Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân cây quăng (alangium salviifolium l f wang , alangiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÙI HOÀNG MINH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG (ALANGIUM SALVIIFOLIUM L.F WANG., ALANGIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÙI HOÀNG MINH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG (ALANGIUM SALVIIFOLIUM L.F WANG., ALANGIACEAE) Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN HÙNG TP HỒ CHÍ MINH - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Bùi Hồng Minh TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2016 – 2018 Chuyên ngành: Dược liệu –Dược học cổ truyền, mã số: 8720206 Tên đề tài: Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng sinh học của vỏ thân Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae) Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Hùng Học viên thực hiện: Bùi Hoàng Minh Mở đầu: Các cơng trình khoa học giới loài Alangium salviifolium (L.f) Wang., Alangiaceae cho thấy nhiều tác dụng dược lý đáng quý Tuy nhiên chưa có nghiên cứu lồi Việt Nam Đề tài tiến hành phân lập thành phần hóa học có vỏ thân Alangium salviifolium (L.f) Wang theo định hướng tác dụng sinh học nhằm cung cấp thêm thơng tin góp phần chứng minh tác dụng thuốc Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân Quăng (Alangium salviifolium (L.f) Wang.) thu hái Quảng Ngãi (07/2016) Phương pháp nghiên cứu: Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết; Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa (mơ hình DPPH, ức chế xanthin oxydase) độc tế bào (mơ hình MTT với dịng tế bào MDA-MB 231, RD, HepG2) Phân lập, tinh chế, định danh đánh giá hoạt tính sinh học chất phân lập Kết quả: Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu xác vỏ thân Quăng hình thái thực vật ADN Chiết tách đánh giá tác dụng sinh học cao chiết, phân đoạn: Từ 10 kg vỏ thân Quăng, phương pháp chiết ngấm kiệt thu 554 g cao cồn Bằng chiết phân bố rắn – lỏng cao cồn, thu 50 g phân đoạn DCM, 31 g phân đoạn EtOAc, 408 g phân đoạn MeOH Phân đoạn alkaloid toàn phần (30 g) tách từ phân đoạn MeOH cho tác dụng sinh học tốt mô hình Phân lập xác định cấu trúc: Từ 31 g phân đoạn EtOAc qua sắc ký cột tải kết hợp kết tinh phân đoạn thu kết tinh Thông qua kỹ thuật phổ định danh acid betulinic (A2a, 30 mg), demethylalangisid (A2e, 25 mg) với hỗn hợp (1:1) stigmasterol-3-O-glucosid β-sitosterol-3-O glucosid (124 mg) chất (A2c, 34 mg) định danh Từ 30 g phân đoạn alkaloid toàn phần, kỹ thuật sắc ký cột kết hợp với HPLC điều chế thu chất Bằng kỹ thuật phổ, cấu trúc đề nghị psychotrin (Aa1, 14 mg) demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg) Thử tác dụng sinh học: Demethylalangisid cho khả ức chế mạnh DPPH (IC50 = 31,36 µM), demethylpsychotrin ức chế xanthin oxydase với IC50 = 23,8 µM tương đương với allopurinol; psychotrin độc với tế bào ung thư HepG2 với IC50 = 9,83 µM Việc thử nghiệm tác dụng sinh học chất tinh khiết phân lập chất khác từ phân đoạn giàu tiềm tiếp tục SUMMARY THESIS OF MASTER OF PHARMACY – Course: 2016 – 2018 Major: Traditional Pharmacy – Code: 8720206 BIOASSAY-GUIDED PHYTOCHEMICAL STUDY OF CONSTITUENTS FROM TRUNK BARK OF Alangium salviifolium (L.f.) Wang., Alangiaceae Instructor: Tran Hung, Assoc Prof., Dr Student: Bui Hoang Minh Introduction: Alangium salviifolium (L.f) Wang has been known to have potential efficacy against numbers of diseases However, there is no study about this plant in Viet Nam so far This study was conducted to isolated of bioactive compounds from trunk bark of A saviifolium by bioassay-guided fractionation as first step to prove the usefulness of this plant Materials: Trunk bark of Alangium salviifolium (L.f) Wang was collected on 10/2016 in Quang Ngai Methods: Extraction, seperation, isolation and purification were done as routine works Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods In vitro screening of fractions for antioxidant (DPPH and xanthin oxidase inhibitory activities) and cytotoxic activities (with cell lines MDA-MB 231, RD, HepG2) were performed as in literatures Results: Bio-assay screening of ethanolic extract and its fractions: From 10 kg of truck bark