NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học của THÂN rễ một LOÀI THUỘC CHI DIOSCOREA l ở SA PA, lào CAI KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA THÂN RỄ MỘT LỒI THUỘC CHI DIOSCOREA L Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾN MÃ SINH VIÊN: 1401666 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA THÂN RỄ MỘT LỒI THUỘC CHI DIOSCOREA L Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nghiêm Đức Trọng Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật HÀ NỘI – 2019 Lời cảm ơn Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nghiêm Đức Trọng, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện học tập, nghiên cứu tốt nhất, động viên em suốt trình em thực đề tài Em xin cảm ơn thầy cô Ban giám hiệu nhà trường, phòng ban, mơn nhiệt tình hỗ trợ em suốt năm học tập thời gian thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, cô Phạm Thị Linh Giang, thầy Lê Thiên Kim chị kỹ thuật viên ln tận tình giúp đỡ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em làm thực nghiệm môn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người thân gia đình, người bạn ln kịp thời động viên, ủng hộ em suốt trình học tập trường thời gian thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Tuyến MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Chi Dioscorea L 1.1.1 Vị trí phân loại chi Dioscorea L 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Dioscorea L 1.1.3 Giá trị sử dụng chi Dioscorea L 1.2 Tổng quan Diosgenin 1.2.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý-hóa 1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 1.2.4 Ứng dụng diosgenin 1.2.5 Các phương pháp định lượng diosgenin CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 11 2.1.1 Nguyên liệu 11 2.1.2 Thiết bị hóa chất 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 12 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Nghiên cứu thực vật 13 2.3.2 Nghiên cứu hóa học 13 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 19 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 19 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 22 3.1.3 Đặc điểm bột thân rễ 24 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 25 3.2.1 Kết định tính sơ nhóm chất phản ứng hóa học 25 3.2.2 Kết xác định hàm ẩm bột dược liệu 30 3.2.3 Kết định tính diosgenin - khảo sát dung mơi khai triển HPTLC, lựa chọn phương pháp chiết xuất 30 3.2.4 Kết thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin HPTLC 31 3.2.5 Bán định lượng diosgenin HPTLC 34 3.3 Bàn luận 35 3.3.1 Đặc điểm thực vật xác định tên khoa học 35 3.3.2 Đặc điểm vi học 36 3.3.3 Về hóa học 36 KẾT LUẬN 39 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT D Dioscorea 16 - DPA 16 – dehydro pregnenolon acetat HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu nâng cao MDA Malondialdehyd MeOH Methanol pp Trang STT Số thứ tự TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loài Dioscorea quan trọng để sản xuất diosgenin công nghiệp Bảng 1.2 Hàm lượng diosgenin số loài Dioscorea [14] Bảng 3.1: Kết định tính sơ nhóm chất thân rễ Dioscorea collettii var hypoglauca 26 Bảng 3.2 Kết xác định hàm ẩm bột dược liệu 30 Bảng 3.3 : Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống 32 Bảng 3.4 Kết thẩm định tính tuyến tính 33 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại 34 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ 34 Bảng 3.8 Đặc điểm phân biệt Dioscorea collettii var hypoglauca Dioscorea collettii var collettii 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo diosgenin Hình 3.1: Hình ảnh đặc điểm quan sinh dưỡng 20 Hình 3.2: Hình ảnh đặc điểm hoa đực 20 Hình 3.3: Hình ảnh đặc điểm hoa 21 Hình 3.4: Hình ảnh đặc điểm hạt 21 Hình 3.5 Hình ảnh vi phẫu 22 Hình 3.6 Hình ảnh vi phẫu thân 23 Hình 3.7 Hình ảnh vi phẫu thân rễ 24 Hình 3.8 Hình ảnh đặc điểm bột thân rễ 25 Hình 3.9: Hình ảnh so sánh khai triển sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi sau phun thuốc thử vanilin 1% acid sulfuric đặc 30 Hình 3.10 Hình ảnh so sánh phương pháp chiết xuất diosgenin 31 Hình 3.11: Kết thẩm định độ đặc hiệu 32 Hình 3.12 Phương trình biểu diễn mối liên hệ diện tích pic lượng diosgenin 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Khoảng 50-60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc toàn cầu sản xuất từ diosgenin Diosgenin biết có mặt nhiều lồi thực