TRỊNH THỊ DIỆP THANH NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học THEO ĐỊNH HƢỚNG tác DỤNG CHỐNG OXY hóa của cây PHONG QUỲ SAPA anemone chapaensis gagnep , họ hoàng liên (ranunculaceae) LUẬN văn

11 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ DIỆP THANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY PHONG QUỲ SAPA Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY PHONG QUỲ SAPA Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Với tất lịng kính trọng biết ơn em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phương Thiện Thương, khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ dìu dắt em trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Nhờ có bảo Thầy mà em trưởng thành cố gắng học hỏi thêm nhiều để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị Nguyễn Thị Phương thành viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Cảm ơn anh Tuấn, chị Ly, chị Nga, bạn Hiếu, em Linh, em Phượng, em Tuyết… giúp đỡ tạo điều kiện tốt giúp em/tớ/chị hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hà Thị Thanh Hương sinh viên Phạm Giang Nam, Hoàng Văn Hùng - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ đồng hành trình làm thực nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thùy Dương Ds Phạm Đức Vịnh, môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn Cảm ơn thành viên chuyên ngành Dược học cổ truyền nói riêng lớp cao học 19 nói chung, người đồng hành em chia sẻ vui buồn, khó khăn động viên em suốt thời gian qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người ln giúp đỡ, động viên, chia sẻ với suốt đường sống Cảm ơn chồng bên em, cảm ơn bạn Mint đến với bố mẹ, cho mẹ thêm nghị lực mẹ cố gắng ngày Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2016 Trịnh Thị Diệp Thanh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN ………….3 1.1.TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.1.Tổng quan chi Anemone 1.1.1.1 Thực vật học 1.1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.1.3 Tác dụng sinh học 1.1.2.Tổng quan Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2.2 Thành phần hóa học tác dụng sinh học 1.1.2.3 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ VIÊM, GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXI HÓA…….… 1.2.1 Viêm 1.2.1.1 Khái niệm 1.2.1.2 Nguyên nhân 1.2.2 Gốc tự do, chất chống oxi hóa 10 1.2.2.1 Nguồn gốc gốc tự 10 1.2.2.2 Stress oxi hóa, tác hại stress oxi hóa 10 1.2.2.3 Chất chống oxi hóa 11 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 12 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 12 2.2.1 Hóa chất dung mơi 12 2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 13 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3.1 Nghiên cứu thực vật học 14 2.3.1.1 Nghiên cứu hình thái 14 2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 14 2.3.2 Nghiên cứu chiết xuất sàng lọc tác dụng phân đoạn dịch chiết Phong quỳ Sa Pa 14 2.3.2.1 Chiết xuất cắn toàn phần phân đoạn 14 2.3.2.2 Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự DPPH (1,1- Diphenyl-2picrylhydrazyl)các phân đoạn dịch chiết 15 2.3.2.3 Sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase invitro phân đoạn dịch chiết 16 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học Phong quỳ Sa Pa 18 2.3.3.1 Phân lập hợp chất 18 2.3.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 19 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT 20 3.1.1 Đặc điểm hình thái định tên khoa học lồi nghiên cứu 20 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu loài Anemone chapaensis Gagnep 22 3.1.3 Đặc điểm bột loài Anemone chapaensis Gagnep 25 3.2 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA ……………………………………… 28 3.2.1.Chiết xuất Phong quỳ Sa Pa 28 3.2.2 Kết sàng lọc tác dụng dọn gốc tự DPPH phân đoạn dịch chiết 31 3.2.3 Kết sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro phân đoạn dịch chiết 32 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ PHONG QUỲ SA PA 32 3.3.1.Định tính cắn ethyl acetat sắc kí lớp mỏng 32 3.3.2.Phân lập số hợp chất Phong quỳ Sa Pa 34 3.3.2.1.Phân lập 34 3.3.2.2.Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 37 3.3.3.Nhận dạng chất phân lập 39 3.3.3.1.Hợp chất PQLE1 39 3.3.3.2 Hợp chất PQLE2 42 3.3.3.3 Hợp chất PQLE4 45 3.3.3.4 Hợp chất PQLE6 46 CHƢƠNG BÀN LUẬN 49 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 49 4.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học loài nghiên cứu 49 4.1.1 Đặc điểm vi học loài nghiên cứu 51 4.2 VỀ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA 51 4.2.1 Về chiết xuất 51 4.2.2 Về tác dụng dọn gốc tự DPPH …………………… 52 4.2.3 Về tác dụng ức chế XO in vitro 52 4.3 VỀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT 53 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-Butanol 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOAc Ethyl acetat GF254 Gypsum fluorescent 254nm Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR HSQC Hetoronuclear Single Quantum Coherence IC50 Half (50%) maximal Inhibitory Concentration MeOH Methanol MS Mass Spectroscopy PQL Cắn toàn phần Phong quỳ PQLB Cắn phân đoạn n-butanol Phong quỳ PQLE Cắn phân đoạn ethyl acetat Phong quỳ PQLH Cắn phân đoạn n-hexan Phong quỳ PQLW Cắn nƣớc Phong quỳ Rf Retardation Factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử UV-VIS Ultra Violet - Visible UV254nm Ultra Violet 254nm UV365nm Ultra Violet 365nm XO Xanthin oxidase DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Khối lƣợng cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol Phong quỳ Sa Pa 31 Bảng 3.2 Khả dọn gốc tự DPPH phân đoạn dịch chiết Phong quỳ Sa Pa 31 Bảng 3.3 Kết đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro phân đoạn dịch chiết Phong quỳ Sa Pa 32 Bảng 3.4 Kết SKLM chất với hệ dung môi 39 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQLE1 40 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQLE2 43 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQLE4 46 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQLE6 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Một số Flavonoid phân lập từ chi Anemone Hình 1.2 Một số saponin phân lập từ rễ Anemone rivularis Hình 1.3 Một số Saponin phân lập từ rễ Anemone tomentosa Hình 1.4 Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn sàng lọc tác dụng 15 Hình 3.1 Hình ảnh Phong quỳ Sa Pa 21 Hình 3.2 Một số phận Phong quỳ Sa Pa 21 Hình 3.3 Vi phẫu gân Phong quỳ Sa Pa 22 Hình 3.4 Vi phẫu phiến Phong quỳ Sa Pa 23 10 Hình 3.5 Vi phẫu cuống Phong quỳ Sa Pa 23 11 Hình 3.6 Vi phẫu thân Phong quỳ Sa Pa 24 12 Hình 3.7 Vi phẫu rễ Phong quỳ Sa Pa 25 13 Hình 3.8 Một số đặc điểm bột thân, Phong quỳ Sa Pa 26 14 Hình 3.9 Một số đặc điểm bột hoa, Phong quỳ Sa Pa 27 15 Hình 3.10 Một số đặc điểm bột rễ Phong quỳ Sa Pa 28 16 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Phong quỳ Sa Pa 30 17 Hình 3.12 Sắc ký đồ cắn ethyl acetat (hệ I) điều kiện quan sát 33 18 Hình 3.13 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat 36 19 Hình 3.14 Sắc ký đồ PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ I 37 20 Hình 3.15 Sắc ký đồ PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ II 38 21 Hình 3.16 Sắc ký đồ PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ III 38 22 Hình 3.17 Sản phẩm PQLE1 phân lập đƣợc 39 23 Hình 3.18 Cơng thức cấu tạo hợp chất PQLE1 42 24 Hình 3.19 Sản phẩm PQLE2 phân lập đƣợc 42 25 Hình 3.20 Công thức cấu tạo hợp chất PQLE2 45 26 Hình 3.21 Sản phẩm PQLE4 phân lập đƣợc 45 27 Hình 3.22 Cơng thức cấu tạo hợp chất PQLE4 46 28 Hình 3.23 Sản phẩm PQLE6 phân lập đƣợc 47 29 Hình 3.24 Cơng thức cấu tạo hợp chất PQLE6 48 phân cực tăng dần: n-hexan (HX), ethyl acetat (EtOAc) n-butanol (BuOH) thu đƣợc cắn phân đoạn với khối lƣợng Hx (1,31%), EtOAc (4,22%), BuOH (2,61%) so với nguyên liệu khô ban đầu 4.2.2 Về tác dụng quét gốc tự DPPH cắn phân đoạn từ Phong quỳ Sa Pa DPPH gốc tự tổng hợp, khơng có thể sống Việc đánh giá tác dụng dọn gốc tự DPPH thực đơn giản, nhanh, cho kết ổn định, rẻ tiền Vì vậy, DPPH thƣờng đƣợc dùng để sàng lọc tác dụng dọn gốc tự mẫu, từ định hƣớng cho nghiên cứu sâu Trong cơng trình nhóm nghiên cứu sử dụng tác dụng dọn gốc tự DPPH để đánh giá tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Phong quỳ Kết cho thấy dịch chiết