Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của cây thạch châu (pyrenaria sp ), họ chè (theaceae)

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .…1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Chi Pyrenaria .3 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Công dụng sử dụng dân gian .5 1.1.3 Thành phần hóa học tác dụng sinh học 1.2 Gốc tự chất chống oxi hóa CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .9 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất 2.2.2 Phương tiện máy móc .10 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật giám định tên khoa học .11 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 12 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa phân đoạn cao hợp chất phân lập test in vitro mô hình in vivo .20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .26 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học 26 3.1.2 Đặc điểm vi học .28 3.2 Định tính thành phần hóa học 33 3.2.1 Định tính phản ứng hóa học đặc trưng 33 3.2.2 Định tính phương pháp sắc kí lớp mỏng 34 3.2.3 Kết định lượng polyphenol tổng số 39 3.3 Chiết xuất phân lập số hợp chất Thạch châu 40 3.3.1 Chiết xuất chuẩn bị cao phân đoạn 40 3.3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 41 3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập 42 3.3.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Thạch châu 45 3.4 Tác dụng chống oxy hóa test in vitro mô hình in vivo 51 3.4.1 Thử tác dụng test in vitro dọn gốc tự DPPH 51 3.4.2 Thử tác dụng test in vitro dọn gốc tự Superoxyd .53 3.4.3 Thử tác dụng chống oxy hóa mô hình in vivo 54 CHƢƠNG BÀN LUẬN 57 4.1 Về thực vật .57 4.2 Về thành phần hóa học .58 4.3 Về tác dụng chống oxi hóa mối liên quan với thành phần hóa học 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .62 Kết luận 62 Kiến nghị 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ BuOH n- Butanol 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR DCM Dichlorometha DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl DTNB 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol MS Mass Spectrometry (phổ khối lƣợng) GSH Glutathione Hex n-Hexan HPLC High performance liquid chromatography IC50 Inhibitory concentration 50% IR Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại) IUCN International Union for Conservation of Nature MDA Malonyl dialdehyd NMR Nuclear Magnetic Resonance OD Optical Density POL Lipid peroxidation Rf Retardation Factor RSD Relative standard devition SD Standard devition SKLM (TLC) Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) SOD Superoxide dismutase ROS/RNS/RCS SRSA Reactive oxygen species/ reactive nitrogen species/ reactive chlorine species Superoxide radical scavenging activity TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TNB 5-thionitrobenzoic acid UV-VIS Ultra violet – Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng Trang Bảng 2.1 Cách pha hỗn hợp thử nghiệm phản ứng với DPPH 21 Bảng 3.1 Kết định tính hóa học nhóm chất Thạch châu 33 Bảng 3.2 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất PJE1 so sánh với chất 45 -amyrin β-amyrin Bảng 3.3 Bảng số liệu phổ NMR chất PJE2 so sánh với chất α- 48 tocopherolquinon Bảng 3.4 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất PJE3 so sánh với chất 50 Phytol Bảng 3.5 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH phân 51 đoạn từ mẫu Thạch châu Bảng 3.6 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH hợp 52 chất phân lập từ mẫu Thạch châu Bảng 3.7 Bảng Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự Superoxyd 53 phân đoạn từ mẫu Thạch châu Bảng 3.8 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự Superoxyd hợp 53 chất phân lập từ mẫu Thạch châu Bảng 3.9 Hàm lƣợng MDA gan chuột (nmol/ 100mg gan) 55 Bảng 3.10 Hàm lƣợng GSH gan chuột (nmol/ 100mg gan) 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Một số chất chống oxi hóa thƣờng gặp tự nhiên Hình 2.1 Một số hình ảnh Thạch châu (Pyrenaria jonquieriana Pierre ex Laness.) Hình 2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu Thạch châu nghiên cứu 19 Hình 2.3 Công thức cấu tạo dạng chuyển hóa DPPH 20 Hình 2.4 Sơ đồ Thiết kế thí nghiệm chuột 24 Hình 3.1 Ảnh quan sinh dƣỡng Thạch châu nghiên cứu 26 Hình 3.2 Ảnh quan sinh sản mẫu Thạch châu nghiên cứu 27 Hình 3.3 Hình ảnh vi phẫu cắt ngang mẫu Thạch châu nghiên cứu 28 Hình 3.4 Hình ảnh vi phẫu thân Thạch châu 30 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột hoa Thạch châu 31 Hình 3.6 Một số đặc điểm bột thân Thạch châu 32 Hình 3.7 Kết định tính phân đoạn Hex Thạch châu 35 Hình 3.8 Kết định tính phân đoạn