Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan hoàng long ( coelogyne lawrenceana rolfe)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - - NGUYỄN THỊ THỦY Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng long ( Coelogyne lawrenceana Rolfe) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cùng với phát triển nhanh chóng xã hội, nhu cầu hoa giới nói chung Việt Nam nói riêng ngày gia tăng Hoa tươi trở thành loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao chiếm vị trí đặc biệt thị trường hàng hóa nơng nghiệp; đó, hoa lan loài hoa nhiều người ưa chuộng phổ biến [16] Tuy nhiên số lượng nhiều lồi lan tự nhiên có xu hướng giảm ảnh hưởng bất lợi điều kiện môi trường nạn khai thác mức Trong tự nhiên lan nhân giống chủ yếu hình thức sinh sản vơ tính (nhân chồi) với hệ số nhân thấp, mặt khác hạt lan tự nhiên khó nảy mầm chúng khơng chứa nội nhũ Vì khó đáp ứng nhu cầu ngày tăng hoa lan Hiện nhân giống in vitro xem phương pháp hữu hiệu việc nhân nhanh bảo tồn nhiều loài lan quý [46] Hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) loài hoa lan đặc hữu Việt Nam, phân bố chủ yếu khu rừng núi nguyên sinh tỉnh Ninh Thuận Lâm Đồng Cây có chiều cao trung bình, đa thân, sống phụ sinh, thân hành giả, có hoa màu vàng chanh đẹp Hoa nở vào mùa xuân, lâu tàn, thơm mùi ngọc lan tây [5] Trên giới có cơng trình nghiên cứu tái sinh nhân giống in vitro số loài thuộc chi Coelogyne [33, 47, 57, 19] Tuy nhiên, vấn đề nhân giống lan hồng long chưa có tác giả đề cập đến Xuất phát từ sở trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng long ( Coelogyne lawrenceana Rolfe)” Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình nhân nhanh giống lan hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Đề tài thực nội dung sau đây: - Khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất KTST (BA, KIN) đến khả nảy mầm hạt lan điều kiện in vitro; - Khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất KTST (BA, NAA) đến khả phát sinh protocorm; - Khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất KTST (KIN, BA, NAA) đến khả nhân nhanh chồi in vitro từ protocorm; - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả tạo rễ hình thành in vitro hoàn chỉnh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược hoa phong lan tình hình sản xuất hoa lan 1.1.1 Sơ lược hoa phong lan Theo hệ thống phân loại Taktajan cộng (1978), hoa lan thuộc ngành Ngọc lan (hạt kín-Magnoliophyta), lớp Hành (một mầm-Liliopsida), Lan (Orchidales), họ Lan (Orchidaceae) Họ Lan họ lớn thứ hai ngành Ngọc lan, phong phú chủng loại phân bố nhiều vùng địa lý khác Tuy nhiên, họ chủ yếu phân bố từ 68 vĩ độ Bắc đến 56 vĩ độ Nam, trung tâm phân bố vùng nhiệt đới châu Mỹ Đông Nam Á Họ Lan gồm 750 chi với 25.000 loài, loại thân thảo, thân leo sống lâu năm Những lồi sống chủ yếu mơi trường đất, có thân dạng củ, rễ chùm gọi địa lan, sống vách đá gọi thạch lan, sống thân tách khỏi mặt đất gọi phong lan [4, 5, 6] Các loài lan xếp thành hai nhóm: - Nhóm đa thân (polypodial) bao gồm chi Dendrobium, Cymbidium, Cattleya… Cơ thể hệ thống nhiều nhánh, sống lâu