toàn phần phân đoạn có tác dụng dọn gốc tự do, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng mạnh với giá trị IC50 = 16,81 µg/ml Kết chứng minh Phong quỳ có chứa chất dọn gốc tự do, có tác dụng chống oxy hóa Vì vậy, nghiên cứu thành phần hóa học Phong quỳ cần thiết để xác định hoạt chất 4.2.3 Về tác dụng ức chế XO in vitro Với phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro dịch chiết toàn phần EtOH phân đoạn chiết xuất từ Phong quỳ Sa Pa, nhận thấy phân đoạn ethyl acetat thể tác dụng ức chế XO tốt (IC50 = 93,8 µg/ml), dịch chiết tồn phần EtOH phân đoạn khác khơng thể tác dụng ức chế XO nồng độ 300 µg/ml Do việc đánh giá khả chống viêm dịch chiết ethanol Phong quỳ Sa Pa cần thiết để kết luận xác tác dụng điều trị Phong quỳ Đối với thử nghiệm in vitro, bên cạnh việc xác định điều kiện thử nghiệm phù hợp, việc lựa chọn chất đối chứng dƣơng yêu cầu bắt buộc Điều giúp định lƣợng tƣơng đối hoạt tính mẫu nghiên cứu so sánh với chất chuẩn Với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro, chất thƣờng đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng allopurinol Allopurinol chất đƣợc đƣợc sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh gout làm giảm acid uric huyết, 52 đƣợc chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế XO mạnh in vitro, đồng thời sẵn có giá thành rẻ Vì vậy, việc lựa chọn allopurinol làm chất đối chứng dƣơng nghiên cứu phù hợp với điều kiện thực tiễn Mặc dù kết nghiên cứu luận văn cho thấy dịch chiết toàn phần EtOH Phong quỳ Sa Pa khơng có hoạt tính ức chế XO mạnh tiềm năng, nhiên, nghiên cứu tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế XO in vitro lồi nghiên cứu Vì vậy, kết luận văn góp phần bổ sung thông tin cho sở liệu hƣớng nghiên cứu tác dụng sinh học Phong quỳ Sa Pa nói chung hợp chất phân lập đƣợc nói riêng Trong q trình thực luận văn, điều kiện khó khăn số lƣợng cá thể lồi A chapaensis Gagnep có ít, thân rễ lại nhỏ nên không thu đƣợc đủ mẫu cho việc nghiên cứu, đánh giá tác dụng nghiên cứu thành phần hóa học rễ 4.3 VỀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT Hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu hóa thực vật, phƣơng pháp nghiên cứu phân lập hợp chất tự nhiên theo định hƣớng tác dụng sinh học đƣợc sử dụng phổ biến Phƣơng pháp có ƣu điểm đem lại xác suất thành công cao đồng thời tiết kiệm đƣợc chi phí thời gian nghiên cứu Tuy nhiên, nhƣợc điểm phƣơng pháp bỏ sót hợp chất có hoạt tính đáng quan tâm phân đoạn không đƣợc nghiên cứu Áp dụng phƣơng pháp này, dựa kết sàng lọc tác dụng quét gốc tự DPPH ức chế xanthin oxidase in vitro mẫu cắn phân đoạn khác từ dịch chiết Phong quỳ Sa Pa, định hƣớng trình nghiên cứu hóa học luận án vào phân đoạn ethyl acetat Đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký sắc ký cột pha thƣờng, sắc ký cột pha đảo Đây phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để phân lập chất Việt Nam, sử dụng thiết bị rẻ tiền, chất hấp phụ sẵn có, dễ kiếm, tiến hành đơn giản so với phƣơng pháp phân lập khác Bƣớc đầu đề tài phân lập đƣợc hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat Cấu trúc hợp chất đƣợc xác định (1) trans-tiliroside, (2) arctiin, (3) arctigenin (4) 5-hydroxymethylfurfural dựa tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng 53 chảy) liệu phổ khối (ESI-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) Theo tài liệu tham khảo tra cứu đƣợc chƣa thấy có cơng trình nghiên cứu phân lập đƣợc bốn hợp chất từ Phong quỳ Sa Pa chi Anemone nói chung Vì vậy, đóng góp đề tài, đem lại tri thức thành phần hóa học Phong quỳ Sa Pa chi Anemone TRANS - TILIROSIDE Trans-Tiliroside, hay kaempferol-3-O-β-D-(6-O-trans-p-coumaroyl)- glucopyranosid, este flavonol tìm thấy số thảo dƣợc, thuốc số thực phẩm (ở nồng độ tƣơng đối thấp) nhƣ dâu tây, mâm xôi Trung Quốc, Tầm Xuân [79] Ngày có nhiều chứng in vitro in vivo đƣợc nghiên cứu động vật cho thấy trans-tiliroside có tác dụng có lợi đến sức khỏe ngƣời, nhƣ tác dụng chống viêm [57], bảo vệ gan [41] chống đái tháo đƣờng [50] Ngoài ra, sử dụng tiliroside liều thấp (0,1-10 mg/kg thể trọng/ngày) có tác dụng ức chế tăng trọng lƣợng thể (đặc biệt lƣợng