vật, loài thuộc chi Trillium L (Melanthiaceae), Costus L (Costaceae), Tacca Forst & Forst f (Taccaceae), Tuy nhiên, có lồi thuộc chi Dioscorea L có giá trị thực tế việc chiết xuất diosgenin [49] Hàng năm ước tính ngành dược cần tới 10.000 thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [48], [50] Nhu cầu lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày lớn nguồn nguyên liệu cung cấp ngày giảm khai thác mức [48], [35], [28] Điều đòi hỏi cần tìm thêm nguồn ngun liệu cung cấp diosgenin Ở Việt Nam, biết 40 lồi thuộc chi Dioscorea L [7] Trong đó, số loài nghiên cứu xác định hàm lượng diosgenin D zingiberensis C.H.Wright., D collettii Hook f., D chingii Prain & Burkill., Dioscorea poilanei Prain & Burk., D simulans Prain et Burkill., D dissimulans Prain et Burkill., D membrancaea Pierre et Craib., D paradoxa Prain et Burkill., D subcalva Prain et Burkill nhiều lồi chưa nghiên cứu Gần đây, trình điều tra tài ngun thuốc chúng tơi có phát lồi Dioscorea sp mọc hoang Sa Pa – Lào Cai có đặc điểm hình thái khác với lồi Dioscorea biết Việt Nam Lồi có đặc điểm tương đồng với số loài Dioscorea biết đến nguồn nguyên liệu để chiết xuất diosgenin (Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb., Dioscorea collettii Hook f.) như: thân khí sinh quấn trái, thân rễ hình củ gừng, phát triển theo chiều ngang Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học thân rễ lồi thuộc chi Dioscorea L Sa Pa, Lào Cai” với mục tiêu: - Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học giám định tên khoa học mẫu thu - Nghiên cứu thành phần hóa học bán định lượng diosgenin thân rễ mẫu thu CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Chi Dioscorea L 1.1.1 Vị trí phân loại chi Dioscorea L Vị trí phân loại chi Dioscorea L theo hệ thống phân loại thực vật Takhatajan 1987 [2] sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliaphyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliidae) Bộ Củ nâu (Dioscoreales) Họ Củ nâu (Dioscoreaceae) Chi Dioscorea L 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Dioscorea L 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật Dây leo gỗ cỏ lâu năm, thân rễ dạng củ có nhiều hình dạng khác Thân khí sinh quấn trái phải, có lơng khơng Lá nguyên, đơn kép chân vịt, mọc xen kẽ mọc đối, có cuống, 3-9 gân từ gốc Kiểu hoa: đa phần hoa đơn tính, lưỡng tính Hoa thường khơng có cuống có cuống ngắn, mọc thành chùm hay rủ xuống Lá đài cánh hoa giống nhau, đài 3, cánh hoa Hoa đực: nhị 6, tất hữu thụ hữu thụ, bất thụ; nhị rời nhau, đính gốc bao hoa đế hoa; bao phấn hướng trong, đính gốc đính lưng, ô, mở khe dọc Hoa loài chi không khác lắm, đặc điểm không phong phú hoa đực Bầu dưới, ô, chứa nhiều nỗn đính trung trụ, vòi nhụy 3, núm nhụy xẻ thùy nông Quả nang, cạnh dạng cánh mở theo khe dọc từ đỉnh, số mọng Hạt có cánh dạng màng [7], [59] 1.1.2.2 Phân bố Chi có khoảng 600 lồi, phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới ôn đới châu Á, Australia châu Mỹ Châu Á có khoảng 140 lồi [24], Việt Nam có 43 lồi [7] 1.1.3 Giá trị sử dụng chi Dioscorea L 1.1.3.1 Trong đời sống - Thân rễ số loài sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn thiếu đói: khoai mỡ (D alata L.), củ từ (D esculenta Lour.), khoai rạng (D glabra modulation of pro-survival and pro-death molecules", Pharmacognosy magazine, 12(Suppl 1), pp S14 44 Jeon Jeong Ryae, Lee Ji Seon et al (2006), "Effect of ethanol extract of dried Chinese yam (Dioscorea batatas) flour containing dioscin on gastrointestinal function in rat model", Archives of pharmacal research, pp 348-353 45 Li Shao, Lu Ai-ping, et al (2003), "Suppressive effects of a Chinese herbal medicine qing-luo-yin extract on the angiogenesis of collagen-induced arthritis in rats", The American journal of Chinese medicine, 31(05), pp 713-720 46 Li Jia, Liu Xuanmin, et al (2005), "Electrochemical study of breast cancer cells MCF-7 and its application in evaluating the effect of diosgenin", Analytical sciences, 21(5), pp 561-564 47 Marín-Medina Alejandro, Ruíz-Hidalgo Gonzalo, et al (2019), "Combined Effect of Diosgenin Along with Ezetimibe or Atorvastatin on the Fate of Labelled Bile Acid and Cholesterol in Hypercholesterolemic Rats", International journal of environmental research and public health, 16(4), pp 627 48 Melinda Bonk (2001), "It’s Not in Your Head, It’s in Your ormones", Fair Winds Press, Canada, pp 75-91 