năm, phận nằm ngang chúng tạo nên thân rễ Các lồi nhóm thường khơng tăng trưởng liên tục mà có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng - Nhóm đơn thân (monopodial) bao gồm chi Monkara, Vanda, Aerides,… Cây nhóm sinh trưởng chậm, tăng trưởng mạnh theo chiều cao [6] Việt Nam với vị trí địa lý, địa hình đặc trưng kiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hoa lan phong phú đa dạng Mặc khác, lại thêm tiếp nhận ba luồng thực vật di cư vào từ ba hướng: từ phía Nam lên, từ Tây Bắc xuống, từ Tây Tây Nam làm cho hoa lan Việt Nam phong phú, đa dạng thêm nhiều xem nơi tập trung nhiều lan đẹp giới [6, 10] Theo thống kê sơ bộ, nước ta có khoảng 250 loài 1.000 giống lan Đặc biệt vùng Nam Trung Trung Bộ tập trung nhiều loài lan qúy đặc hữu Việt Nam Từ Ninh Thuận, Khánh Hịa lên phía cao ngun Bn Ma Thuột xuất loài lan gần giống vùng Bảo Lộc-Di Linh Thủy tiên, Nhất điểm hồng, Ngọc bích… Tại Thừa Thiên Huế theo nghiên cứu sơ năm 2000 có 131 lồi lan Rừng Việt Nam có nhiều loài lan qúy chưa quản lý khai thác cách hợp lý, điển hình loài lan hài Paphiopedilum delenatii Đây loài lan nhiều nước yêu cầu Việt Nam xuất Năm 1993, phát lồi lan thương nhân Đài Loan mang nước họ gần (khoảng 100.000 cây) làm Việt Nam hàng triệu USD khó tìm thấy lồi [10] 1.1.2 Tình hình sản xuất hoa lan 1.1.2.1 Trên Thế giới Ở nước châu Á, hoa lan biết đến đưa vào nuôi trồng sớm Đến kỷ 20, người Anh đến Singapore mở đầu cho giai đoạn lập trại nuôi trồng hoa lan kỹ nghệ nuôi trồng lan Các giống lan nuôi trồng là: Arachnis, Vanda, Oncidium…, đồng thời lai tạo loài lan Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mơ ngày lớn phục vụ cho xuất Có thể nói Thái Lan nước điển hình cho ngành nuôi trồng xuất hoa lan nước châu Á Trong thập niên cuối kỉ 20, châu Âu, lan trở thành mặt hàng thương mại, từ Anh sang Pháp… sau lan sang Mỹ Trung Quốc nước có tốc độ phát triển lan nhanh Đầu thập kỷ 80, Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan Hồ Điệp Năm 2002 sản lượng lan hồ điệp Trung Quốc triệu cây, bao gồm 50-60 xí nghiệp có quy mơ lớn, Quảng Đơng có 10 cơng ty sản xuất 1,2 triệu (chiếm 40% sản lượng lan hồ điệp Trung Quốc) Hiện nước châu Âu châu Mỹ nước khác giới, hoa lan sản phẩm cao quý Thị trường xuất hoa lan giới ngày mở rộng Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành giới năm 2000 đạt 150 triệu, Nhật Bản nước nhập hoa lan cắt cành số giới, thứ Ý, Pháp…[16] 1.1.2.2 Tại Việt Nam Vấn đề kinh doanh xuất hoa lan Việt Nam giai đoạn đầu Các công ty công ty rau xuất Trung nông – Vegetexco công ty thủ công mỹ nghệ tổng hợp xuất thành phố Hồ Chí Minh (Atex – Saigon) công ty tham gia xuất hoa lan Việt Nam Việc xuất hoa lan Việt Nam thức thực vào năm 1980 công ty Vegetexco xuất lan cắt cành Đà Lạt (Cymbidium) loại hoa khác hoa lay ơn (Gladiolus communis L.), hoa lily [16] Trên thực tế, tình hình sản xuất hoa lan Việt Nam chưa tương xứng với tiềm Qua khảo sát, có số cơng ty lớn có cơng ty nước ngồi trịng phong lan Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50 – 60 ha/ doanh nghiệp Một vài địa phương khác tiến hành trồng phong lan dừng quy mô gia đình, diện tích từ vài m đến vài nghìn m2, cá biệt có vài hộ trồng -2 chưa có vùng quy hoạch trồng lan tập trung ứng dụng công nghệ đại Trong thời gian qua, Viện di truyền Nông nghiệp Việt Nam bước đầu thành công việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ chuyển giao từ Thái Lan Một số địa phương khác Sa Pa, Phú Yên tiến hành khảo sát nghiên cứu phương pháp nhân giống, hồn thiện quy trình sản xuất phong lan, riêng trung tâm giống kỹ thuật trồng Phú Yên tạo khoảng 300.000 – 500.000 phong lan giống [6] Hiệu kinh tế nói chung vườn lan cao loại trồng nông nghiệp khác; vùng đất sản xuất nông nghiệp không hiệu đất bạc màu, chua phèn hay nhiễm mặn lan khơng cần đến đất Đặc biệt Việt Nam có tỉnh duyên hải Bến Tre nơi tập trung trồng dừa vỏ dừa khơ giá thể tốt để lan phát triển Xơ dừa vật liệu rẻ tiền giúp cho việc đầu tư vào sản xuất giảm nhiều so với quốc gia khác Các vật liệu khác lưới che mát, than, tre nứa sản xuất Việt Nam góp phần làm giảm chi phí đầu tư cho người sản xuất Hiện người trồng lan có thu nhập cao gấp nhiều lần so với người trồng lúa, gấp -5 lần so với người trồng rau cải, cỏ cho chăn nuôi Theo số liệu thống kê vụ kế hoạch thuộc Bộ NN &PTNT trồng lan cắt cành Dendrobium Mokara cho doanh thu 500 triệu - tỉ đồng/ha-năm [16] 1.2 Khái quát lan hoàng long 1.2.1 Nguồn gốc phân bố Chi Coelogyne có khoảng 120-190 lồi khác nhau, gồm phân loài 12 giống Các loài chi Coelogyne phân bố vùng rộng lớn từ Ấn Độ qua Đông Nam Á đến Trung Quốc, Việt Nam đảo phía Nam phía Đơng Thái Bình Dương Ở Việt Nam có 29 loài, nhiều loài trồng làm cảnh Các loài chi thân thảo, hầu hết lan phụ sinh sống bám khác rừng Lan hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) loài đặc hữu Việt Nam, có gặp Ninh Thuận (Cà Ná, Phan Rang) Lâm Đồng (Đà Lạt, Lang Biang, Bảo Lộc) Theo sách giáo sư Phạm Hoàng Hộ Trần Hợp gọi hoàng long [4, 5] 1.2.2 Đặc điểm thực vật học - Là loài phong lan trung bình có, thân rễ mập - Hành giả xanh, bóng, cao đến 10cm, rộng - 3cm, có rãnh nơng, gốc có vẩy - Lá chiếc, có phiến dài 20 - 30cm, rộng - 5cm, có - đôi gân bên - Cụm hoa hành giả, cao lá, mang - hoa Hoa to, rộng đến 12cm, có bắc hình mo; hoa có cánh màu vàng chanh, phiến hoa màu ngà vàng; cánh mơi có thùy trắng, thùy bên có sọc nâu trong, có sóng cao gai nạc - Cây mọc phụ sinh (epiphytic plant) gỗ rừng - Ra hoa vào tháng 2, có hoa đẹp, lâu tàn, thơm mùi ngọc lan tây 1.2.3 Giá trị sử dụng - Cây trồng làm cảnh 1.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro lan 1.3.1 Các đường nhân giống in vitro lan 1.3.1.1 Nhân giống từ hạt Đối với nhiều loài lan hiếm, bị đe dọa hay nguy cấp tự nhiên phương thức nhân giống hạt áp dụng để bảo tồn lồi [35] Với cơng nghệ nhân giống in vitro hệ số nhân giống từ trái lan số lớn, từ vài ngàn đến triệu [9] Katiyar cs (1987) nghiên cứu nảy mầm không cộng sinh ống nghiệm hạt giống loài lan Coelogyne punctulata Lindl Aerides multiflorum Hạt giống gieo vào mơi trường Knudson C có bổ sung 100 g/L bột chuối chín điều chỉnh pH = Các môi trường giữ nhiệt độ từ 25 – 27 0C bóng tối hạt giống nảy mầm hình thành PLB chiếu sáng (cường độ 1300lux) 