chất béo nội tạng); làm giảm triglyceride gan axit béo mà không ảnh hƣởng đến lƣợng thức ăn [50] Các tác giả cho chuyển hóa lipid đƣợc thúc đẩy uống trans-tiliroside [50] ARCTIIN VÀ ARCTIGENIN Arctigenin dibenzylbutyrolactone loại lignan (DBL) hình thành cách ngƣng tụ cặp cấu trúc phenylpropane, đƣợc tìm thấy dƣới dạng aglycone tự liên kết với phân tử glucose, để tạo thành glycosid arctiin [64] Arctigenin arctiin tồn số loại thực vật nhƣ trái Arctium lappa [11], [39], chi Centaurea [46], [56], Forsythiae intermedia [40], Saussurea medusa [44], Carthamus tinctoius [11], Serratula tinctoria [10] Có thể thu arctigenin từ chứa artiin cách thủy phân enzyme glycosidase acid với hiệu phƣơng pháp đƣợc cho nhƣ [10] Xét tầm quan trọng cặp lignan aglycon-glycosid này, arctigenin cho thấy có tác dụng ức chế tốt phát triển khối u tế bào so với arctiin [35] 54 Arctiin đƣợc sử dụng lâm sàng để giải cảm nhệt, làm giảm đau cổ họng, loại bỏ chất độc hại điều trị sƣng [12] Arctiin đƣợc chứng minh có hiệu ức chế 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) gây phù tai chuột [58], có tác dụng chống viêm cách ức chế chất trung gian gây viêm thông qua bất hoạt NF-kB [36] làm giảm số lƣợng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt ngƣời [26] Bên cạnh đó, arctiin đƣợc chứng minh có khả gây độc tế bào, chống tăng sinh [47], [55], kích hoạt yếu tố đối kháng tiểu cầu (PAF) [30], đối kháng canxi [29], chống ung thƣ [39] kháng virus cúm A chuột suy giảm miễn dịch [34] Arctigenin đƣợc sử dụng lâm sàng Trung Quốc nhƣ thuốc trị liệu để điều trị tình trạng viêm nhƣ cảm lạnh, đau họng, ho, sởi, giang mai [12] Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh Arctigenin có khả chống viêm chống khối u Khả chống viêm arctigenin đƣợc chứng minh có liên quan chặt chẽ đến ức chế cytokine tiền viêm Arctigenin làm giảm LPS - chất gây tình trạng viêm cấp tính phổi, thâm nhiễm tế bào viêm sản xuất cytokine gây viêm [70], chống viêm thông qua đƣờng ức chế NOS [22] hay ức chế phosphoryl-STAT1 phosphoryl-STAT3 bất hoạt JAK2 LPS gây giảm sản xuất ROS thông qua hoạt động chống oxy hóa [71] Các nghiên cứu tác động arctigenin tế bào khối u cho thấy arctigenin gây ảnh hƣởng đến trình gây độc dòng tế bào khác nhau, nhƣ tác động ung thƣ phổi ngƣời [61], gây độc chống tăng sinh tế bào bạch cầu dòng tủy TF-1 chuột MH60 u tủy [42] Ngoài ra, arctigenin đƣợc chứng minh có hoạt tính bảo vệ thần kinh [31], kháng virus cúm A chuột suy giảm miễn dịch [34] hay ức chế nhân lên vi rút gây suy giảm miễn dịch ngƣời [20], [60] 5- HYDROXYMETHYL-2-FURFURAL (5-HMF) 5-hydroxymethyl-2-furfural (5-HMF) chất tự nhiên đƣợc xác định có mật ong, nƣớc ép táo, nƣớc cam, bia, rƣợu, sữa, ngũ cốc ăn, đồ nƣớng, sản phẩm từ cà chua… sản phẩm trung gian phổ biến phản ứng Maillard (một chuỗi phản ứng hóa nâu khơng enzym đƣợc dùng xử lý nhiệt loại thực phẩm có chứa đƣờng khử axit amin) [63] 5-HMF đƣợc 55 xác định khói thuốc lá, caramel - chất tạo màu sử dụng rộng rãi thực phẩm, dƣợc phẩm hay sữa đƣợc xử lý nhiệt độ cao 120 oC có diện đƣờng khử lactose [63] Trong thực vật, 5-HMF đƣợc phân lập từ Laurencia undulata [37], chi Cornus chi Schisandra [18], [73] Nhiều báo cáo liên quan đến 5- HMF cung cấp chứng quan trọng cho tiềm ứng dụng thực tế lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm Trong dƣợc phẩm, HMF chứng minh có hoạt tính chống ung thƣ, ứng dụng thuốc thần kinh, bảo vệ tim, điều trị bệnh tổn thƣơng tim mạch vân nội tạng cách kết hợp với protein, giảm tích tụ chất độc thể [23] Ngồi 5-HMF cịn đƣợc chứng minh phát triển nhƣ chất chống oxy hóa tự nhiên với hoạt động chống oxy hóa nhƣ quét gốc tự do, chống oxy hóa protein màng tế bào, chống oxy hóa enzyme myeloperoxidase (MPO), enzyme glutathione (GSH) superoxide dismutase (SOD) [Invitro antioxidant] 5-HMF đƣợc coi chất kích thích gây kích thích mắt, đƣờng hô hấp trên, da màng nhầy Con ngƣời tiếp xúc với HMF thơng qua hít phải, nuốt phải hấp thụ qua da Nhƣ vậy, với bốn hợp chất phân lập đƣợc góp phần việc định hƣớng nghiên cứu thêm thành phần hóa học nhƣ tác dụng sinh học Phong Quỳ Sa Pa 56 KẾT LUẬN Qua trình tiến hành làm thực nghiệm, luận văn