Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxi hóa của vỏ thân cây quăng alangium salviifolium họ thôi chanh (alangiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG ALANGIUM SALVIIFOLIUM HỌ THÔI CHANH (ALANGIACEAE) Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Hùng TP HỒ CHÍ MINH - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG ALANGIUM SALVIIFOLIUM HỌ THÔI CHANH (ALANGIACEAE) Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Trần Hùng Ký tên TP HỒ CHÍ MINH - 2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI PGS TS TRẦN HÙNG PGS TS HUYNH NGỌC THỤY THS BUI HOÀNG MINH TÓM TẮT Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae) Mở đầu: Các cơng trình khoa học giới về loài Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae cho thấy nhiều tác dụng dược lý đáng quý Tuy nhiên hiện chưa có nghiên cứu về lồi Việt Nam Đề tài tiến hành phân lập thành phần hóa học có vỏ thân Alangium salviifolium (L.f) Wang hướng tác dụng sinh học nhằm cung cấp thêm thơng tin để ứng dụng lồi làm thuốc Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang.) thu hái Quảng Ngãi (07/2016) Phương pháp nghiên cứu: Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết; Khảo sát hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa (mơ hình DPPH, ức chế xanthin oxydase) và độc tế bào mơ hình MTT với ba dịng tế bào MDA-MB 231, RD, HepG2 Phân lập, tinh chế, định danh và đánh giá hoạt tính sinh học chất tinh khiết Kết quả: Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu xác vỏ thân Quăng Đánh giá tác dụng sinh học: Từ 10 kg vỏ thân Quăng, chiết ngấm kiệt thu 554 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố rắn – lỏng thu 50 g phân đoạn DCM, 31 g phân đoạn EtOAc, 408 g phân đoạn MeOH Phân đoạn alkaloid toàn phần (30 g) tách từ phân đoạn MeOH cho tác dụng sinh học tốt mơ hình Phân lập xác định cấu trúc: Từ 31 g phân đoạn EtOAc qua sắc ký cột tải kết hợp kết tinh phân đoạn thu kết tinh Thông qua kỹ thuật phổ định danh chất: acid betulinic (A2a, 30 mg), demethylalangisid (A2e, 25 mg) với hỗn hợp sterol glycosid (124 mg) chất hiện định danh (A2c, 34 mg) Từ 30 g phân đoạn alkaloid toàn phần thông qua kỹ thuật sắc ký cột kết hợp với pHPLC thu chất Thông qua kỹ thuật phổ, cấu trúc đề nghị lần lượt psychotrin (Aa1, 14 mg) demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg) Thử tác dụng sinh học: Demethylalangisid cho khả ức chế mạnh DPPH (IC50 = 31,36 µM), demethylpsychotrin ức chế xanthin oxydase với IC50 = 23,8 µM tương đương với allopurinol; psychotrin độc với tế bào ung thư HepG2 với IC50 = 9,83 µM Bàn luận: cần tiếp tục thử nghiệm về tác dụng sinh học chất tinh khiết phân lập chất từ phân đoạn giàu tiềm SUMMARY BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FROM STEM OF Alangium salviifolium (L.f.) Wang., Alangiaceae Introduction: In scientific lituretures, Alangium salviifolium (L.f) Wang has been reported to have potential efficacy against many diseases, however there is no study about this plant in Viet Nam This study was conducted on stem Materials: Stems of Alangium salviifolium (L.f) Wang was collected on 10/2016 in Quang Ngai Methods: Extraction, seperation, isolation and purification were done as routine work Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects (DPPH and xanthin oxydase inhibition) and cytotoxic activities with cell lines MDA-MB 231, RD, HepG2 Results: Bio-assay screening : Screening in vitro antioxidant effect, cytotoxic on EtOH extract, DCM, EtOAc, MeOH and total alkaloid fractions Alkaloid fraction showed the highest reduce ability Chemical composition : 10 kg of stem powder was extracted with 96% ethanol to yield 554 g extract, which succesively portioned with solvent to obtain 50 g DCM, 31 g EtOAc, 408 g MeOH and 30g total alkaloid fractions 31 g EtOAc extract was separated by overloaded-column to obtain 10 segments By frational