powder, 554 g of 96% ethanolic extract was obtained It was further solid-liquid partioned between Silica gel and succesively solvents to obtain DCM (50 g), EtOAc (31 g), and MeOH (408 g) fractions From MeOH fraction, 30g of total alkaloid subfraction was obtained In vitro antioxidative and cytotoxic activities on EtOH extract, CHCl3, EtOAc, MeOH and total alkaloid fractions revealed that the alkaloid fraction had the highest reduce ability and cytotoxic activity Chemical composition : EtOAc extract (31 g) was further separated by overloaded-column to obtain 10 fractions Betulinic acid (A2a, 30 mg), a mixture of stigmasterol-3-O-glucosid β-sitosterol-3-O glucosid (A2b, 124 mg) and demethylalangisid (A2e, 25 mg) were isolated from these fractions by fractional crystallization From 30 g of total alkaloid sub-fraction, psychotrin (Aa1, 14 mg) and demethylpsychotrin (Aa3, 17 mg) were isolated and characterizated by CC combined with pep-HPLC IC50 of isolated compounds in DPPH and cytotoxic models: Demethylalangisid showed high ability in DPPH radical scavenging (IC50 = 31,36 µM) while demethylpsychotrin had the same result in xanthin oxydase inhibitory (in comparison with allopurinol) and psychotrin proved its potential cytotoxic effect (IC50 = 9,83 µM) on HepG2 cell line Conclusion: A salviifolium (L.f) Wang has potential activities on treatment diseases such as cancer, gout, hepatitis Further studies on constituents and activities of this plant are in process i MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .3 1.1.1 Thực vật học .3 1.1.2 Thành phần hóa học: .7 1.1.3 Tác dụng dược lý 11 1.1.4 Một số kinh nghiệm sử dụng Quăng dân gian .18 Gốc tự và một số mô hình thử tác động chống oxy hóa 18 1.2.1 Gốc tự 18 1.2.2 Một số mô hình thử tác động chống oxy hóa 19 Tổng quan về bệnh ung thư 20 1.3.1 Khái niệm .20 1.3.2 Các mô hình nghiên cứu khảo sát độc tính tế bào 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu .23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Xác định nguyên liệu 25 2.2.2 Kiểm tinh khiết .26 2.2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật vỏ thân Alangium salviifolium 26 2.2.4 Chiết xuất và phân lập 26 ii 2.2.5 Xác định cấu trúc chất phân lập được 28 2.2.6 Sàng lọc sinh học 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ 33 3.1 Khảo sát thực vật học .33 3.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 33 3.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học .33 3.1.3 Định danh phương pháp giải trình tự ADN 37 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 37 3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật 38 3.4 Nghiên cứu hóa học theo định hướng tác dụng sinh học 38 3.4.1 Đánh giá tác dụng sinh học bộ phận dùng (lá, vỏ thân rễ) .38 3.4.2 Chiết phân đoạn từ cao cồn vỏ thân Alangium salviifolium 39 3.4.3 Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn EtOAc (A2) .44 3.4.4 Phân tách các phân đoạn từ phân đoạn alkaloid toàn phần (Aa) 47 3.4.5 Phân tách các phân đoạn từ Aa.2 52 3.4.6 Phân tách các phân đoạn từ Aa.2.3 .55 3.4.7 Phân tách các phân đoạn từ Aa.3 57 3.4.8 Phân tách các phân đoạn từ Aa.3.3 .60 3.5 Phân lập 62 3.5.1 Phân lập A2a từ A2.1 .62 3.5.2 Phân lập A2b từ A2.3 A2.4 62 3.5.3 Phân lập A2c từ A2.6 .62 3.5.4 Phân lập A2e từ A2.10 63 3.5.5 Phân lập Aa1 từ Aa 63 3.5.6 Phân lập Aa3 từ Aa.8 .63 3.6 Xác định độ tinh khiết cấu trúc chất phân lập .63 3.6.1 Chất A2a 63 iii 3.6.2 Chất A2b 65 3.6.3 Chất A2e 67 3.6.4 Chất Aa3 72 3.6.5 Chất Aa1 77 3.6.6 Chất A2c 80 3.6.7 Tổng kêt kết quả phân lập 82 3.7 Thử nghiệm tác dụng sinh học một số chất phân lập 83 3.7.1 Mơ hình DPPH .83 3.7.2 Ức chế xanthin oxydase 84 3.7.3 Độc tế bào 84 CHƯƠNG BÀN LUẬN 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 Kết luận 89 Đề nghị 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PL.1 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Bảng thống kê đặc điểm số loài thuộc chi Alangium có châu Á .3 Bảng 1.2 Một số alkaloid có phận lồi Alangium salviifolium Bảng 2.1 Các loại mẫu cho thử nghiệm in vitro mơ hình DPPH 30 Bảng 2.2 Các loại mẫu dùng cho thử nghiệm in vitro tác dụng ức chế xanthin oxidase 31 Bảng 3.1 Kết kiểm tra độ tinh khiết bột vỏ thân Quăng .38 