49 Morais Ilmara Cecilia Pinheiro de Silva, Moura Iris Jordânia Luz, et al (2019), "Cardiovascular Effect of Diosgenin in Ovariectomized Rats", Journal of medicinal food 50 M.S Palaniswani, K.V Peter (2008), Tuber and Root Crops, New India Publishing Agency, India 51 M.S Palaniswani, K.V Peter (2008), Horticulture Science Series, Vol 9: Tuber and Root Crops, New India Publishing Agency, India pp 88-90 52 Takeda Ken’s ichi (1972), "The steroidal sapogenin of the Dioscoreaceae", Elsevier, pp 698-745 53 Tang-shui Liu Tseng-Chieng Huang (1960), "Dioscorea kaoi, a New Yam from Taiwan", Taiwannica, (1): 33-34 54 Tharaheswari M, Reddy N Jayachandra, et al (2014), "Trigonelline and diosgenin attenuate ER stress, oxidative stress-mediated damage in pancreas and enhance adipose tissue PPARγ activity in type diabetic rats", Molecular and cellular biochemistry, 396(1-2), pp 161-174 55 Walker Derek (2008), The management of chemical process development in the pharmaceutical industry, John Wiley & Sons, USA 56 Wang Leisheng, Ma Tian, et al (2015), "Diosgenin inhibits IL-1β-induced expression of inflammatory mediators in human osteoarthritis chondrocytes", International journal of clinical and experimental pathology, 8(5), pp 4830 57 Wang Guanghui, Chen Haifeng, et al (2006), "Methyl protodioscin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in HepG2 liver cancer cells", Cancer letters, 241(1), pp 102-109 58 Wu Z Y., P H Raven (eds) (2000), " Flora of China Vol 24 ( Flagellariaceae through Marantaceae)", 24, pp 276, 281, 283 59 Wu Z Y., P H Raven (2000), Flora of China, Vol 24, Missouri Botanical Garden Press,, pp 276-296 60 Zheng Huajie, Wei Zeliang, et al (2016), "Preventive effect of a novel diosgenin derivative on arterial and venous thrombosis in vivo", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 26(14), pp 3364-3369 61 R Knuth (1924), Das Pflanzenreich: regni vegetablilis conspectus, , Verlag von Wilhelm Engelmann, Leipzig, pp 315 62 J.W Palibi (1906), "Quelques Especes Nouvelles de la Flore Chiniose", Bulletin de l'Herbier Boissier, 2(6):21 63 Akira Akahori (1963), Anew species of Dioscorea from Peninsula, Acta Phytotaxonomica et Geobotanica, 19 (4-6) Izu PHỤ LỤC Phiếu giám định tên khoa học, giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục 1.1 Phiếu giám định tên khoa học Phụ lục 1.2 Giấy chứng nhận mã số tiêu mẫu mang hoa đực Phụ lục 1.3 Giấy chứng nhận mã số tiêu mẫu mang hoa Phụ lục 1.4 Giấy chứng nhận mã số tiêu mẫu mang Phụ lục 2: Hình ảnh tiêu khô Phụ lục 2.1 Mẫu mang hoa đực Phụ lục 2.2 Mẫu mang hoa Phụ lục 2.3 Mẫu mang PHỤ LỤC Một số hình ảnh sắc ký thẩm phương pháp bán định lượng diosgenin HPTLC Phụ lục 3.1 Hình ảnh vết sau triển khai sắc ký (366 nm) thẩm định tính tương thích hệ thống phương pháp bán định lượng diosgenin HPTLC Ghi chú: Vết 1-6: dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml, thể tích chấm µl Phụ lục 3.2 Hình ảnh vết sau triển khai sắc ký (366 nm) thẩm định độ lặp lại phương pháp bán định lượng diosgenin HPTLC Ghi chú: Vết 1: Chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml, thể tích chấm µl Vết 2-7: Dung dịch thử, thể tích chấm µl Phụ lục 3.3 Hình ảnh vết sau triển khai sắc ký (366 nm) thẩm định khoảng tuyến tính bán định lượng diosgenin Ghi chú: Vết 1-5: dung dịch diosgenin chuẩn nồng độ 0,989 mg/ml, thể tích chấm 1; 2; 4; 6; µl Vết 6-8: dịch chiết siêu âm bột thân rễ dược liệu, thể tích chấm µl Phụ lục 3.4 Hình ảnh vết sau triển khai sắc ký (366 nm) thẩm độ Ghi chú: Vết 1-5: Vết 1-5: dung dịch diosgenin chuẩn nồng độ 0,989 mg/ml, thể tích chấm 1; 2; 4; 6; µl Vết 6-8: dung dịch thử thêm chuẩn PHỤ LỤC Số liệu diện tích pic sắc ký thẩm định khoảng tuyến tính bán định lượng diosgenin ... ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾN MÃ SINH VIÊN: 1401666 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ MỘT LOÀI THUỘC CHI DIOSCOREA L Ở SA PA, L O CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... thân rễ hình củ gừng, phát triển theo chi u ngang Vì vậy, thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học thân rễ loài thuộc chi Dioscorea L Sa Pa, L o Cai với mục tiêu: - Nghiên cứu. .. học mẫu nghiên cứu - Mô tả đặc điểm vi học: o Vi phẫu: l , thân, thân rễ, rễ o Soi bột: thân rễ 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học - Định tính sơ nhóm chất có thân rễ mẫu nghiên cứu - Chi t xuất,