crystallization, acid betulinic (A2a, 30 mg), a mixture of sterol glycosid (A2b, 124 mg) and demethylalangisid (A2e, 25 mg) was isolated 30 g total alkaloid was seperated by LC combined with pHPLC alkaloid was isolated and characterizated psychotrin (Aa1, 14 mg) and demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg) Bio-assay testing: Demethylalangisid showed high ability in DPPH radical scavenging (IC50 = 31,36 µM) while demethylpsychotrin had the same result in xanthin oxydase inhibitory with standard allopurinol and psychotrin proved its potential cytotoxic effect with cell line HepG2 (IC50 = 9,83 µM) Conclusion: Alangium salviifolium (L.f) Wang has potetial on treatment diseases such as cancer, gout, hepatitis Futher studies about the effect of constituents from this plant have to be conducted MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .3 1.1.1 Thực vật học .3 1.1.2 Thành phần hóa học: .7 1.1.3 Tác dụng dược lý 11 1.1.4 Một số kinh nghiệm sử dụng Quăng dân gian .18 Gốc tự và một số mô hình thử tác động chống oxy hóa 18 1.2.1 Gốc tự 18 1.2.2 Một số mô hình thử tác động chống oxy hóa 19 Tổng quan về bệnh ung thư 20 1.3.1 Khái niệm .20 1.3.2 Các mô hình nghiên cứu khảo sát độc tính tế bào 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu .23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Xác định nguyên liệu 25 2.2.2 Kiểm tinh khiết .26 2.2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật vỏ thân Alangium salviifolium 26 2.2.4 Chiết xuất và phân lập 26 2.2.5 Xác định cấu trúc chất phân lập được 28 2.2.6 Sàng lọc sinh học 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ 33 3.1 Khảo sát thực vật học .33 3.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 33 3.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học .33 3.1.3 Định danh phương pháp giải trình tự ADN 37 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 37 3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật 38 3.4 Nghiên cứu hóa học theo định hướng tác dụng sinh học 38 3.4.1 Đánh giá tác dụng sinh học bộ phận dùng (lá, vỏ thân rễ) .38 3.4.2 Chiết các phân đoạn từ cao cồn vỏ thân Alangium salviifolium 39 3.4.3 Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn EtOAc (A2) .44 3.4.4 Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn alkaloid toàn phần (Aa) 47 3.4.5 Phân tách các phân đoạn từ Aa.2 52 3.4.6 Phân tách các phân đoạn từ Aa.2.3 .55 3.4.7 Phân tách các phân đoạn từ Aa.3 57 3.4.8 Phân tách các phân đoạn từ Aa.3.3 .60 3.5 Phân lập 62 3.5.1 Phân lập A2a từ A2.1 .62 3.5.2 Phân lập A2b từ A2.3 A2.4 62 3.5.3 Phân lập A2c từ A2.6 .62 3.5.4 Phân lập A2e từ A2.10 63 3.5.5 Phân lập Aa1 từ Aa 63 3.5.6 Phân lập Aa3 từ Aa.8 .63 3.6 Xác định độ tinh khiết cấu trúc chất phân lập .63 3.6.1 Chất A2a 63 i 3.6.2 Chất A2b 65 3.6.3 Chất A2e 67 3.6.4 Chất Aa3 72 3.6.5 Chất Aa1 77 3.6.6 Chất A2c 80 3.6.7 Tổng kêt kết quả phân lập 82 3.7 Thử nghiệm tác dụng sinh học một số chất phân lập 83 3.7.1 Mơ hình DPPH .83 3.7.2 Ức chế xanthin oxydase 84 3.7.3 Độc tế bào 84 CHƯƠNG BÀN LUẬN 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 Kết luận 89 Đề nghị 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PL.1 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Bảng thống kê đặc điểm số lồi thuộc chi Alangium có châu Á .3 Bảng 1.2 Một số alkaloid có phận loài Alangium salviifolium Bảng 2.1 Các loại mẫu cho thử nghiệm in vitro mơ hình DPPH 30 Bảng 2.2 Các loại mẫu dùng cho thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế xanthin oxidase 31 Bảng 3.1 Kết kiểm tra độ tinh khiết của bột vỏ thân Quăng .38 Bảng 3.2 Bảng kết khảo sát hóa thực vật vỏ thân Quăng 38 Bảng 3.3 Khả ức chế xanthin oxydase của cao cồn (Lá, Vỏ thân, Rễ) 39 Bảng 3.4 Khả ức chế của cao cồn vỏ thân rễ dòng tế bào ung thư 39 Bảng 3.5 Phần trăm ức chế xanthin oxidase (%) của cao 42 Bảng 3.6 Kết % ức chế của phân đoạn dòng tế bào ung thư .42 Bảng 3.7 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột tải A2 .45 Bảng 3.8 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột tải phân đoạn Aa .49 Bảng 3.9 Kết khả ức chế xanthin oxydase của cao phân đoạn Aa.1-9 51 Bảng 3.10 Kết khả ức chế tế bào ung thư HepG2 của phân đoạn Aa.1Aa.9 51 Bảng 3.11 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.2 53 Bảng 3.12 Kết khả ức chế xanthin oxydase của cao phân đoạn Aa.2.1Aa.2.5 55 Bảng 3.13 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.2.3 57 Bảng 3.14 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.3 58 Bảng 3.15 Kết khả ức chế xanthin oxydase của phân đoạn Aa.3.1-Aa.1.5 60 Bảng 3.16 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.3.3 62 Bảng 3.17 Bảng so sánh phổ NMR của A2a acid betulinic 65 Bảng 3.18 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR của A2b Stigmasta-5,22-dien-3-β-O- glucopyranosid 66 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR của A2e 69 Bảng 3.20 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR của A2e demetylalangisid (trích vùng aglycon) .71 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ NMR của Aa3 (MeOD) .73 Bảng 3.22 Bảng so sánh phổ NMR của Aa3 với 9-demetylpsychotrin 77 Bảng 3.23 Bảng so sánh liệu phổ NMR của Aa1 với Aa3 79 Bảng 3.24 Bảng so sánh liệu phổ 13C-NMR của Aa1 với psychotrin 80 Bảng 3.25 Kết thử nghiệm khả chống OXH mơ hình DPPH 83 Bảng 3.26 Giá trị IC50 của mẫu thử mơ hình DPPH 84 Bảng 3.27 Kết thử nghiệm ức chế xanthin oxydase 84 Bảng 3.28 Giá trị IC50 của mẫu thử thử nghiệm ức chế xanthin oxydase 84 Bảng 3.29 Giá trị IC50 của mẫu thử thử nghiệm độc tế bào 85 Bảng 3.30 Bảng tổng kết kết thử sinh học chất tinh khiết 85 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.60 Phụ lục 49 Dữ liệu phổ Aa1: UV Phụ lục 50 Dữ liệu phổ Aa1: HR-MS(ESI+) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.61 Phụ lục 51 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.62 Phụ lục 52 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) trích vùng δC 60 ppm-180 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.63 Phụ lục 53 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) trích vùng δC 10 ppm-60 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.64 Phụ lục 54 Dữ liệu phổ Aa1: DEPT Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.65 Phụ lục 55 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.66 Phụ lục 56 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) trích vùng δH 3,5ppm – 7,0 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.67 Phụ lục 57 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) trích vùng δH 3,5ppm – 7,0 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.68 Phụ lục 58 Dữ liệu phổ Aa1: HSQC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.69 Phụ lục 59 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.70 Phụ lục 60 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH 6,3 ppm – 7,3 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.71 Phụ lục 61 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH 2,7 ppm – 3,9 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.72 Phụ lục 62 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH ppm – 3,5 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.73 Phụ lục 63 Dữ liệu phở Aa1: COSY (MeOD-d4) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.74 Phụ lục 64 Dữ liệu phở Aa1: COSY (MeOD-d4) trích vùng 0,8ppm – 3,5 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG ALANGIUM. .. nhiều tác dụng dược lý đáng quý Tuy nhiên hiện chưa có nghiên cứu về lồi Việt Nam Đề tài tiến hành phân lập thành phần hóa học có vỏ thân Alangium salviifolium (L.f) Wang hướng tác dụng. .. thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang Alangiaceae)” với mục tiêu cụ thể sau: - Sàng lọc in vitro tác dụng dụng chống oxy hóa và