12h/ ngày Đối với lan Coelogyne punctulata sau 90 ngày gieo hạt, hạt giống nảy mầm với tỷ lệ nảy mầm 81,4%, cịn lan Aerides có tỷ lệ nảy mầm 68,8% [53] Sharma nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon khác đến nảy mầm không cộng sinh phát triển hạt giống loài lan Cymbidium elegans Lindl Coelogyne punctulata Lindl Hạt giống lồi gieo vào mơi trường Knudson có hay khơng có bổ sung 2-7 % đường saccharose, D - glucose, maltose, D - fructose, D - mannose, trehalose, raffinose, L - glucose L - mannose Kết nghiên cứu với nguồn cacbon saccharose, D - fructose D - glucose % 3% cho nảy mầm tăng trưởng hạt giống tốt Sự tăng trưởng mức độ trung bình nhận thấy trehalose, maltose, D - mannose raffinose Còn với nguồn cacbon L - glucose L - mannose tỷ lệ nảy mầm tăng trưởng hạt giống thấp Ở mơi trường khơng bổ sung đường tỷ lệ nảy mầm tăng trưởng hạt giống không đáng kể [56] Hạt lan Geodorum densiflorum nảy mầm hình thành cấu trúc hình cầu màu xanh sáng mơi trường MS Phytamax (PM) Mơi trường có 2,0 mg/L NAA 2,0 mg/L BA thích hợp để tăng cường kéo dài chồi, tạo rễ môi trường MS + 3% saccharose + 1,0 mg/L IAA + 0,1% AC [30] Hạt Vanda teres (Roxb.) nảy mầm vịng 40-45 ngày mơi trường VW có 1,0 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA + 2% saccharose + g/L peptone Sự phát sinh chồi tốt từ PLB mơi trường có thêm 10% CW, chồi nhân mơi trường có g/L dịch nghiền chuối 100 mg/L dịch thủy phân casein Chồi đồng loạt tạo rễ cấy chuyển lên môi trường 1/2 MS khơng có chất kích thích sinh trưởng Cây chuyển trồng vườn ươm hoa sau 2-3 năm [55] Hạt lan D tosaense từ thu hái sau 8-14 tuần thụ phấn nuôi cấy mơi trường MS hay 1/2 MS, có 3% saccharose khơng có chất kích thích sinh trưởng Sự nảy mầm hạt lan phụ thuộc vào loại mơi trường mức độ chín hạt Cây nảy mầm từ hạt chuyển lên môi trường MS có 1,5% saccharose, 8% dịch nghiền chuối nước khoai tây CW sau 20 tuần phát triển thành hoàn chỉnh Các phát triển tốt đưa vườn ươm có tỷ lệ sống cao [42] Hạt Cymbidium faberi 50 ngày tuổi bắt đầu tạo thân rễ sau tháng ni cấy mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng Đoạn thân rễ cấy chuyền lần môi trường chứa 1,0 mg/L NAA 40 ngày 90% thân rễ bắt đầu tạo chồi sau 60 ngày mơi trường có 0,5 hay 1,0 mg/L NAA + 2,0 hay 5,0 mg/L BA [26] Nghiên cứu nảy mầm hạt không cộng sinh lan Arachnis labrosa cách nuôi cấy hạt non sau 16-18 tuần thụ phấn cho thấy, hạt nảy mầm tốt môi trường chứa 3% saccharose, 15% CW, 20 µM NAA + 16 µM BA Sau 23-25 ngày nuôi cấy, khoảng 81% hạt nảy mầm môi trường Mitra cs, 66% môi trường MS 55% mơi trường Knudson C PLB phân hóa thành chồi sau 20 ngày nuôi cấy môi trường tái sinh chứa 3% saccharose, 15% CW, bổ sung 10 µM NAA + µM BA Sau 12 tuần trì môi trường tái sinh, tạo rễ chuyển sang trồng chậu tự nhiên [59] Luan cs (2006), tiến hành ni cấy hạt số lồi Dendrobium sp, tỷ lệ nảy mầm cao đạt môi trường ½ MS chứa 0,5 mg/L NAA, 20% CW % saccharose; MS có 20% CW, 0,1 % AC % saccharose ; môi trường Hyponex chứa vitamin, 30% dịch chiết cà chua, 0,1 % AC % saccharose; mơi trường VW có 0,5 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA, 