thu đƣợc số kết sau đây: Về nghiên cứu thực vật - Đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái, quan dinh dƣỡng quan sinh sản loài nghiên cứu ; giám định đƣợc tên khoa học loài Anemone chapaensis Gagnep., họ Hoàng liên (Ranunculaceae) - Đã mô tả đặc điểm vi phẫu lá, thân, rễ đặc điểm bột phận loài nghiên cứu, góp phần tiêu chuẩn hóa lồi Về nghiên cứu chiết xuất sàng lọc tác dụng - Đã chiết xuất Phong quỳ Sa Pa phƣơng pháp ngâm với dung mơi EtOH, sau chiết lỏng - lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan (HX), ethyl acetat (EtOAc) n-butanol (BuOH) thu đƣợc cắn phân đoạn với khối lƣợng cắn EtOAc nhiếu (4,22% so với nguyên liệu khô ban đầu) - Kết sàng lọc tác dụng dọn gốc tự DPPH tác dụng ức chế XO cho thấy phân đoạn EtOAc thể tác dụng mạnh nhất, luận văn lựa chọn phân đoạn EtOAc để tiếp tục nghiên cứu phân lập hợp chất từ Phong quỳ Sa Pa Về nghiên cứu thành phần hóa học - Từ phân đoạn ethyl acetat dịch chiết Phong quỳ Sa Pa, phân lập đƣợc 04 chất phƣơng pháp sắc ký xác định đƣợc cấu trúc hóa học chất (1) trans-tiliroside, (2) arctiin, (3) artigenin (4) 5-hydroxymethylfurfural Cả chất đƣợc phân lập lần từ loài nghiên cứu Anemone chapaensis Gagnep từ chi Anemone 57 KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài có hạn nên kết nghiên cứu đóng góp phần cơng trình nghiên cứu Phong quỳ Sa Pa, đồng thời mở hƣớng nghiên cứu sâu nhắm tới mục tiêu tìm hoạt chất có khả ứng dụng làm chất chuẩn kiểm nghiệm Vì chúng em xin đƣa số đề xuất:  Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học Phong quỳ Sa Pa, gồm phần mặt đất đặc biệt phần thân rễ  Tiến hành nghiên cứu thử tác dụng sinh học dịch chiết toàn phần dịch chiết toàn phần rễ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân, V P Serov (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Nhà xuất Nông nghiệp Võ Văn Chi (2003), Từ điển Thực vật thông dụng, tập I, NXB Khoa học Kỹ thuật Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh Miễn dịch, tr.113125, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập I, tr.320, NXB Trẻ Trần Văn Ơn (2012), Thực vật nhận biết thuốc, Trung tâm thông tinThƣ viện Đại học Dƣợc Hà Nội Nguyễn Viếts Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp hiển vi, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.493-511, 581-602 Đặng Kim Vui, Hoàng Văn Hùng (2013), “Đánh giá đa dạng sinh học thực vật đặc hữu quý vƣờn quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 104(04):49-54 Tiếng Anh Aitzetmüller K (1995), “Fatty acid patterns of Ranunculaceae seed oils”, Plant systematics and evolution, 9:229–240 10 Anna Sólyomváry, Zsolt Mervaic, Gerg˝ o Tóth, Ágnes Evelin Ress, Béla Noszáld, Ibolya Molnár-Perle, Kornélia Baghy, Ilona Kovalszk, Imre Boldizsár (2015), “A simple and effective enrichment process of the antiproliferative lignan arctigenin based on the endogenous enzymatic hydrolysis of Serratula tinctoria and Arctium lappa fruits”, Process Biochemistry, 50(12): 2281–2288 11 Asgarpanah J, Kazemivash N (2013), “Phytochemistry, pharmacology and medicinal properties of Carthamus tinctorius L”, Chinese Jounal of Integrative Medicine, 19(2):153-159 12 Ayres DC, Loike JD (1990), Lignan: chemical, biological and clinical properties, Cambridge: UK7 Cambridge University Press, pp 402 13 Bagchi K., Puri S (1998), "Free radicals and antioxidants in health and disease", East Mediterranean Health Jounal, 4(2), pp.350-360 14 Cheeseman K.H., Slater T.F (1993), "An introduction to free radical biochemistry", British Medical Bulletin, 49(3):481-493 15 Chen X, Li JC, He WF, Chi HD, Yamashita K, Manabe M, Kodama H (2009) “Antiperoxidation activity of triterpenoids from rhizome of Anemone raddeana”, Fitoterapia, 80(2):105-111 16 Chrysoula Spanou, Aristidis S Veskoukis, Thalia Kerasioti, Maria ontou, Apostolos Angelis, Nektarios Aligiannis, AlexiosLeandros Skaltsounis, Dimitrios Kouretas (2012), “Flavonoid Glycosids Isolated from Unique Legume Plant Extracts as Novel Inhibitors of Xanthine Oxidase”, Plos one 7(3): e32214 17 Cotelle N (2001), “Role of flavonoids in oxidative stress”, Current Topics in Medicinal Chemistry, 1(6):569–590 