Nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật nhân (eurycoma longifolia jack)

Công nghệ sinh học là công cụ quan trọng trong nhân giống và cải thiện di truyền của cây dược liệu bằng cách áp dụng kỹ thuật chẳng hạn như tái sinh in vitro và biến đổi di truyền, nó c

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

- -

PHẠM THỊ XUÂN DIỆU

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA

LONGIFOLIA JACK)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng Cây dược liệu là nguồn cung cấp thuốc chữa bệnh quan trọng nhất cho phần lớn dân số trên thế giới [34] Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân vẫn dựa chủ yếu vào các phương pháp chữa bệnh truyền thống bằng các cây thảo dược [34] Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức; các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người [11]

Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là một trong số các loài cây dược

liệu được biết đến nhiều ở Đông Nam Á do đặc tính tăng cường sức khoẻ tình dục

và có hiệu quả như gây độc tế bào, chống sốt rét, chống lở loét, chống thúc đẩy các khối u và là tác nhân chống ký sinh trùng [21] Tại Việt Nam, nó được gọi là “cây

bá bệnh” hay “cây mật nhân” có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, một số rừng

ở Tây nguyên Bộ phận dùng là rễ, vỏ thân và quả được dùng để làm thuốc Tuy nhiên, đây là loài cây rất khó trồng, những hạt giống có tỷ lệ nảy mầm thấp và cần phải có thời gian dài để nảy mầm do phôi còn ở trạng thái còn non tại thời điểm phát tán Mặc khác loài cây này đang biến mất dần dần do sự khai thác bừa bãi rễ cây làm nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc Vì vậy, loài cây này cần phải được nhanh chóng nhân lên hàng loạt trên quy mô thương mại để đáp ứng với nhu cầu của ngành công nghiệp dược phẩm [21]

Công nghệ sinh học là công cụ quan trọng trong nhân giống và cải thiện di

truyền của cây dược liệu bằng cách áp dụng kỹ thuật chẳng hạn như tái sinh in vitro

và biến đổi di truyền, nó cũng có thể được khai thác để sản xuất các chất trao đổi thứ cấp nhờ sử dụng thực vật như một lò phản ứng sinh học [34] Việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật được xem

là phương án có triển vọng nhất để nhân nhanh, bảo tồn và phát triển nhiều nguồn gen cây thuốc quý hiếm

Hiện nay, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về nuôi cấy in

vitro trên cùng đối tượng cây mật nhân [16, 21] Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nhân

giống loài cây này bằng kỹ thuật in vitro hầu như chưa có công trình nào công bố

Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống in

vitro cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định môi trường thích hợp để tái sinh cây con in vitro hoàn chỉnh từ hạt

cây mật nhân làm cơ sở cho việc nhân nhanh giống loài cây thuốc quý này

3 Nội dung nghiên cứu

(5,25%) đối với hạt mật nhân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân giống in vitro ở thực vật

Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử dụng đặc

biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy [7]

Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý, hiếm nhằm tạo vật liệu cho công tác tạo giống

- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa, cây cảnh, cây ăn quả không trồng bằng hạt

- Nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại rau, cây cảnh và cây trồng khác

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của cây lấy gỗ, cây làm thuốc, cây

ăn quả, rau xanh

- Nhân nhanh trong điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch bệnh virus

- Bảo quản các tập đoàn giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen

1.1.1 Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro

 Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các bước tiếp theo Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống

 Giai đoạn cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy Khi đã

có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều

H2O2, để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất

kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhưng theo Blatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác (Blat K M và Hwanok Ma, 2004) Vì vậy, người ta thường lấy

chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trường [5] Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ

mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần

 Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các

phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động

từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều

cường độ chiếu sáng 1000 lux Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây

 Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine

để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây Người ta thường dùng các chất NAA (Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở nồng độ 1mg/L - 5mg/L để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang môi trường Auxin để rễ phát triển

Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng

 Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con in vitro ra nhà kính rồi ra ngoài trời

Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn nhất định về

chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải

đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh Phải giữ ẩm cho cây mới đưa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50% để cây con không mất nước và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh Sau 2-3 ngày đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh trưởng ổn định, chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt

Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể được chia thành các giai đoạn

như trên nhưng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự kế thừa của giai đoạn trước Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị môi trường là đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hưởng xuyên suốt và quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nhân giống

1.1.2 Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được

xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng

trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Cho đến nay, đã có

nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nuôi cấy mô là rất

quan trọng Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau Vì vậy, vấn

đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể

+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp

để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991) Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp

mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài

ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Người ta thường sử dụng

2 loại đường đó là saccarose và glucose

+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển

pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất

 Các chất kích thích sinh trưởng

Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid Chúng là yếu

tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật

Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành callus, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [14]

+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ callus và cơ quan Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành

rẻ Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các

-6- 10-4 [3]

 Điều kiện nuôi cấy

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày

Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của callus trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974)

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của callus Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên

cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200 C/150C hoặc 200C/180C

tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt độ cao lại kích thích ra nhiều tế bào không có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban

1.1.3 Các nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu

 Trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80

của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in

vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản

nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [2]

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và

đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [2]

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác

nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu… Gần đây, việc ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học trong nhân

giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc quý đang được quan tâm và đã đạt

một số thành tựu, chẳng hạn như:

G Rout và cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh cây Lài tàu (Nyctanthes

arbortristis) - họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) từ chồi nách Tỷ lệ vi chồi/mẫu cấy lớn

nhất (6,65 chồi/mẫu) ở môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA, 50 mg/L Ads và 0,1 mg/L IAA sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ ra rễ lớn nhất trên môi trường MS bổ sung 0,25 mg/L IBA; 0,1 mg/L IAA và 2% sucrose Khoảng 70% các cây con đã ra rễ sống sót trong nhà kính [31]

Sharma và Neetu (2007) đã áp dụng phương pháp nhân giống vô tính in vitro

để bảo tồn cây Rau đắng (Bacopa monnieri L Penn) là một loài thảo dược thuộc họ

Scrophulariaceae Đây là cây thuốc bỗ não tốt nhất trong các phương thuốc của Ấn

Độ và các phương thuốc truyền thống khác, có tác dụng bổ thần kinh, trị chứng mất ngủ và tình trạng bồn chồn, lo lắng Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MS có

bổ sung 4 mg/L BA và 0,4 mg/L NAA hoặc môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L

BA và 0,5 mg/L NAA là tốt nhất để cấy gây và nhân nhanh chồi in vitro từ chồi

nách Môi trường MS bổ sung 7 mg/L agar và 20 mg/L đường hoặc môi trường MS

bổ sung 8 mg/L agar và 20 mg/L đường là môi trường tái sinh rễ tốt nhất [33]

Nadha và cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh cây dầu dài Ấn Độ (Tylophora

indica) thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) Các tác giả đã nghiên cứu khả năng tái

sinh chồi in vitro từ đoạn mắt thân cây dầu dài Ấn Độ trên môi trường MS bổ sung

nồng độ BA thì số chồi bị suy giảm Sau đó các chồi được cấy trên môi trường MS

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Ấn Độ là Panda MK và cs (2007)

trên cây nghệ (Curcuma longa) thì phần trăm mẫu bật chồi cao nhất đạt 85,8% ở

nồng độ 3 mg/L BA và tỉ lệ chồi/mẫu cao (7,6 chồi/mẫu) [28]

Năm 2008, Khalafalla M M và Daffalla H M đã nhân giống thành công

cây Keo (Acacia Senegal (L.) Wild) thuộc họ Trinh nữ, vỏ chứa tanin dùng để trị

các vết thương, vết loét Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS, có bổ sung 1,0 mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi cao nhất (5,3 chồi /mẫu) và tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 25% ở môi trường có 1,0 mg/L IBA [22]

