp khử trùng nhiệt độ 121 20 phút Các thí nghiệm thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), lần lặp lại, tối thiểu 10 mẫu/công thức Mẫu cấy nuôi nhiệt độ từ 27-28°C, quang chu kỳ 16 sáng tối, cường độ ánh sáng 2.500 lux, độ ẩm 60-70% Hạt Hoàng cầm ngâm lắc nhẹ dung dịch nước xà phòng loãng (khoảng 0,01%) 10 phút để loại bỏ tạp chất dính bề mặt hạt Sau đó, hạt rửa lại 4-5 lần với nước máy hết xà phòng khử trùng Presept 0,5% (Sản phẩm Johnson & Johnson, có chứa dichloroiso cyanurate) Sau rửa lại lần nước cất khử trùng, hạt cấy lên môi trường tiếp tục ngâm dung dịch GA3 nồng độ 500ppm 10 tiếng trước cấy vào môi trường Dung dịch GA3 khử trùng lọc qua màng lọc vơ trùng Sartorius Minisart, kích thước lọc 0,2m Mẫu cấy giai đoạn nhân nhanh đoạn thân cắt từ in vitro 4-5 tuần tuổi nuôi cấy môi trường MS sinh trưởng tốt Các đoạn thân cắt theo chiều ngang có kích thước khoảng 1cm, mẫu cấy mang mắt ngủ Mẫu cấy cụm vi chồi: cụm vi chồi chứa chồi có kích thước nhỏ, khoảng 1-2mm nên không đếm số vi chồi ban đầu Chính vậy, mẫu cấy cụm vi chồi cụm chồi nhỏ cắt với kích thước khoảng × 3mm Vật liệu cho thí nghiệm tạo hồn chỉnh chồi đơn có chiều cao khoảng 2-3cm, 2-4 lá, chồi sinh trưởng tốt Các thông tin cụ thể trình bày thí nghiệm tương ứng Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) nhân tố phân tích hậu kiểm Fisher’s PLSD với mức P ≤0,05 phần mềm SPSS (version 20) Đinh Trường Sơn, Bùi Huy Hoàng, Nguyễn Hải Ninh, Ninh Thị Phíp, Phạm Ngọc Khánh, Đặng Thị Thanh Tâm, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải ảnh hưởng tới tỷ lệ hạt vi sinh vật nói nhân tố khơng ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm hạt Hoàng cầm Hạt Hoàng cầm nảy mầm với tỷ lệ thấp (chỉ tính tỷ lệ nảy mầm với hạt vi sinh vật) dao động từ 4-8% công thức Điều chứng tỏ tỷ lệ nảy mầm phụ thuộc vào nhân tố khác KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo nguồn vật liệu ban đầu 3.1.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng hạt Hoàng cầm với Presept 0,5% đến tỷ lệ mẫu vi sinh vật khả nảy mầm Trước làm thí nghiệm thử nghiệm gieo hạt không qua xử lý với GA3 môi trường MS kết cho tỷ lệ nảy mầm khoảng 1% Chính vậy, thí nghiệm chúng tơi thử nghiệm xử lý hạt với dung dịch presept nồng độ 0,5% thời gian từ 5-15 phút đồng thời có kết hợp với xử lý GA3 nồng độ 500ppm gieo mơi trường MS có nồng độ giảm nửa (giảm tất thành phần) (Bảng 1) Có nhiều hóa chất thường hay sử dụng trình khử trùng mẫu Presept, hydro peroxide (H2O2), thủy ngân clorua (HgCl2), natri hypochloride (NaOCl)… Tùy loại mẫu cấy mà người ta chọn loại chất khử trùng phù hợp Sodium dichloroisocyanurate hoạt chất khử trùng Presept, sử dụng nồng độ từ 0,5-2,0%, thời gian dài từ 5-90 phút (Mihaljević & cs., 2013; Kendon & cs., 2017) Thêm vào đó, số hạt giống có ngủ nghỉ vào cần thiết phải “phá ngủ” xử lý với GA3 Đối với số hạt giống Prunus yedoensis, Plantago lanceolata L việc phá ngủ cần sử dụng nồng độ GA3 tới hàng ngàn ppm kéo dài tới 24 tiếng (Sarihan & cs., 2005; Kim, 2019) Stojakowska & cs (1999) sử dụng ethanol để rửa hạt Hoàng cầm khử trùng hạt với dung dịch javen 15% Mặc dù vậy, tác giả khơng nêu tỷ lệ hạt Hồng cầm nảy mầm sau gieo hạt (Stojakowska & cs., 1999) GrzegorczykKarolak & cs (2015) sử dụng nước javen 1% 10 phút để khử trùng bề mặt Scutellaria alpina nghiên cứu nhân giống in vitro Trong tỷ lệ nảy mầm hạt Hồng cầm đạt tới 90% (Chen & cs., 2002) tỷ lệ nảy mầm đạt từ 4-8% kết thí nghiệm thấp Kết bảng cho thấy: xu hướng chung tăng thời gian khử trùng làm tăng tỷ lệ mẫu vi sinh vật Thời gian khử trùng 15 phút cho tỷ lệ mẫu cao đạt 68% (CT3) đó, khử trùng phút cho tỷ lệ mẫu đạt 48% (CT1) Cùng