15% CW, % AC % saccharose [43] Thibul cs (2006) nghiên cứu nhân giống Vandopsis gigantea (Lindl.) Kết cho thấy tỷ lệ nảy mầm cao môi trường VW bổ sung CW điều kiện chiếu sáng Ánh sáng không giúp tỷ lệ hạt nảy mầm cao tối mà cảm ứng phát triển PLB Bổ sung CW vào môi trường giúp tỷ lệ nảy mầm cao so với mơi trường khơng có CW Sau 14-16 tuần ni cấy mơi trường có CW, hầu hết PLB hình thành 1-2 nhỏ [60] Mơi trường Knudson C (1951) chứa 0,1 mg/L NAA 15% CW cho hiệu nảy mầm cao phát triển D chrysanthum Wall Tỷ lệ sống đạt 98-99% đưa điều kiện tự nhiên [38] Chitta Temjensang (2006) nghiên cứu nhân giống in vitro lan Malaxis khasiana thông qua việc nuôi cấy hạt giống non Hạt sau thụ phấn – tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2% saccharose, 500mg/L casein hydrolysate 1,0 mg/L BA Sau 107 ngày kể từ ngày ni cấy hạt nảy mầm (chiếm 75%) hình thành PLB Môi trường MS bổ sung μM IAA 18 μM BA KIN gây hình thành chồi nhiều xuất rễ Việc cấy chuyền PLB sang môi trường MS bổ sung g AC thuận lợi cho tăng nhanh PLB, việc bổ sung g AC cảm ứng hình thành chồi tăng lên thân rễ Sau – 10 tuần, đưa chậu trồng nhà lưới Tỷ lệ sống sót sau đưa nhà lưới đạt 65% [28] Hạt lan D strongylanthum Rchb.f cảm ứng tạo PLB mơi trường 1/2 MS có 0,2 mg/L NAA PLB nhân nhanh môi trường 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/L BA Sự phân hóa thành chồi từ thể hình cầu màu xanh ni cấy mơi trường Chồi đạt kích thước 2-2,5 cm sau 30 ngày nuôi cấy Bổ sung dịch nghiền chuối 0,5 mg/L NAA vào môi trường 1/2 MS thúc đẩy tạo rễ sinh trưởng chồi mạnh mẽ [36] Năm 2006, Joseph cs tiến hành nghiên cứu tỉ lệ nảy mầm hạt tái sinh lan Coelogyne mossiae ống nghiệm Hạt giống nảy mầm tốt môi trường Knudson C (95%) thấp mơi trường ½ MS (65%) Trên mơi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/L BA cho kết cảm ứng nhân PLB chồi tốt Sau 12 tháng đạt chiều cao 7cm chúng chuyển sang mơi trường ½ MS bổ sung auxin mơi trường ½ MS để khảo sát khả hình thành rễ Rễ cảm ứng hình thành tốt mơi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/L IBA (90%) Sau đó, chuyển vào chậu chứa hỗn hợp đất vườn, ngói vun gạch vụn với 10 Cytokinin có hiệu tạo chồi với đa số loài với nhiều phận lan Đối với loài phận không chịu ảnh hưởng cytokinin, chúng thay transcinamic acid Bên cạnh chất điều hòa sinh trưởng, người ta sử dụng nhiều dung dịch hữu phức tạp có thành phần khơng xác định nước dừa, dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sinh trưởng phát triển mô cấy Nước dừa thường sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Trong nước dừa có chứa cytokinin, Myo- Inositol hợp chất có hoạt tính auxin có hiệu tốt phát triển mô nuôi cấy Nước dừa thường bổ sung vào môi trường từ 10 -25% để giúp cho q trình kích thích tạo callus protocorm Nước dừa kích thích tế bào hay mầm non chưa trưởng thành sụ phát triển phơi Ngồi ra, nước dừa cịn có khả giảm bớt tiết hợp chất phenol mẫu cấy [21] Ngoài nước dừa, số hợp chất khác pepton, nước cà rốt, nước cà chua, nước nghiền chuối… sử dụng bổ sung vào môi trường ni cấy, chúng có hiệu lần cấy chuyển lần cấy thể tích khơng q 