U Salma và cs (2008) đã nghiên cứu tại Bangladesh về nhân giống cây Ba

gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentien L Benth) có chứa 28 alkaloid khác nhau có tác

dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ… trên tổ hợp BA và NAA Sau thời gian nuôi cấy đã thu được một số chồi/mẫu cao nhất ở tổ hợp 1,5 mg/L BA và 0,2 mg/L

NAA Tỉ lệ mẫu tạo rễ in vitro cao nhất ở ½ MS có bổ sung 1,0 mg/L IAA và 1,0

mg/L IBA [32]

Năm 2009, một nhóm tác giả người Malaysia đã nghiên cứu nhân nhanh cây

Gynura procumbens (Lour.) Merr để chiết xuất hoạt chất sinh học Cây này thường

nhân giống bằng cách giâm cành, nhưng phương pháp này không thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng chúng Kết quả thu được cho thấy môi trường bổ sung 0,5 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA có 18 chồi con/mẫu chồi phát sinh Toàn bộ chồi con tạo rễ sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS không có chất điều hoà sinh trưởng [18]

Theo kết qủa nghiên cứu của Arumon và RoyChowdhury (2009) đã nghiên

cứu nhân giống cây Lô hội (Aloe Vera sp.) Một loài cây có tác dụng trong cả đông

y và tây y, chữa được các bệnh ở trẻ em, táo bón, tăng cường tiêu hoá và có tác dụng sát trùng vết thương, thông tiện, thanh nhiệt, nhức đầu… Sau 5 tuần nuôi cấy cho thấy tỉ lệ bật chồi cao (78,01%) trên ba môi trường có bổ sung 2 mg/L IBA, 0,1 mg/L BA, tổ hợp 0,5 mg/L KIN và 0,2 mg/L NAA [25]

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Hàn Quốc: Sang và cs (2009) đã tái

sinh cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa L.) thuộc họ hoa mõm sói (Scrophulariaceae) có tác dụng lợi tiểu, chữa bệnh đái tháo đường, thiếu máu, suy

nhược cơ thể…trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L TDZ và 0,1 mg/L NAA và 3g/L Gelrite thì tỉ lệ mẫu tái sinh đạt 73% nhằm làm cơ sở nhân nhanh cây Địa hoàng [29]

Năm 2010, Hemant và cs đã tiến hành nhân giống cây Cannabis sativa L Là một loại dược liệu quan trọng bằng phương pháp bọc chồi nách Cannabis sativa L

trong dịch alginate Cây tái sinh tốt nhất trên môi trường cơ bản Murashige và

Skoog bổ sung thidiazuron (TDZ 0,5 micron) và PPM (0.075%) trong điều kiện in

vitro [23]

Nghiên cứu của Chandra và cs (2010) nhân giống cây Cannabis sativa Elite

cho sản xuất Δ9 Tetrahydrocannabinol (THC) bằng sử dụng Công cụ công nghệ sinh học Báo cáo này mô tả vai trò của công nghệ sinh học trong nhân giống loài

Cannabis sativa để sản xuất Δ9 THC bao gồm sàng lọc các kiểu gen năng suất cao,

nhân giống loài cây này bằng cách sử dụng các công cụ công nghệ sinh học, so sánh

giữa cây vi nhân giống với cây ngoài tự nhiên và sinh sản sinh dưỡng thực vật cho mục đích kiểm soát chất lượng [19]

Gần đây các nhà khoa học Ấn Độ đã tiếp cận việc ứng dụng công nghệ sinh học cho nhân giống các loài cây dược liệu quan trọng ở vùng sa mạc Thar

Rajasthan Các loài cây như loài Ceropegia, Caralluma, Calotropis, Leptadenia,

Tylophora, Pueraria, Mucuna, Vitex và Sarcostemma là nguồn nhiên liệu có giá trị,

là thức ăn gia súc, gỗ, thuốc, phân sinh học (Endophytic rizobia) và rau quả để duy

trì cuộc sống ở đây [30]

 Ở Việt Nam:

Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác giả nghiên cứu hoàn thiện như:

Nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper methysticum G Forster) có hoạt

tính sinh học cao [6]

Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống cây Thanh hao

(Artemisia annua L.) trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP

0,3mg/L chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/L và NAA 0,5mg/L cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/L + NAA 0,5mg/L [13]

Năm 2007, Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh nghiên cứu nuôi cấy đỉnh

cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) Chồi đỉnh và đốt thân cây Thông đỏ (1-2 năm tuổi) được sử dụng trong nuôi cấy in vitro Chồi non phát sinh sau 45 ngày

nuôi cấy trên môi trường MS + 5mg/L BA + 1mg/L KIN Chồi non được nuôi cấy phát sinh rễ trên môi trường WPM + 1mg/L NAA + 50mg/L Rhizopon say 75 ngày

ưu thế trong quá trình phát sinh và sinh trưởng của chồi bên [10]

Quách Diễm Phương và cs (2007) công bố công trình nghiên cứu nhân giống

in vitro cây Bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl.) để thu hợp chất quinone Hạt sau

khi khử trùng nuôi cấy trên môi trường ½ MS Cây con sau khi nảy mầm được cắt đốt và nuôi cấy trong ½ MS lỏng lắc Kết quả cho thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, 100% mẫu cấy sống, lá tăng trưởng xanh tốt và tạo nhiều chồi [9]

Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để bảo tồn và nhân nhanh cây dược

liệu điển hình nhất ở Việt Nam là nghiên cứu nhân giống bảo tồn cây Thuỷ tùng

(Glyptostrobus pensilis) của Nguyễn Thành Sum (2007) Thuỷ tùng được xem như

là hoá thạch sống của ngành hạt Trần, là loài cây thuốc nằm trong sách Đỏ Thế giới

Số cá thể này còn lại quá ít, quá trính tái sinh tự nhiên kém (0,02%), hạt lép không ươm được, hoa không thụ phấn Mẫu vật được sử dụng là chồi ngọn và mẫu thân, trong môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L BA mẫu cho khả năng nhân chồi cao Khi cấy mẫu trên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/L IBA sau 8 tuần nuôi cấy suất hiện callus trắng, hơi xốp có hình dạng của rễ [1]

Phạm Thị Bích Ngọc và Phan Ngô Hoang (2008) nghiên cứu sự phát sinh

chồi từ callus cây dây chiều (Tetracera scandens L.) là một nguồn dược liệu quan

trọng, góp phần điều trị một số bệnh như: phù thận, lợi tiểu, gout… Callus được tạo

ra từ lá trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 2,5 mg/L Dvà 0,5 mg/L BA Trước khi cảm ứng tạo chồi, callus được tăng trưởng trên môi

trường MS có bổ sung BA 0,7mg/L và IAA 0,1 mg/L Số chồi phát sinh đạt 26

Năm 2010, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Qua lâu (Trichosanthes kirilowii) là loài dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học

có giá trị như triterpenoid, sterol và đặc biệt là các protein bất hoạt ribosome như karasurin, trichosanthin (TCS), Trichosanthes anti-HIV protein (TAP 29) có hoạt tính ức chế khối u và kháng virus (bao gồm cả HIV) Hạt được khử trùng bằng javel trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 1,5 mg/L kinetin Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt không nhiễm có nảy mầm đạt

87,9% Đỉnh sinh trưởng và chồi bên in vitro được cấy lên môi trường nhân nhanh

bổ sung N6-benzyladenine purine (BAP), kinetin, naphthaleneacetic acid (NAA) và

nước dừa (CW) riêng rẽ hay kết hợp Kết quả nhân chồi tốt nhất đạt được khi nuôi cấy chồi bên trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BAP và 20% nước dừa (19,87

chồi/chồi bên) Chồi in vitro tạo rễ trên môi trường ½ MS không bổ sung chất KTST (5,67 rễ/chồi) Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4 tuần nuôi

cấy Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao nhất đạt 77,5% [12]

Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch Mai (2010) nghiên cứu sự phát

sinh hình thái chồi trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.) là cây

dược liệu quý được dùng để chữa nhiều loại bệnh như mất ngủ, đau lưng, huyết áp cao…nhằm phục vụ cho mục đích nhân giống loài cây này trong tương lai Kết quả cho thấy sự phát sinh hình thái chồi ở cây nhàu trải qua 3 giai đoạn Trong quá trình này Zeatin 1mg/L kích thích sự hình thành sơ khởi chồi trong tối (sau 2 tuần) nhanh hơn BA ở cùng nồng độ Khi phối hợp NAA 0,1 mg/L và zeatin 1 mg/L sẽ làm chồi chậm xuất hiện (sau 5 tuần) Kết quả đo hô hấp và hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật cũng được thảo luận để làm rõ những thay đổi sinh lý trong hình thành chồi [4]

1.2 Vài nét về cây mật nhân

có 5 -6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng Tràng hoa 5, cũng có tuyến Bầu

có 5 noãn, hơi dính ở gốc Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm, rộng 0,5 – 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt

1.2.2 Phân bố

Mật nhân là loài cây mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa, dưới tán các cây gỗ lớn Phân bố rộng rãi tại Đông Nam Á ở các nước như Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Philipin và Thái Lan [17]

Tại Việt Nam, mật nhân có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn-Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở Tây nguyên Trong đó có cả ở Quảng Nam như các huyện Phước Sơn, Đông Giang, Tây Giang, Nam Giang

1.2.3 Công dụng

Mật nhân là một cây thuốc quan trọng và tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng cho sản xuất thuốc chữa bệnh (Jiwajinda và cs, 2002; Osman và cs, 2003) Lá được sử dụng để điều trị tiêu chảy, sốt, sưng tuyến, chảy máu, bệnh phù,

ho dai dẳng, tăng huyết áp, giảm đau trong xương và bệnh sốt rét Vỏ nghiền thành bột được sử dụng để điều trị vết thương, u nhọt, lở loét do bệnh giang mai và đau đầu Rễ được nghiền thành bột hoặc dịch chiết từ rễ được sử dụng như thuốc bổ cho phụ nữ để phục hồi sau khi sinh (Bedir và cs, 2003) [17]

Từ rễ, một số hợp chất đã được tìm thấy như các quassinoids, alkaloids, alkaloids b-Carboline, type triterpenes tirucallane, các dẫn xuất của squalene và biphenylneolignans Một số các thành phần này đã được chứng minh là

canthin-6-có khả năng gây độc tế bào, chống sốt rét, chống các khối u, hạ sốt và ức chế hoạt động tăng trưởng thực vật (Ismail và cs, 1999; Jagananth và cs, 2000, Jiwajinda và

cs, 2002; Abd, 2007) Ngoài ra, các chất chiết xuất từ cây này đã được cho là tăng tính cường dương ở nam giới và năng lực tình dục (Gimlette và cs, 1977), nghiên cứu thực hiện bởi Rosli và cs [20]

Ở Việt Nam, cây này được sử dụng để điều trị các bệnh như: Vỏ rễ cây mật nhân có vị rất đắng nên sử dụng làm thuốc tẩy giun sán, trị sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, giải say rượu, giải độc và điều hòa huyết áp Vỏ thân làm thuốc bổ, chữa

ăn uống không tiêu, nôn, đầy, ỉa chảy, gần như vị Hậu phác và còn được dùng giải độc do tích rượu Vỏ cùng với rễ dùng chữa nhức mỏi, đau lưng, đau bụng kinh của phụ nữ Quả dùng chữa lỵ và ỉa chảy Quả chín ăn được Lá dùng nấu nước tắm trị ghẻ, lở ngứa Ngoài ra trong vỏ và rễ cây mật nhân giúp tăng năng lượng hoạt động

và sức bền cơ thể Khả năng tăng cường sinh lý, tăng cường sức khỏe tình dục của mật nhân được ứng dụng trong một số dược thảo