thời gian khử trùng với presept 15 phút, khơng xử lý với GA3 tỷ lệ mẫu đạt 68% (CT3) thêm cơng đoạn ủ với dung dịch GA3 500ppm tỷ lệ mẫu tăng lên 84% (CT6) Có thể trình ngâm hạt dung dịch GA3, hạt lắc với thời gian 10 tiếng liên tục máy lắc, sau lại tráng lại lần nước cất vô trùng nên làm tăng hiệu làm vi sinh vật Trong thời gian khử trùng ủ GA3 có Bảng Ảnh hưởng thời gian khử trùng GA3 tới tỷ lệ mẫu vi sinh vật tỷ lệ nảy mầm hạt Hồng cầm sau tuần Cơng thức Thời gian khử trùng với presept (phút) Thời gian ủ với GA3 nồng độ 500ppm Tỷ lệ mẫu vi sinh vật (giờ) (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) CT1 48 CT2 10 40 CT3 15 68 CT4 10 68 CT5 10 10 88 CT6 15 10 84 Ghi chú: Môi trường nền: Môi trường nền: 1/2 MS, 30 g/l sucrose 303 Nghiên cứu nhân giống in vitro Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.) Bảng Ảnh hưởng nồng độ môi trường MS để tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng sau nảy mầm (sau tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ môi trường MS Tỷ lệ nảy hạt mầm (%) Quan sát hình thái CT1 1/4 3,4 Hạt bắt đầu nứt nanh, nảy mầm CT2 1/8 20,0 Cây không rõ thân CT3 1/16 26,7 Cây có thân rõ ràng CT4 70,0 Cây có thân rõ ràng Ghi chú: Mơi trường nền: 30 g/l sucrose 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ mơi trường MS tới tỷ lệ hạt Hồng cầm nảy mầm 3.2 Giai đoạn nhân nhanh in vitro Hoàng cầm Từ kết thí nghiệm thăm dị sử dụng mơi trường MS thí nghiệm sử dụng mơi trường 1/2 MS để gieo hạt nhận thấy việc giảm nồng độ môi trường MS làm tăng tỷ lệ nảy mầm hạt Hồng cầm Chính vậy, đặt giả thuyết nồng độ môi trường MS có ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm hạt Hồng cầm Do vậy, thí nghiệm này, tiến hành thử nghiệm gieo hạt mơi trường có nồng độ khống giảm dần (Bảng 2) 3.2.1 Ảnh hưởng 6-Benzylaminopurine đến hệ số nhân chồi Kết bảng cho thấy nồng độ môi trường MS ảnh hưởng mạnh tới tỷ lệ hạt Hồng cầm nảy mầm Trong mơi trường 1/4 MS cho tỷ lệ nảy mầm 3,4% mơi trường khơng MS (CT4 - có nước, đường agar) tăng lên tới 70% Như vậy, nồng độ môi trường MS cao ức chế khả nảy mầm hạt Hồng cầm Trong ni cấy mơ, tượng tỷ lệ nảy mầm cao giảm hàm lượng muối môi trường phổ biến Nishikawa & cs (1999) sử dụng môi trường 1/2 MS để gieo hạt cho loài thuộc chi Scutellaria (Nishikawa & cs., 1999) Lan hài Paphiopedilum spicerianum cho tỷ lệ nảy mầm cao mơi trường có hàm lượng muối thấp (Chen & cs., 2015) Thêm vào đó, việc điều chỉnh nồng độ mơi trường MS phù hợp giúp tối ưu hóa số tiêu số chồi, số rễ, chiều cao chồi, số lá, chiều dài rễ Bạc hà (Mentha spicata L.) (Fadel & cs., 2010) 304 Ở thí nghiệm này, mẫu cấy đoạn thân cắt từ in vitro cấy lên mơi trường MS có bổ sung BA Kết theo dõi sau tuần trình bày bảng Kết bảng cho thấy bổ sung BA làm tăng tỷ lệ mẫu cấy tái sinh tạo chồi hệ số nhân chồi Trên môi trường không bổ sung BA, tỷ lệ mẫu cấy tái sinh tạo cụm chồi đạt 26,7%, hệ số nhân chồi đạt 1,7 chồi/mẫu cấy Trong đó, mơi trường bổ sung mg/l BA tỷ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi đạt 100% hệ số nhân chồi cao nhất, đạt 7,47 chồi/mẫu cấy Tuy nhiên, tăng nồng độ BA lên 2,0 mg/l tỷ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi hệ số nhân chồi giảm Sau tuần nuôi cấy, cụm chồi tái sinh môi trường có bổ sung BA mang cụm vi chồi nhỏ bề mặt môi trường nuôi cấy Bổ sung BA vào môi trường nhân nhanh làm giảm chiều cao chồi tái sinh Công thức không bổ sung BA cho chiều cao chồi 4,08 cm khi bổ sung BA chiều cao chồi đạt từ 0,42-1,43cm (Bảng 3) Các công thức bổ sung BA nồng độ thấp (0,5 1,0 mg/l) cho hình thái chồi khỏe, xanh tốt Trong cơng thức bổ sung BA từ 1,5-2,0 mg/l cho chồi phát triển, thân