10% mơi trường ni cấy Những tế bào lan nuôi cấy mô tiết lượng lớn phenol gây độc trở lại tế bào Vì mẫu phải chuyển sang mơi trường [24] Than hoạt tính ascorbic acid bổ sung vào mơi trường giúp vượt qua ảnh hưởng ức chế phenol sử dụng thường xuyên môi trường nuôi cấy lan Than hoạt tính khơng phải chất điều tiết sinh trưởng, đóng vai trị chất hút ẩm mơi trường Than hoạt tính có khả hấp thụ số chất khơng có lợi cho phát triển chất sản sinh q trình khử trùng mơi trường ni cấy số chất trồng tiết Bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường có lợi cho việc hình thành rễ than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng ngăn cản q trình hóa nâu mẫu cấy [9] 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chúng tơi lồi lan hồng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe), thuộc: bộ: Lan (Orchidales) họ: Lan (Orchidaceae) Nguyên liệu nghiên cứu hạt lan tháng tuổi thu nhận từ tự nhiên a b Hình 2.1 (a): Cây hoàng long tự nhiên; (b): Quả lan hoàng long sau tháng tuổi 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Thực vật, khoa Sinh – Môi trường, Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Sơ đồ thí nghiệm Quả lan ngồi tự nhiên Nuôi cấy hạt lan in vitro Nhân protocorm Nhân chồi in vitro Tạo rễ in vitro – hình thành hồn chỉnh 23 2.2.1 Vơ trùng mẫu ni cấy Quả lan ngâm nước xà phịng lỗng 15-20 phút rửa kỹ vòi nước chảy Sau khử trùng sơ cồn 70 phút, tiếp đến khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% 10 phút [46] cuối rửa lại nước cất vô trùng từ 3-5 lần trước tách lấy hạt lan 2.2.2 Nuôi cấy hạt lan in vitro Quả lan sau khử trùng, dùng dao cắt dọc theo chiều dài quả, tách lấy hạt cấy lên mơi trường MS có 3% saccharose, 0,8 % agar, 15% nước dừa, bổ sung KIN (0,5-2,0 mg/L) BA (0,5-2,0 mg/L) để khảo sát khả nảy mầm hạt 2.2.3 Nhân protocorm Protocorm hình thành từ hạt sau thời gian 38 ngày cấy lên mơi trường MS có bổ sung NAA (0,5-1,0 mg/L) phối hợp với BA (0,5-2,0 mg/L) để khảo sát khả nhân protocorm lan hoàng long Đánh giá khả nhân protocorm thông qua tiêu: tỷ lệ phản ứng, tỷ lệ nhân protocorm 2.2.4 Nhân nhanh chồi in vitro Protocorm sau giai đoạn nhân nhanh cấy lên mơi trường MS có bổ sung KIN (0,5-2,5 mg/L) phối hợp với NAA (0,5 mg/L), BA (2,0 mg/L) NAA (0,11,0 mg/L) để khảo sát khả nhân nhanh chồi in vitro lan hoàng long Đánh giá khả nhân chồi in vitro thông qua tiêu: số chồi/protocorm, chiều cao chồi, số lá/chồi 2.2.5 Tạo rễ in vitro - hình thành hồn chỉnh Các chồi in vitro tháng tuổi, có chiều cao 1,0-1,2 cm (chiều cao thân giả) nuôi cấy mơi trường ½ MS có bổ sung 15% nước dừa IBA (0,1-1,0 mg/L) để khảo sát khả tạo rễ in vitro Đánh giá khả tạo rễ in vitro thông qua tiêu: tỷ lệ rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ 24 Tất môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH = 5,8 trước khử trùng nồi hấp vô trùng 121 oC 20 phút Mẫu sau cấy nuôi điều kiện nhiệt độ 25±2 oC, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày 2.2.6 Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm bố trí lặp lại lần Số liệu thực nghiệm xử lí thống kê theo phương pháp Ducan’s test (p