18 Ding, X., M Y Wang, Z L Yu, W Hu, and B C Cai (2008), “Studies on separation, appraisal and the biological activity of 5-HMF in Cornus officinalis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 33(4):392-396, 484 19 Ding Y, Tian XR, Tang HF, Feng JT, Zhang W, Hai WL, Wang XY, Wang Y (2012), “Two new glycosides from the whole plant of Anemone rivularis var.flore-minore”, Phytochemistry Letters, 5(3):668–672 20 Eich E, Pertz H, Kaloga M, Schulz J, Fesen MR, Mazumder A, et al (1996), “Arctigenin as a lead structure for inhibitors of human immunodeficiency virus type-1 integrase”, Journal Medicinal Chemistry, 39(1):86–95 21 Fan L, Lu JC, Wang J, Cheng WM, Yao Y, Liu RX, Zhang HF (2010) “Two triterpenoid saponins from rhizome of Anemone raddeana Regel”, Jounal Natural Medicin, 64:50-54 22 Feng Zhao, Lu Wang, Ke Liu (2009), “In vitro anti-inflammatory effects of arctigenin, a lignan from Arctium lappa L., through inhibition on iNOS pathway”, Journal of Ethnopharmacology, 122(3):457–462 23 Fu ZQ, MY Wang, and BC Cai (2008), “Discussion of 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) in Chinese Native Medicine Research Presents”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 26:3 24 Halliwell B (1995), "How to characterize an antioxidant- An update", Biochemical Society symposium, 61:73-101 25 Harvard University Herbaria (2008), Flora of North America, Anemone Genus, Volume 26 Huang DM, Shen YC, Wu C, Huang YT, Kung FL, Teng CM, Guh JH (2004), “Investigation of extrinsic and intrinsic apoptosis pathways of new clerodane diterpenoids in human prostate cancer PC-3 cells”, European Journal of Pharmacology, 503(1-3):17-24 27 Hu HB, Zheng XD, Jian YF, Liu JX, Zhu JH (2010), “Flavonoids from Anemone tomentosa roots”, Chemistry of Natural Compounds, 46:636–637 28 Hu HB, Zheng XD, Zhu JH, Zhang XD (2011), “Two glycosides and other constituents from Anemone tomentosa roots”, Helvetica Chimica Acta, 94:711–718 29 Ichikawa K, Kinoshita T, Nishibe S, Sankawa U (1986), “The Ca2+ activity of lignans”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 34:3514-3517 30 Iwakami S, Wu JB, Ebizuka Y, Sankawa U (1992), “Platelet activating factor (PAF) antagonists contained in medicinal plants: lignans and sesquiterpenes”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40:1196-1198 31 Jang YP, Kim SR, Choi YH, Kim J, Kim SG, Markelonis GJ, et al (2002), “Arctigenin protects cultured cortical neurons from glutamate-induced neurodegeneration by binding to kainate receptor”, Journal of Neuroscience Research, 68(2):233–240 32 Kang HS, Choi JH, Cho WK, Park JC, Choi JS (2004), “A sphingolipid and tyrosinase inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus”, Archives of Pharmacal Research, 27(7):742-750 33 Kaouadji M (1990), “Acylated and non-acylated kaempferol monoglycosides from Platanus acerifolia buds”, Phytochemistry, 29(7):2295-2297 34 Kyoko Hayashi, Kazuto Narutaki, Yasuo Nagaoka, Toshimitsu Hayashi, Sinichi Uesato (2010), “Therapeutic effect of arctiin and arctigenin in immunocompetent and immunocompromised mice infected with influenza A virus”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 33(7):1199–1205 35 Kyungsu Kang, H.J Lee, C.Y Kim, S.B Lee, J Tunsag, D Batsuren, C.W Nho (2007), “The chemopreventive effects of Saussurea salicifolia through induction of apoptosis and phase II detoxification enzyme”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 30(12): 2352–2359 36 Lee et al (2011), “Anti-inflammatory function of arctiin by inhibiting COX-2 expression via NF-B pathways”, Journal of Inflammation, 8:16 37 Li Yong-Xin, Yong Li, Zhong-Ji Qian, Moon-Moo Kim, Se-Kwon Kim (2009), “Invitro antioxidant activity of 5-HMF isolated from marine red alga Laurencia undulata in free radical mediate oxidative systems”, Journal of microbiology and biotechnology, 19(11):1319–1327 38 Li X., Fang P et al ( 2013), "Targeting mitochondrial reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and cancers", Journal of Hematology & Oncology, 6:19 39 Liu S, Chen K, Schliemann W, Strack D (2005), “Isolation and identification of arctiin and