Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh họ của rễ cây quăng alangium salviifolium (l f )wangerin alangiaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ LỆ THỦY ẢO S T T N T C DỤN SN P ẦN ỌC T EO ƢỚN ỌC CỦ RỄ CÂY QUĂN - Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS HUỲNH NGỌC THỤY Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜ C M ĐO N Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Đặng Thị Lệ Thủy TÓM TẮT LUẬN VĂN T ẠC SĨ DƢỢC HỌC KHÓA 2017 – 2019 Chuyên ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền, mã số: 8720206 Tên đề tài: hảo s t th nh phần h họ hƣớng t ụng sinh họ ủ rễ ây Quăng - Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy Học viên thực hiện: Đặng Thị Lệ Thủy Mở đầu: Các cơng trình khoa học giới loài Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae cho thấy nhiều tác dụng dƣợc lý đáng quý Tuy nhiên có vài nghiên cứu lồi Việt Nam Đề tài tiến hành chiết xuất, sàng lọc phân lập hợp chất có rễ Alangium salviifolium (L.f) Wang hƣớng tác dụng sinh học nhằm cung cấp thêm thơng tin để ứng dụng loài làm thuốc Đối tƣợng nghiên cứu Rễ Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang.) thu hái Quảng Nam (09/2017) Phƣơng ph p nghiên ứu Định danh, lựa chọn nguyên liệu, kiểm tra độ tinh khiết nguyên liệu, khảo sát sơ thành phần hóa thực vật Khảo sát hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa (mơ hình DPPH, ức chế xanthin oxydase) Phân lập, tinh chế, định danh đánh giá hoạt tính sinh học chất tinh khiết Kết Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu xác rễ Quăng Chiết xuất đánh giá tác dụng sinh học kg rễ Quăng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 450 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng thu đƣợc 60 g cao diclorometan (cao A), g cao ethyl acetat (cao B), 67 g alkaloid toàn phần (cao D) Phân đoạn A3 A5 từ cao A, phân đoạn D3.1 D3.3 từ cao D có HTCO cao phân đoạn khác nên chọn phân lập hợp chất tinh khiết Phân lập xác định hợp chất tinh khiết Từ cao A1 thu đƣợc hỗn hợp stigmasterol β-Sitosterol (AS1; 36,18 mg) Từ cao A3 thu đƣợc mansonon H (AS7, 11 mg); dehydrooxoperezinon (AS8, mg) β-Sitosterol glucosid (AS9; 31,2 mg) Từ cao A5 thu đƣợc 25 mg AS4 Từ cao D3 thu đƣợc mg AS5 angustinin (AS6; 18,58 mg) Thử tác dụng sinh học Hợp chất angustinin AS6 c HTCO mạnh mơ hình DPPH (IC50 = 32,5 µM), mơ hình ức chế xanthin oxydase c ng c tác dụng tốt (IC50 = 110,7 µM) Mansonon H (AS7) dehydrooxoperezinon (AS8) khơng có HTCO mơ hình DPPH ức chế xanthin oxydase Bàn luận: Cần tiếp tục thử nghiệm tác dụng sinh học chất tinh khiết phân lập chất từ phân đoạn giàu tiềm SUMMARY THESIS OF MASTER OF PHARMACY – Course: 2017 – 2019 Major: Pharmacognosy - Traditional Pharmacy – Code: 8720206 BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FROM ROOT OF Alangium salviifolium (L.f.) Wangerin Alangiaceae Instructor: Huynh Ngoc Thuy, Assoc Prof., Dr Student: Dang Thi Le Thuy Introduction: In scientific lituretures, Alangium salviifolium (L.f) Wang has been reported to have potential efficacy against many diseases, however there are some study about this plant in Viet Nam This study was conducted on root Materials: Roots of Alangium salviifolium (L.f) Wang were collected on 9/2017 in Quang Nam Methods: Extraction, seperation, isolation and purification were done as routine work Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects (DPPH and xanthin oxydase inhibition) Results: Chemical composition and bio-assay screening : kg of root powder was extracted with 96% ethanol to yield 450 g extract, which succesively portioned with solvent to obtain 60 g dichlorometane (fraction A), g ethyl acetate (fracti B), 67g total alkaloid fractions (fraction D) Screening in vitro antioxidant effect on all fractions Fraction A3 and A5 from fraction A, fraction D3.1 and D3.3 from fraction D had high reduce ability so to isolate Isolation and structure elucidation Fraction A1 was obtained a mixture of sterol (AS1; 36,18 mg) Fraction A3 was obtained mansonon H (AS7, 11 mg); dehydrooxoperezinon (AS8, mg) β-Sitosterol glucosid (AS9; 31,2 mg) Fraction