1.2.4 Các nghiên cứu về cây mật nhân

Nghiên cứu của Chan LK và cs (2002) chỉ ra rằng những hạt giống với vỏ quả trong cứng gieo trong hỗn hợp đất và cát theo tỉ lệ 1:1 chỉ bắt đầu nảy mầm sau

43 ngày sau khi gieo và tiếp tục nảy mầm trong khoảng thời gian 99 ngày Hỗn hợp đất và cát (1:1) là tương đương như sự kết hợp đất cát tự nhiên đã được tối ưu cho

sự nảy mầm của hạt mật nhân Tuy nhiên, khi vỏ quả trong của hạt giống bị loại bỏ, các hạt giống nảy mầm trong hai tuần qua nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS Những hạt giống còn xanh được loại bỏ các vỏ quả trong dường như nảy mầm nhanh hơn những hạt chín khi được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS Tất cả các

cây con nảy mầm in vitro có cùng một mô hình tăng trưởng về chiều cao cây giống,

số lá và đường kính thân cây không phân biệt so với các phương pháp nảy mầm trong tự nhiên trong khoảng thời gian 120 ngày [16]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chan LK và cs đã đánh giá hiệu quả từ

sinh khối tế bào cây mật nhân và sản xuất các hợp chất alkaloids,

9-hydroxycanthin-6-one và 9-methoxycanthin-9-hydroxycanthin-6-one Đồng thời để xác định công thức phù hợp có thể làm tăng sinh khối tế bào và sản xuất các hợp chất alkaloids thông qua nuôi cấy huyền phù cũng đã được thực hiện [17]

Việc nuôi cấy huyền phù đã được chuẩn bị bằng cách cấy 0,5g FW (trọng lượng tươi) của tế bào thu được từ mẻ đầu tiên của nuôi cấy huyền phù được chuẩn

bị từ nuôi cấy callus trong môi trường lỏng MSB Nồng độ khác nhau của chitosan,

sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid Môi trường MSB trung bình bổ sung với 100mg/L chitosan có ý nghĩa quan trọng trong tăng trọng sinh khối tế bào mặc dù lượng cao 150mg/L chitosan cho sản lượng cao nhất 9-hydroxycanthin-6-one (0,44%) nhưng lại làm giảm sinh khối tế bào Việc bổ sung 2 mg/L và 20 mg/L NaH2PO4 tạo ra sản lượng cao nhất trong sinh khối tế bào và sản xuất alkaloid

polyvinylpyrrolidone cho thấy hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào và không ý nghĩa trong sản xuất alkaloid [17]

Một nghiên cứu khác của Noormi RS (2005) về khả năng tạo callus từ nuôi cấy mô cây mật nhân và sản xuất 9- Methoxycanthin-6-one từ callus của loài cây này Phân tích định tính sử dụng TLC cho thấy rằng 9-methoxycanthin-6-one đã

được tìm thấy trong lá, cuống lá, thân, rễ, sợi rễ, lá mầm và phôi của cây còn nguyên vẹn Phân tích định lượng sử dụng HPLC cho thấy nồng độ cao nhất của 9-methoxycanthin-6-one đã được tìm thấy trong rễ 9-methoxycanthin-6-one cũng có mặt trong các callus có nguồn gốc từ nuôi cấy các mô khác nhau Nồng độ cao nhất được tìm thấy trong callus có nguồn gốc từ sợi rễ (7,12 mg/g DW mô) Từ việc so sánh giữa các dữ liệu của các callus và các bộ phận của cây tự nhiên thì nồng độ 9-methoxycanthin-6-one trong callus cao hơn 73,7% [27]

Khả năng của các callus để sản xuất 9-methoxycanthin-6-one trong các loại môi trường cơ bản khác nhau (Murashige và Skoog, Gamborg, Schenk và Hildebrandt và White) được kiểm tra và xác định Môi trường MS cơ bản cho được hàm lượng cao nhất 9-methoxycanthin-6-one (3,8 mglg DW) Do đó, môi trường

MS được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Những ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, fructose, sorbitol và mannitol [(0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0

và 5.0% (w/v)] đến sản xuất 9-methoxycanthin-6-one được nghiên cứu một cách riêng biệt 2% (w / v) fructose thúc đẩy sản xuất 9-methoxycanthin-6-one (4,59 mglg DW) và đã đạt được năng suất cao nhất so với nguồn carbon khác được thử nghiệm Một loạt các nghiên cứu đã được tiến hành để kiểm tra ảnh hưởng của nồng

độ khác nhau (0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 mg / L 2,4-D, picloram, dicamba, NAA và IAA) trong phát sinh callus và sản xuất 9-methoxycanthin-6-one Việc bổ sung 3,0 mg/L dicamba tăng sản xuất 9-methoxycanthin-6-one Những ảnh hưởng khác nhau của các giá trị pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0) đến sinh trưởng và sản xuất 9-methoxycanthin-6-one trong nuôi cấy callus cây mật nhân cũng đã được quan sát Hàm lượng 9-methoxycanthin 6-one thu được cao nhất ở pH 5,5 là 1,53 mg/g DW) [27]

Hiện nay, ngoài các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào và thu hoạt chất sinh học từ đối tượng này, người ta đang chú trọng nghiên cứu các phương pháp nhân giống nhanh cây mật nhân nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây thuốc quý này

Nghiên cứu của Sobri và cs (2005) cho thấy tỷ lệ tái sinh cao nhất (90%) và nhiều chồi hình thành thu được với môi trường cơ bản MS bổ sung 5,0 mg/l KIN

Rễ hình thành sau 14 ngày ngày nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung

0,5 mg/l IBA Cây con tái sinh từ nuôi cấy mô thực vật có khả năng sống sót tốt và không có sự khác biệt về hình thái học từ các cây mẹ [21]

Nghiên cứu của Maziah và cs (2010) nhằm xác định và tối ưu hóa auxin để kích thích tạo callus từ nuôi cấy các bộ phận lá, cuống lá, thân, rễ, rễ sợi, lá mầm và đoạn phôi của cây mật nhân đã đạt được thành công bằng sử dụng các auxin khác nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram và dicamba Các mô nuôi cấy được quan sát trong một tháng Các kết quả tổng thể từ các thí nghiệm cho thấy 2,4-D là auxin thích hợp nhất [24]

Năm 2011, Monica và cs đã nghiên cứu và phân tích đặc điểm hình thái mô

của hạt giống mật nhân bằng kính hiển vi cho thấy cấu trúc hạt giống của cây thuốc

quan trọng này ở các giai đoạn phát triển khác nhau Các cấu trúc hạt giống mật nhân bao gồm lớp biểu bì, lớp hạ bì, lớp nhu mô dự trữ và lớp tiền tượng tầng Lá mầm phát triển thành một hệ thống mạch phức tạp và chia thành mặt lưới Các giai đoạn phát triển hạt giống và phát triển của hệ thống mạch trong quá trình nảy mầm cung cấp các thông tin thực tế và chính xác về giai đoạn phát triển lá mầm của cây mật nhân [20]

Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào về sản

xuất hợp các chất sinh học cũng như nhân giống in vitro cây mật nhân bằng kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào thực vật

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây mật nhân thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae),

bộ Sapindales Sử dụng hạt đã được thụ phấn 3 tháng tuổi từ cây mật nhân ngoài tự

nhiên (tại huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam) để làm nguyên liệu thực nghiệm

Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Sinh-Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng từ tháng 7 năm 2011 đến tháng 5 năm 2012

Hình 1: (a):Cây mật nhân tự nhiên; (b Hạt mật nhân 3 tháng tuổi

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

2.2.1 Vô trùng mẫu vật nuôi cấy

Quả được ngâm trong nước ấm khoảng 45 phút và tách lấy hạt, sau đó ngâm hạt trong dung dịch xà phòng từ 5-7 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 20

Nảy mầm in vitro của hạt

Tạo chồi in vitro

Hạt cây mật nhân

Tạo rễ in vitro-cây hoàn chỉnh