arctigenin in leaves of burdock (Arctium lappa L.) by polyamide column chromatography in combination with HPLC-ESI MS”, Phytochem analysis,16:86-89 40 Maiada M A Rahman, Paul M Dewick, David E Jackson and Jonh A Lucas (1990), “Lignans of Forsythia intermedia”, Phytochemistry, 29(6):19711980 41 Matsuda H, Ninomiya K, Shimoda H, Yoshikawa M (2002), “Hepatoprotective principles from the flowers of Tilia argentea (Linden): structure requirements of tiliroside and mechanisms of action”, Bioorganic Medicinal Chemistry, 10(3):707–712 42 Matsumoto T., Hosono-Nishiyama K., Yamada H (2006), “Antiproliferative and apoptotic effects of butyrolactone lignans from Arctium lappa on leukemic cells”, Planta Medica, 72: 276–278 43 Md Nur Alam , Nusrat Jahan Bristi, Md Rafiquzzaman (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharmaceutical Journal, 21(2):143-152 44 Midori T, Takao K, Katsuko K, Harukuni T, Hoyoku N (2000), “Antitumorpromoting activity of lignans from the aerial part of Saussureamedusa”, Cancer Letters; 158(1):53–59 45 Mimaki Y, Watanabe K, Matsuo Y, Sakagami H (2009), “Triterpene glycosides from the tubers of Anemone coronaria”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 57(7):724–729 46 Mohammad Shoeb, M Mukhlesur Rahman, Lutfun Nahar, Abbas Delazar, Marcel Jaspars, Stephen M macmanus and Satyajit D Sarker (2004), “Bioactive lignans from the seeds of Centaurea macrocephala”, DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 12(3):87-93 47 Moritani S, Nomura M, Takeda Y, Miyamoto K (1996), “Cytotoxic components of Bardanae fructus (goboshi)”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 19(11):1515-1517 48 National Pharmacopoeia Committee (2010), Pharmacopoeia of People’s Republic of China; Chemical Industry Press: Beijing, China, p.157 49 Nguyen Mai Trang et al (2004), "Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27(9), p.1414-1421 50 Ninomiya K, Matsuda H, Kubo M et al (2007), “Potent anti-obese principle from Rosa canina: Structure requirements and mode of action of transtiliroside”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17:3059–64 51 Olga Sayanova, Richard Haslam, Monica Venegas Caleron, and Johnathan A Napier (2007), “Cloning and Characterization of Unusual Fatty Acid Desaturases from Anemone leveillei: Identification of an Acyl-Coenzyme A C20 Δ5-Desaturase Responsible for the Synthesis of Sciadonic Acid”, Plant physiology, 144(1):455-67 52 Pashkow F.J (2011), "Oxidative stress and inflammation in heart disease: Do antioxidants have a role in treatment and/or prevention?", International Journal of Inflammation, volume 2011, pp.514-623 53 Rao A.L., Bharani M., Pallavi V (2006), "Role of antioxidants and free radicals in health and disease.", Advances in Pharmacology Toxicology, 7:29-38 54 Roy Upton, Alison Williamson Graff, Georgina (2011), Jolliffe,Reinhard Botanical Länger, Elizabeth pharmacognosy: Microscopic characterization of botanical medicines, American Herbal Pharmacopoeia 55 Ryu S, Ahn J, Kang Y, Han B (1995), “Antiproliferative effect of arctigenin and arctiin”, Archives of Pharmacal Research,18:462-463 56 Samah Djeddi, C Argyropoulou, H Skaltsa (2008), “Secondary metabolites from Centaurea grisebachii ssp grisebachii”, Biochemical Systematics and Ecology, 36(5-6):336–339 57 Sala A, Recio MC, Schinella GR et al (2003), “Assessment of the antiinflammatory activity and free radical scavenger activity of tiliroside”, European Journal of Pharmacology, 461:53–61 58 Sansei Nishibe (1997), “Bioactive phenolic compounds for cancer prevention from herbal medicines”, Food Factors for Cancer Prevention, 276-279 59 Sara B Hoot, Kyle M Meyer, John C Manning (2012), “Phylogeny and Reclassification of Anemone (Ranunculaceae), with an Emphasis on Austral Species”, Systematic Botany, 37(1):139–152 60 Schroder HC, Merz H, Steffen R, Muller WE, Sarin PS, Trumm S, et al (1990), “Differential in vitro anti-HIV activity of natural lignans”, Zeitschrift für Naturforschung C, 45(11-12):1215–1221 61 Siti Susanti, H Iwasaki, M Inafuku, N Taira, H Oku (2013), “Mechanism of arctigenin-mediated specific cytotoxicity