EtOAc Thạch châu 36 Hình 3.9 Kết định tính phân đoạn BuOH Thạch châu 37 Hình 3.10 Kết định tính phân đoạn EtOH (C) phân đoạn 38 nƣớc (N) Hình 3.11 Kết định tính phân đoạn EtOH (C) phân đoạn 39 nƣớc (N) Hình 3.12 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn cao mẫu Thạch châu 40 Hình 3.13 Sơ đồ phân lập số hợp chất từ Thạch châu 42 Hình 3.14 Sắc ký đồ định tính hợp chất phân lập đƣợc từ phân 43 đoạn EtOAc mẫu Thạch châu nghiên cứu Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 44 Hình 3.16 Công thức cấu tạo chất PJE1 (β-amyrin) 47 Hình 3.17 Công thức cấu tạo chất PJE2 (α-tocopherolquinon) 49 Hình 3.18 Công thức cấu tạo chất PJE3 (phytol) 51 Hình 3.21 Tác dụng thạch châu đến hàm lƣợng MDA gan 54 chuột bị gây độc CCl4 Hình 3.22 Tác dụng thạch châu đến hàm lƣợng GSH gan chuột bị gây độc CCl4 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO), có đến 80% dân số giới có sử dụng dƣợc liệu chăm sóc sức khỏe có 25% loại thuốc đại có nguồn gốc (trực tiếp hay gián tiếp) từ dƣợc liệu [12] WHO khuyến nghị nƣớc quan tâm đến việc dùng thuốc cổ truyền vào chăm sóc sức khỏe ban đầu, đánh giá mức độ an toàn hiệu nhƣ bảo đảm nguồn cung cấp thuốc Trong vài thập kỷ gần đây, với xu hƣớng “Trở với thiên nhiên”, nhiều nƣớc giới đẩy mạnh nghiên cứu, trồng trọt, bào chế sản xuất chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, từ cây, làm thuốc để hỗ trợ, phòng ngừa điều trị bệnh Chi Pyrenaria chi nhỏ họ Chè (Theaceae) với khoảng 26 loài giới [29] Các loài chi thƣờng mọc vùng núi cao, khí hậu mát mẻ Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản (Đảo Ryukyu), Malaysia, Myanmar, Philippines, Thailand, Việt Nam Gần phát loài thạch châu Pyrenaria jonqueiana Pierre mọc nhiều tỉnh vùng Tây Nguyên nƣớc ta Lá thạch châu đƣợc dân địa phƣơng sử dụng làm nƣớc uống hàng ngày có tác dụng giải nhiệt, mát gan, lợi mật, tăng cƣờng sức đề kháng Tra cứu tài liệu giới có nghiên cứu chi Pyrenaria Tại Việt Nam, có nghiên cứu Nguyễn Văn Dũng cộng chứng minh dịch chiết EtOH từ loài Pyrenaria jonqueiana Pierre có tác dụng ức chế mạnh hoạt tính pepsin protease HIV-1, có khả ngăn nhân lên virut HIV [11] Nhƣ vậy, đến có nghiên cứu thực vật học, thành phần hóa học tác dụng Từ lý trên, đề tài “Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa Thạch châu (Pyrenaria sp.), họ Chè (Theaceae)” đƣợc thực với mục tiêu sau: Nghiên cứu đặc điểm thực vật giám định xác tên khoa học mẫu nghiên cứu Định tính nhóm hợp chất phân lập 2-3 hợp chất từ mẫu nghiên cứu Thử tác dụng chống oxy hóa dược liệu hợp chất phân lập CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Chi Pyrenaria 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân loại Theo tài liệu tham khảo, chi Pyrenaria đƣợc phân loại nhƣ sau [29]: Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ (Order): Thạch lam (Ericales) Họ (Family) : Chè (Theaceae) Chi (Genus): Thạch Châu (Pyrenaria) 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây bụi gỗ lớn, thƣờng xanh Lá mọc đối, mép khía rãng cƣa Hoa đơn, mọc nách, có cuống nhỏ Cánh hoa (hoặc 6), xếp đè lên nhau, kéo dài, không đều, bên màu nâu nhẵn [14] Cánh hoa (hoặc hơn), màu trắng màu vàng nhạt Nhị nhiều, nhẵn, bao phấn cao, mọc thẳng Nhụy cao, có 3-5 noãn Quả đơn, cứng, tự mở, thƣờng chứa hạt noãn Hạt không cánh, vỏ mịn Rốn hạt lớn, nội nhũ, mầm mỏng [29] 1.1.1.3 Phân bố Chi Pyrenaria chi nhỏ họ Chè (Theaceae) khoảng 26 loài giới [29] Các loài chi thƣờng mọc vùng núi cao, khí hậu mát mẻ Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản (Đảo Ryukyu), Malaysia, Myanmar, Philippines, Thailand, Việt Nam Hiện nay, theo phân loại dự án “The plant list”, chi Pyrenaria có 18 loài [52] Còn thực vật chí Trung Quốc công bố chi Pyrenaria có khoảng 26 loài giới nhƣng có 13 loài đƣợc tìm thấy Trung Quốc [29] Ở Việt Nam, chi Pyrenaria đƣợc công bố có 04 loài bao gồm: P garraetiana, P jonqueriana, P polianeana, P serrata mọc tạo Sapa, Bạch Mã (Huế), Đà Lạt, Quảng Trị [14] PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HSQC PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HSQC ... có nghiên cứu thực vật học, thành phần hóa học tác dụng Từ lý trên, đề tài Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa Thạch châu (Pyrenaria sp.), họ Chè (Theaceae) đƣợc thực. .. 1.1.3 Thành phần hóa học tác dụng sinh học Hiện nghiên cứu chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại theo phƣơng pháp nhƣ Protein hay ADN hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng. .. Superoxyd .53 3.4.3 Thử tác dụng chống oxy hóa mô hình in vivo 54 CHƢƠNG BÀN LUẬN 57 4.1 Về thực vật .57 4.2 Về thành phần hóa học .58 4.3 Về tác dụng chống