A5 was obtained AS4 (25 mg) Fraction D3 was obtained AS5 (2 mg ) and angustinin (AS6; 18,58 mg) Bio-assay testing: Angustinin (AS6) showed high ability in DPPH radical scavenging (IC50 = 32,5 µM) and in xanthin oxydase inhibitory (IC50 = 110,7 µM) Mansonon H (AS7) dehydrooxoperezinon (AS8) did not show ability in DPPH and xanthine oxxydase Conclusion: Alangium salviifolium (L.f) Wang has potetial on treatment diseases such as cancer, gout, hepatitis Futher studies about the effect of constituents from this plant have to be conducted MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm họ Alangiaceae 1.1.3 Đặc điểm chi Alangium 1.1.4 Đặc điểm loài Alangium salviifolium 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ 10 1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 10 1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 11 1.3.3 Tác dụng kháng viêm, giảm đau 12 1.3.4 Tác dụng độc tế bào, kháng ung thƣ 13 1.3.5 Tác dụng chống loét dày .14 1.3.6 Tác dụng bảo vệ gan 14 1.3.7 Tác dụng hạ đƣờng huyết .14 1.3.8 Tác dụng lợi tiểu 15 1.3.9 Một số tác dụng khác .15 1.4 CÔNG DỤNG 15 1.5 GỐC TỰ DO VÀ MƠ HÌNH THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 16 1.5.1 Gốc tự 16 1.5.2 Mơ hình DPPH 17 1.5.3 Mơ hình thử tác dụng ức chế enzym xanthin oxydase 18 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.2 DUNG MƠI, HĨA CHẤT, THIẾT BỊ 20 2.2.1 Dung môi, hóa chất 20 2.2.2 Máy móc, thiết bị .21 2.2.2.1 Máy móc, trang thiết bị cho phân tích hóa học 21 2.2.2.2 Máy móc, trang thiết bị cho khảo sát sinh học .21 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 22 2.3.1 Khảo sát thực vật học, định danh loài 22 2.3.2 Thử tinh khiết 22 2.3.3 Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật dƣợc liệu rễ Quăng 23 2.3.4 Chiết xuất 23 2.3.5 Sàng lọc sinh học phân lập chất tinh khiết 23 2.3.5.1 Chiết xuất để sàng lọc sinh học 23 2.3.5.2 Sàng lọc sinh học 23 2.3.5.3 Phân lập hợp chất tinh khiết 27 2.3.6 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 27 2.3.6.1 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập đƣợc 27 2.3.6.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ 30 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 30 3.1.1 Đặc điểm hình thái 30 3.1.2 Đặc điểm vi học .31 3.1.3 Giải trình tự DNA để định danh 34 3.2 THỬ TINH KHIẾT 36 3.3 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 36 3.4 CHIẾT XUẤT 37 3.5 SÀNG LỌC TÁC DỤNG SINH HỌC 40 3.5.1 Mơ hình DPPH 40 3.5.1.1 Sàng lọc cao toàn phần, cao A, cao B, cao D, cao E 40 3.5.1.2 Sàng lọc cao phân đoạn A1, A2, A3, A4, A5, A6 41 3.5.1.3 Sàng lọc cao phân đoạn D1, D2, D3 42 3.5.1.4 Sàng lọc cao phân đoạn D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 43 3.5.2 Mơ hình ức chế xanthin oxydase 45 3.5.2.1 Sàng lọc cao toàn phần, cao A, cao B, cao D, cao E 45 3.5.2.2 Sàng lọc cao phân đoạn cao A1, A2, A3, A4, A5, A6 .45 3.5.2.3 Sàng lọc cao phân đoạn D1, D2, D3 46 3.5.2.4 Sàng lọc cao phân đoạn D3.1, D3.2, D3.3, D3.4, D3.5 47 3.6 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT .48 3.6.1 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao A .48 3.6.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao D 52 3.7 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT .55 3.7.1 Hợp chất AS1 .55 3.7.2 Hợp chất AS4 .55 3.7.3 Hợp chất AS5 .56 3.7.4 Hợp chất AS6 .56 3.7.5 Hợp chất AS7, AS8 .57 3.7.6 Hợp chất AS9 .59 3.8 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 60 3.8.1 Hợp chất AS1 .60 3.8.2 Hợp chất AS4 .62 3.8.3 Hợp chất AS5 .64 3.8.4 Hợp chất AS6 .66 3.8.5 Hợp chất AS7 .70 3.8.6 Hợp chất AS8 .73 3.8.7 Hợp chất AS9 .76 3.9 THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC .78 3.9.1 Mơ hình DPPH 78 3.9.2 Thử nghiệm mơ hình ức chế xanthin oxydase .79 BÀN LUẬN .82 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .86 TÀI LIỆU THAM KHẢO .90 PHỤ LỤC 96 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩ Độ hấp thu Abs Absorbance ABTS 2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazilin-6-sulfonat) APCI Atmospheric-pressure chemical ionization br broad Đỉnh rộng COSY Collerated Spectroscopy Phổ tƣơng