Bảng 3.2 Bảng kết khảo sát hóa thực vật vỏ thân Quăng 38 Bảng 3.3 Khả ức chế xanthin oxydase cao cồn (Lá, Vỏ thân, Rễ) 39 Bảng 3.4 Khả ức chế cao cồn vỏ thân rễ dòng tế bào ung thư 39 Bảng 3.5 Phần trăm ức chế xanthin oxidase (%) cao 42 Bảng 3.6 Kết % ức chế phân đoạn dòng tế bào ung thư .42 Bảng 3.7 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột tải A2 .45 Bảng 3.8 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột tải phân đoạn Aa .49 Bảng 3.9 Kết khả ức chế xanthin oxydase cao phân đoạn Aa.1-9 51 Bảng 3.10 Kết khả ức chế tế bào ung thư HepG2 phân đoạn Aa.1Aa.9 51 Bảng 3.11 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.2 53 Bảng 3.12 Kết khả ức chế xanthin oxydase cao phân đoạn Aa.2.1Aa.2.5 55 Bảng 3.13 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.2.3 57 Bảng 3.14 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.3 58 Bảng 3.15 Kết khả ức chế xanthin oxydase phân đoạn Aa.3.1-Aa.1.5 60 Bảng 3.16 Kết phân đoạn thu từ sắc ký cột cổ điển Aa.3.3 62 Bảng 3.17 Bảng so sánh phổ NMR A2a acid betulinic 65 Bảng 3.18 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR A2b Stigmasta-5,22-dien-3-β-O- glucopyranosid 66 v Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR A2e 69 Bảng 3.20 Bảng so sánh phổ 13 C-NMR A2e demetylalangisid (trích vùng aglycon) .71 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ NMR Aa3 (MeOD) .73 Bảng 3.22 Bảng so sánh phổ NMR Aa3 với 9-demetylpsychotrin 77 Bảng 3.23 Bảng so sánh liệu phổ NMR Aa1 với Aa3 79 Bảng 3.24 Bảng so sánh liệu phổ 13C-NMR Aa1 với psychotrin 80 Bảng 3.25 Kết thử nghiệm khả chống OXH mơ hình DPPH 83 Bảng 3.26 Giá trị IC50 mẫu thử mơ hình DPPH 84 Bảng 3.27 Kết thử nghiệm ức chế xanthin oxydase 84 Bảng 3.28 Giá trị IC50 mẫu thử thử nghiệm ức chế xanthin oxydase 84 Bảng 3.29 Giá trị IC50 mẫu thử thử nghiệm độc tế bào 85 Bảng 3.30 Bảng tổng kết kết thử sinh học chất tinh khiết 85 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.60 Phụ lục 49 Dữ liệu phổ Aa1: UV Phụ lục 50 Dữ liệu phổ Aa1: HR-MS(ESI+) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.61 Phụ lục 51 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.62 Phụ lục 52 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) trích vùng δC 60 ppm-180 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.63 Phụ lục 53 Dữ liệu phổ Aa1: 13C-NMR (MeOD-d4) trích vùng δC 10 ppm-60 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.64 Phụ lục 54 Dữ liệu phổ Aa1: DEPT Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.65 Phụ lục 55 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.66 Phụ lục 56 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) trích vùng δH 3,5ppm – 7,0 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.67 Phụ lục 57 Dữ liệu phổ Aa1: 1H-NMR (MeOD-d4) trích vùng δH 3,5ppm – 7,0 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.68 Phụ lục 58 Dữ liệu phổ Aa1: HSQC Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.69 Phụ lục 59 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.70 Phụ lục 60 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH 6,3 ppm – 7,3 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.71 Phụ lục 61 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH 2,7 ppm – 3,9 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.72 Phụ lục 62 Dữ liệu phổ Aa1: HMBC (MeOD-d4) trích vùng δH ppm – 3,5 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.73 Phụ lục 63 Dữ liệu phổ Aa1: COSY (MeOD-d4) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL.74 Phụ lục 64 Dữ liệu phở Aa1: COSY (MeOD-d4) trích vùng 0,8ppm – 3,5 ppm Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BÙI HOÀNG MINH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY QUĂNG (ALANGIUM SALVIIFOLIUM L. F WANG. , ALANGIACEAE) Chuyên... phân l? ??p gồm salviifosid A, salviifosid B, salviifosid C, cùng với hợp chất phenolic gồm salicin flavonoid: kaempferol, and kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid từ Alangium salviifolium (L. f. ) Wang. .. nh? ?, có l? ?ng 1.1.1.3 Loài Alangium salviifolium (L. f. ) Wang Tên khoa học: Alangium salviifolium (L. f. ) Wang Đồng danh: Alangium lamarckii Thwaites, Alangium decapelatum Lam Tên thường gọi: Quăng,