against adenocarcinoma cell lines”, Phytomedicine, 21(1):39–46 human lung 62 Stefanis L., Burke R.E., Greene L.A (1997), "Apoptosis in neurodegenerative disorders", Current Opinion Neurology, 10:299-305 63 Technical Resources International, “5-(Hydroxymethyl)-2-furfural”, Cas No 67-47-0, Prepared for NCI under Contract No.: NO1-CP-56019 (12/94) 64 Toshiaki Umezawa (2003), “Diversity in lignan biosynthesis”, Phytochemistry Reviews, 2(3): 371–390 65 Van Hoorn DE, Nijveldt RJ, Van Leeuwen PA, Hofman Z, M’Rabet L (2002), “Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of flavonoids”, European Journal of Pharmacology, 451:111–118 66 Wang JL, Liu K, Gong WZ, Wang Q, Xu DT, Liu MF, Bi KL, Song YF (2012), “Anticancer, antioxidant, and antimicrobial activities of Anemone (Anemone cathayensis)”, Food Science and Biotechnology, 21:551–557 67 Wang MK, Wu FE, Chen YZ (1997), “Triterpenoid saponins from Anemone hupehensis”, Phytochemistry, 44:333–335 68 Wang Wencai, Svetlana N Ziman, Bryan E Dutton (2001), Flora of China, 6:307-328 69 Wang XY, Chen XL, Tang HF, Tian XR, Gao H, Zhang PH (2011), “Cytotoxic triterpenoid saponins from the rhizomes of Anemone taipaiensis”, Planta Medica, 77:1550–1554 70 Wen-zhou Zhang, Zheng-kui Jiang, Bao-xia He, and Xian-ben Liu (2015), “Arctigenin Protects against Lipopolysaccharide-Induced Pulmonary Oxidative Stress and Inflammation in a Mouse Model via Suppression of MAPK, HO-1, and iNOS Signaling”, Inflammation, 38(4):1406-1414 71 Xianjuan Kou, Shimei Qi, Wuxing Dai, Lan Luo, Zhimin Yin (2011), “Arctigenin inhibits lipopolysaccharide-induced iNOS expression in RAW264.7 cells through suppressing JAK-STAT signal pathway”, International Immunopharmacology, 11(8):1095–1102 72 Xiaoyang Wang, Minchang Wang, Min Xu, Yi Wang, Haifeng Tang (2014), “Cytotoxic Oleanane-Type Triterpenoid Saponins from the Rhizomes of Anemone rivularis var flore-minore”, Molecules, 19:2121-2134 73 Xu, Q., Y H Li, and X Y Lu (2007), “Investigation on influencing factors of 5-HMF content in Schisandra”, Journal of Zhejiang University Science B, 8:439-445 74 Ye WC, Zhang QW, Zhao SX, Che CT (2001), “Four new oleanane saponins from Anemone anhuiensis”, Chem Pharm Bull, 49:632–634 75 Yi Wang, Wei Kang, Liang-jian Hong, Wen-li Hai, Xiao-yang Wang, Haifeng Tang, Xiang-rong Tian (2013), “Triterpenoid saponins from the root of Anemone tomentosa, Journal of Natural Medicines, 67(1):70-77 76 Yim SH, Lee YJ, Park KD, Lee IS, Shin BA, Jung DW, Williams DR, Kim HJ (2015), “Phenolic constituents from the flowers of Hamamelis japonica”, Natural Product Sciences, 21(3):162-169 77 Zhang LT, Zhang YW, Takaishi Y, Duan HQ (2008), “Antitumor triterpene saponins from Anemone flaccida”, Chinese chemical letters, 19:190–192 78 Zhang Yu, Yang Qin-er (2014), “The Identity of Anemone chapaensis (Ranunculaceae) from Vietnam”, Journal of Tropical and Subtropical Botany, 22(4):335 79 Zijun Luo, Michael R A Morgan and Andrea J Day (2015), “Transport of trans-tiliroside (kaempferol-3-b-D-(6’’-p-coumaroyl-glucopyranoside) and related flavonoids across Caco-2 cells, as a model of absorption and metabolism in the small intestine”, Xenobiotica, 45(8):722-730 80 Ziman SN, Bulakh EV, Kadota Y et al (2008), “Modern view on the taxonomy of the genus Anemone L sensu stricto (Ranunculaceae)”, The Journal of Japanese Botany, 83(3): 127-155 Tiếng Pháp 81 F Gagnepain (1929), “Deux Anémones nouvelles d'Indo-Chine”, Bulletin de la Société Botanique de France, 76(2):315-316 Tiếng Đức 82 Eichler H (1958), “Revision der Ranunculaceen Malesiens”, Bibliotheca Botanica, 31(124):8-14 ... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY PHONG QUỲ SAPA Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng. .. trị sử dụng thuốc, đề xuất thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học theo định hƣớng tác dụng chống oxy hóa Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)? ??... chƣa có tài liệu nghiên cứu chi tiết đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Nhằm mục đích tìm hiểu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Phong quỳ Sa Pa, đặc hữu địa phƣơng, để