quan 1H-1H d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid 10 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 11 EC50 Effective concentration 50% 12 FRAP Ferric ion Reducing Antioxidant Power 13 HDLcholesterol High Density Lipoprotein Cholesterol 14 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Corelation 15 HPLC High Performance Liquid Chromatography 16 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation 17 HTCO Hoạt tính chống oxy hóa 18 IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% 19 J Coupling constan Hằng số ghép 20 LPS Lipo polysaccharid 21 m multiplet 22 MHz Mega hertz Cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao Sắc ký lỏng hiệu cao Đỉnh phức tạp 23 MOLT-3 T lymphoblastic leukaemia 24 MS Mass Spectrometry Phổ khối 25 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân 26 PDA Photodiode Array Dãy diod quang 27 PGE2 Prostaglandin E2 28 ppm Parts per million 29 RAW-264,7 Dòng tế bào đại thực bào 30 s singlet 31 SGOT Serum Glutamo-oxalo Transaminase 32 SGPT Serum Glutamic-pyruvic Transaminase 33 SKOV-3 Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng 34 SKC Sắc ký cột 35 SKĐ Sắc ký đồ 36 SKLM Sắc ký lớp mỏng 37 t triplet 38 TT Thuốc thử 39 TNF-α Tumor necrosis factor α 40 TLTK Tài liệu tham khảo 41 UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography 42 UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 43 VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không 44 VS Vanillin-acid sulfuric 45 XO Xanthin oxydase Đỉnh đơn Đỉnh ba Yếu tố hoại tử khối u α Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-106 Phụ lục 3.97 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng δH 1,7-2,55 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-107 Phụ lục 3.98 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-108 Phụ lục 3.99 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng δC 20-180 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-109 Phụ lục 3.100 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng δC 85-180 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-110 Phụ lục 3.101 Phổ HSQC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 2,0-7,0; δC 10-130 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-111 Phụ lục 3.102 Phổ HSQC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 1,7-2,7; δC 10-40 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-112 Phụ lục 3.103 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-113 Phụ lục 3.104 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 7,0-11,0; δC 95-160 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-114 Phụ lục 3.105 Phổ HMBC (DMSO-d6, 125/500 MHz) vùng δH 1,7-2,7; δC 95-180 AS8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-115 Phụ lục 3.106 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-116 Phụ lục 3.107 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng δH 2,9-5,4 AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-117 Phụ lục 3.108 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) vùng δH 0,6-2,4 AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-118 Phụ lục 3.109 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-119 Phụ lục 3.110 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng δC 55-145 AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-120 Phụ lục 3.111 Phổ 13C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) vùng δC 20-50 AS9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... cứu thành phần hóa học thử tác dụng sinh học loài Alangium salviifolium (L. f. ) Wang Tiếp nối đề tài luận văn cao học khóa 2016-2018 khảo sát vỏ thân Quăng Quảng Ngãi nhằm đƣa chứng khoa học để... salviifolium Tên khoa học: Alangium salviifolium (L. f. ) Wang thuộc họ Thôi chanh Alangiaceae (Cornaceaae) [6], [8], [43] Đồng danh: đồng danh thứ (loài phụ) Alangium salviifolium (L. f. ) Wang Alangium. .. SĨ DƢỢC HỌC KHÓA 2017 – 2019 Chuyên ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền, mã số: 8720206 Tên đề tài: hảo s t th nh phần h họ hƣớng t ụng sinh họ ủ rễ ây Quăng - Alangium salviifolium (L. f. ) Wangerin