xanh nhạt, yếu, nhỏ Như vậy, môi trường bổ sung mg/l BA cho hệ số nhân chồi cao nhất, chất lượng chồi cụm chồi có chất lượng tốt Đinh Trường Sơn, Bùi Huy Hoàng, Nguyễn Hải Ninh, Ninh Thị Phíp, Phạm Ngọc Khánh, Đặng Thị Thanh Tâm, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải Bảng Ảnh hưởng BA đến hệ số nhân sinh trưởng chồi Hồng cầm (sau tuần) Cơng thức BA (mg/l) Tỷ lệ tạo cụm chồi (%) Hệ số nhân (chồi/mẫu) a 26,7 1,7 ± 0,26 5,43 ± 0,48 100 7,47 ± 0,57 b 100 2,0 5,73 ± 0,45 b 93,3 ** cb ** c * c * 1,43 ± 0,14 0,87 ± 0,09 86,7 1,0 1,5 *** b 4,08 ± 0,52 c 0,5 Hình thái chồi a b Chiều cao chồi (cm) 0,52 ± 0,06 5,93 ± 0,66 0,42 ± 0,06 P 0,05 Ghi chú: Môi trường nền: MS, 30 g/l sucrose Kinetin 6-Benzylaminopurine (BAP) hai chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, có khả hoạt hóa, kích thích phân chia tế bào nên thường sử dụng giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro Stojakowska & cs (1999), thử nghiệm môi trường nhân nhanh có thành phần MS có bổ sung BA nồng độ từ 0,5-5,0µM BA thu hệ số nhân chồi đạt từ 1,4-2,3 chồi/mẫu cấy Như vậy, kết nghiên cứu cơng trình cho hệ số nhân đạt 7,47 chồi/mẫu cấy, cao hẳn so với kết nghiên cứu (Stojakowska & cs., 1999) 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến hệ số nhân chồi Tương tự thí nghiệm với BA, thí nghiệm sử dụng mẫu cấy đoạn thân mang mắt ngủ cấy vào mơi trường có bổ sung kinetin với nồng độ khác Kết thể bảng cho thấy việc bổ sung kinetin cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi tăng không đáng kể so với môi trường không bổ sung Các tiêu hệ số nhân chồi, chiều cao chồi có khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê công thức (P >0,05) Stojakowska & cs (1999) nhận thấy mơi trường MS có bổ sung 5,0µM BA 0,5µM NAA cho số chồi tái sinh/mẫu cấy đạt 8,5 ± 3,5 chồi, nhiên, tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt 35% môi trường Trong đó, mơi trường MS có bổ sung 2,5µM kinetin 0,5µM NAA cho hệ số với hệ số nhân thấp (3,8 ± 1,3) tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt 70% (Stojakowska & cs., 1999) Kết nghiên cứu cho thấy kinetin chất điều tiết sinh trưởng phù hợp cho mục tiêu nhân nhanh in vitro Hồng cầm Thêm vào đó, hình thái chồi cơng thức khơng có khác biệt Như vậy, 305 Nghiên cứu nhân giống in vitro Hồng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.) kinetin khơng làm tăng hệ số nhân chồi in vitro Hoàng cầm 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả sinh trưởng cụm vi chồi Ở thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng BA đến hệ số nhân chồi, sau tuần ni cấy, cụm vi chồi hình thành nhiều cần thiết phải xác định môi trường phù hợp cho cụm vi chồi sinh trưởng phát triển từ nâng cao hệ số nhân chồi Ở thí nghiệm này, mẫu cấy cụm vi chồi tái sinh môi trường có bổ sung BA cắt với kích thước khoảng 3mm cấy vào mơi trường có bổ sung đường với nồng độ từ 10-50 g/l Kết bảng hình cho thấy: cần nhìn mắt thường thấy rõ khác biệt sinh trưởng phát triển chồi Hồng cầm in vitro mơi trường có bổ sung đường với nồng độ khác Ở nồng độ đường thấp (10 g/l) mẫu cấy sinh trưởng chậm, chiều cao chồi đạt 2-4mm Trong đó, bổ sung 20-30 g/l sucrose cho cụm vi chồi sinh trưởng phát triển mạnh tối ưu, chiều cao chồi đạt từ 8-20mm, chồi sinh trưởng khỏe mạnh, thân phát triển rõ ràng, khơng bị thủy tinh hóa, chất lượng chồi tốt Sinh trưởng phát triển cụm vi chồi chí số mẫu cấy bị chết tăng lượng đường lên 40 50 g/l Bảng Ảnh hưởng đường sucrose đến sinh trưởng phát triển vi chồi Hoàng cầm (sau tuần) Công thức Đường sucrose (g) Chiều cao chồi (mm) Hình thái CT1 10 2-4 +++ CT2 20 8-20 ++++ CT3 30 10-20 ++++ CT4 40 1-2 ++ CT5 50