BÁO CÁO " NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT VÀ NHÂN NHANH IN VITRO CÂY LAN HOÀNG LONG (COELOGYNE LAWRENCEANA ROLFE) " docx

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT VÀ NHÂN NHANH IN VITRO CÂY LAN HOÀNG LONG (COELOGYNE LAWRENCEANA ROLFE) STUDY ON THE IN VITRO SEED GERMINATION ABILITY AND RAPID PROPAGATION OF COELOGYNE LAWRENCEANA ROLFE SVTH: Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Hương Giang 2 , Lê Thị Thoa 3 1 Lớp 08SS, 2,3 Lớp 09SS, Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng. GVHD: Th.S Võ Châu Tuấn, KS. Trần Quang Dần. Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng. TÓM TẮT Hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) là một loài lan rừng đa thân có giá trị với hoa lớn (3 -5 cm), đẹp và có hương thơm. Trong bài báo này, ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nảy mầm hạt và nhân nhanh in vitro cây lan Hoàng long đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt nảy mầm tốt nhất trên môi trường cơ bản MS (Murashige– Skoog,1962) bổ sung 15% (v/v) CW (nước dừa) + 2,0 mg/L BA (N 6 -benzyladenin) sau thời gian 38 ngày nuôi cấy. Khả năng nhân nhanh chồi từ protocorm tốt nhất (15,20 chồi/protocorm, chiều cao chồi 0,91 cm) trên môi trường MS bổ sung 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L NAA (1-Naphthylacetic acid) + 2,0 mg/L BA sau 8 tuần. Trên môi trường cơ bản ½ MS bổ sung 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L IBA (Indole – 3 butyric acid), các chồi in vitro tạo rễ tốt nhất (3,0 rễ/chồi) sau 8 tuần. ABSTRACT Coelogyne lawrenceana Rolfe is valuable dipodial forest orchid species with large (3-5 cm), beautiful and fragrant flowers. In this present, the effects of different plant growth regulators on in vitro seed germination and rapid propagation of Coelogyne lawrenceana Rolfe were studied. The result show that seed germination was the best on basal MS (Murashige – Skoog,1962) medium supplemented with 15% (v/v) CW (coconut water) + 2,0 mg/L BA (N 6 -benzyladenin) after culture in 38 days. After 8 weeks, capability of in vitro shoot multiplication was the highest (15,20 shoots/protocorm, 0,91 cm in shoot length each) on MS supplemented with 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L NAA (1-Naphthylacetic acid) + 2,0 mg/L BA. The highest frequency of roots (3,0 roots/shoot) was observed in the ½ MS medium fortified with 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L IBA (Indole – 3 butyric acid) after 8 weeks. 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang ngày càng gia tăng. Hoa tươi đã trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trên thị trường hàng hóa nông nghiệp; trong đó hoa lan là một trong những loài hoa được nhiều người ưa chuộng và rất phổ biến hiện nay [2]. Tuy nhiên số lượng nhiều loài lan trong tự nhiên đang có xu hướng giảm đi bởi ảnh hưởng bất lợi của điều kiện môi trường và nạn khai thác quá mức. Trong tự nhiên cây lan nhân giống chủ yếu bằng hình thức sinh sản vô tính (nhân chồi) với hệ số nhân rất thấp. Mặt khác hạt lan trong tự nhiên rất khó nảy mầm do chúng không chứa nội nhũ. Vì vậy khó đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về hoa lan. Hiện nay nhân giống in vitro được xem là Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 2 phương pháp hữu hiệu nhất trong việc nhân nhanh và bảo tồn nhiều loài lan quý hiếm [5]. Hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) là một loài hoa lan đặc hữu của Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các khu rừng núi nguyên sinh tại tỉnh Ninh Thuận và Lâm Đồng. Cây có chiều cao trung bình, đa thân, sống phụ sinh, thân hành giả, và có hoa màu vàng chanh rất đẹp. Hoa nở vào mùa xuân, lâu tàn, thơm mùi Ngọc lan tây [1]. Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu tái sinh và nhân giống in vitro một số loài thuộc chi Coelogyne [4, 6, 8, 3]. Tuy nhiên, vấn đề nhân giống cây lan Hoàng long vẫn chưa có tác giả nào đề cập đến. Trong báo cáo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt và nhân nhanh chồi in vitro cây lan Hoàng long bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu Chúng tôi sử dụng hạt lan của quả lan 4 tháng tuổi thu được từ cây Hoàng long từ tự nhiên. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Vô trùng mẫu nuôi cấy Quả lan được ngâm trong nước xà phòng loãng 15-20 phút và rửa kỹ dưới vòi nước chảy. Sau đó khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 0 trong 2 phút, tiếp đến khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% trong 10 phút [5]. Cuối cùng, quả được rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng trước khi tách lấy hạt lan. 2.2.2. Nuôi cấy hạt lan in vitro Quả lan sau khi khử trùng, dùng dao cắt dọc theo chiều dài của quả, tách lấy hạt và cấy lên môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8 % agar, 15% nước dừa, bổ sung KIN (0,5-2,0 mg/L) và BA (0,5-2,0 mg/L) để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt. 2.2.3. Nhân chồi in vitro Protocorm hình thành từ hạt sau thời gian 38 ngày được cấy lên môi trường MS có bổ sung KIN (0,5-2,5 mg/L) hoặc phối hợp với NAA (0,5 mg/L), BA (2,0 mg/L) và NAA (0,1-1,0 mg/L) để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi in vitro của cây lan Hoàng long. 2.2.4. Tạo rễ - hình thành cây in vitro Các chồi in vitro 2 tháng tuổi, có chiều cao 1,0-1,2 cm (chiều cao thân giả) được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 15% nước dừa và IBA (0,1-1,0 mg/L) để khảo sát khả năng tạo rễ in vitro. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng trong nồi hấp vô trùng ở 121 o C trong 15 phút. Mẫu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25±2 o C, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ ngày. 2.2.5. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lí thống kê theo phương pháp Ducan’s test (p<0,05) bằng phần mềm SAS (ver.9.1). Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 3 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Khả năng nảy mầm in vitro của hạt lan Hạt lan không có nội nhũ vì vậy tỉ lệ nảy mầm của hạt lan trong tự nhiên rất thấp. Các chất KTST thuộc nhóm cytokin có ảnh hưởng tích cực đến khả năng nảy mầm in vitro của hạt lan [5]. Dựa trên kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro trên một vài đối tượng thuộc chi Coelogyne [4, 8], chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng nảy mầm của hạt lan Hoàng long trên các môi trường MS có bổ sung KIN, BA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của BA và KIN đến khả năng nảy mầm của hạt lan Hoàng long Chất KTST Khả năng nảy mầm của hạt BA KIN Thời gian nảy mầm (ngày) Phát sinh protocorm Phát sinh chồi - - 38 +++ + 0,5 - 42 ++ - 1,0 - 43 ++ + 1,5 - 40 ++ + 2,0 - 38 ++++ ++ - 0,5 41 + +++ - 1,0 38 ++ +++ - 1,5 43 ++ ++ - 2,0 43 + +++ Chú thích: - : không nảy mầm; +: kém; ++: trung bình; +++: khá; ++++: tốt. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, môi trường MS có bổ sung BA (0,5-2,0 mg/L) có ảnh hưởng tốt đến khả năng nảy mầm của hạt và tốt nhất trên môi trường MS + BA (2,0 mg/L) với thời gian nảy mầm là 38 ngày. Hạt trương phồng lên, sau đó chuyển từ trạng thái vàng nhạt sang vàng nâu, rồi hóa xanh và tạo thành các thể protocorm có đường kính khoảng 1mm (Hình 1b). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất KTST lên sự nảy mầm của một số loài lan khác như Coe mossia Rolfe (Joseph và cs 2006); Coe stricta Schltr. (Basker và cs 2006) và Coe suaveolens Hook (Sumkumlong và cs 2008). Hình 1: (a) Quả lan sau 4 tháng thụ phấn; (b): Hạt nảy mầm trên môi trường MS + BA (2,0 mg/L); (c): Chồi mới phát sinh trên môi trường MS + 15% CW + NAA( 0,3 mg/L) + BA (2,0 mg/L),(d): Rễ hình thành trên môi trường ½ MS + 15%CW + IBA (0,3 mg/L). Trên các môi trường MS có bổ sung KIN cho thấy, khả năng nảy mầm của hạt ở mức trung bình, các protocorm có xu hướng sớm phát sinh chồi. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 4 3.2. Nhân chồi in vitro Nhân nhanh chồi từ các thể protocorm có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc nhân nhanh giống in vitro và phát triển cây hoàn chỉnh. Các protocorm hình thành từ hạt có khả năng tiếp tục phân hóa thành chồi với số lượng và chất lượng tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy [5]. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất KTST khác nhau lên khả năng nhân chồi cây lan Hoàng long với kết quả thu được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của KIN, BA, NAA đến khả nhân chồi in vitro lan Hoàng long sau 8 tuần nuôi cấy. Chất KTST Khả năng tái sinh chồi NAA BA KIN Số chồi/ protocorm Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi - - - 2,40 gf 0,49 ed 2.86 bcde - - 0,5 3,90 cdef 0,75 b 2,63 def - - 1,0 7,10 b 0,73 b 3,10 abc - - 1,5 2,60 efg 0,35 gf 1,86 g - - 2,0 2,30 gf 0,34 g 1,90 g - - 2,5 1,90 g 0,38 gf 1,93 g 0,5 - 0,5 4,00 cdef 0,56 cd 2,90 abcd 0,5 - 1,0 5,20 cd 0,63 c 2,86 bcde 0,5 - 1,5 3,70 cdefg 0,66 cb 3,16 ab 0,5 - 2,0 7,00 b 0,56 cd 2,90 abcd 0,5 - 2,5 3,50 cdefg 0,63 c 2,60 def 0,1 2,0 - 4,50 cde 0,44 ef 2,46 ef 0,3 2,0 - 15,20 a 0,91 a 3,30 a 0,5 2,0 - 5,30 c 0,57 cd 2,73 cde 0,7 2,0 - 3,40 cdefg 0,45 ef 2,46 ef 1,0 2,0 - 3,30 defg 0,44 ef 2,23 fg Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05. Kết quả ở bảng 2 nhận thấy, trên các môi trường MS có bổ sung KIN (0,5-2,0 mg/L), BA (2,0 mg/L) + NAA (0,1-1,0 mg/L) và NAA (0,5 mg/L) + KIN (0,5-2,5 mg/L) đều có ảnh hưởng tốt đến quá trình nhân chồi in vitro. Đặc biệt trên các môi trường MS + BA (2,0 mg/L) + NAA (0,1-1,0 mg/L), protocorm cho hệ số nhân chồi từ 3,30-15,20 (chồi/protocorm), trong đó môi trường MS + BA (2,0 mg/L) + NAA (0,3 mg/L) là tốt nhất (15,20 chồi/protocorm, chồi cao 0,91 cm và 3,30 lá/chồi) (Hình 1c). Nghiên cứu khả năng nhân chồi từ đoạn thân giả cây Coe stricta Schltr. in vitro, Basker và cs (2006) nhận thấy môi trường MS bổ sung NAA (1,0 mg/L) + BA (2,0 mg/L) cho kết quả nhân chồi tốt nhất. Ngoài ra, một số công trình nghiên cứu trên các đối tượng cây lan khác cũng cho kết quả tương tự với chúng tôi [4,8]. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 5 3.3. Tạo rễ - hình thành cây in vitro Chồi thu được từ môi trường nhân nhanh chồi, nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung IBA (0,1-1,0 mg/L) để khảo sát khả năng hình thành rễ in vitro nhằm mục đích tạo cây con in vitro hoàn chỉnh. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng phát triển rễ lan Hoàng long sau 8 tuần nuôi cấy Chất KTST Khả năng tạo rễ in vitro IBA Tỷ lệ cây ra rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ - 33,33 1,71 bc 0,75 bc 0,1 40,00 1,71 bc 0,85 bc 0,3 86.67 3,00 a 1,55 a 0,5 40,00 2,00 b 0,85 bc 0,7 36,67 2,00 b 1,14 b 1,0 26,67 1,14 c 0,60 c Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 Kết quả cho thấy, môi trường có bổ sung IBA đã thúc đẩy quá trình hình thành và phát triển rễ từ chồi in vitro; tỷ lệ chồi ra rễ đạt từ 26,67-86,67%) so với môi trường không bổ sung IBA. Tuy nhiên ở các mức nồng độ khác nhau thì khả năng cảm ứng tạo rễ in vitro cũng khác nhau. Đặc biệt, ở môi trường bổ sung IBA (0,3 mg/L) tỷ lệ và khả năng hình thành rễ là tốt nhất đạt 3,00 rễ/chồi (Hình 1d.). Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5-1,0 mg/L thì khả năng hình thành rễ và tỷ lệ chồi ra rễ giảm dần. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với nghiên cứu của Joseph và cs (2006) trên cây lan Coe mosia Rolfe. 4. Kết luận 1. Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8 % agar, 15% nước dừa bổ sung BA (2,0 mg/L) thích hợp cho sự nảy mầm của hạt lan Hoàng long sau 38 ngày nuôi cấy. 2. Môi trường cơ bản MS có 3% saccharose, 0,8 % agar, 15% nước dừa bổ sung NAA (0,3 mg/L) và BA (2,0 mg/L) thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro từ protocorm. Số chồi hình thành đạt 15,20 chồi/protocorm sau 8 tuần nuôi cấy. 3. Môi trường cơ bản ½ MS có 3% saccharose, 0,8 % agar, 15% nước dừa bổ sung IBA (0,3 mg/L) thích hợp cho tạo rễ in vitro, đạt 3,00 rễ/chồi sau 8 tuần nuôi cấy. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Nông nghiệp. [2] Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008), Giáo trình hoa lan, NXB Nông Nghiệp. [3] Basker. S, V. Narmatha (2006), “Micropropagation of Coelogyne stricta Schltr. via pseudobulb segment cultures”, Tropical and Subtropical Agroecosystems, 46, pp. 31 – 35. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 6 [4] Joseph S., John S.B., Philip J.R., Vinoth D.K, Senthil S.K. (2006), “In vitro seed germination and plantlet regeneration of Coelogyne mossiae Rolfe”, Journal of Biological Research, 5, pp. 79 – 84. [5] Mitra G. C. (1986), “In vitro culture of orchid seeds for obtaining seedlings. In: Vij SP, ed. Biology, conservation and culture of orchids”, Affiliated East-West Press Private Ltd., New Delhi: 401. [6] Mohanraj. R, Ananthan. R, Bai .V.N. (2009),”Production and Storage of Synthetic seeds in Coelogyne breviscapa Lindl.”, Asian Journal of Biotechnology, 1, pp. 124- 128. [7] Murashige T., Skoog F., (1962),” A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture”. Physiologia plantarum, 15, pp. 473-497. [8] Sungkumlong, Chitta R.D. (2008), “Effects of different factors on immature embryo culture, PLBs differentiation and rapid mass multiplication of Coelogyne suaveolens (Lindl.) Hook”, Indian Journal of Experimental Biology, 46, pp. 243 – 248. . hưởng của BA và KIN đến khả năng nảy mầm của hạt lan Hoàng long Chất KTST Khả năng nảy mầm của hạt BA KIN Thời gian nảy mầm (ngày) Phát sinh protocorm. hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nảy mầm hạt và nhân nhanh in vitro cây lan Hoàng long đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho