Tác động kháng khuẩn của huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn porphyromonas gingivalis

1 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mã số: Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nha chu bệnh lý phức tạp, đa yếu tố, đa vi khuẩn đặc trưng phá huỷ thành phần mô nâng đỡ Mảng bám nướu người chứa tới 800 loại vi khuẩn [57] nghiên cứu Porphyromonas gingivalis, vi khuẩn Gram (-) kỵ khí, bệnh nguyên viêm nha chu mạn Vi khuẩn tiết sắc tố đen chứa nhiều yếu tố độc lực gây phá huỷ mô nha chu ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp tới đáp ứng viêm vật chủ [55] Các phương pháp điều trị viêm nha chu gồm phẫu thuật khơng phẫu thuật có mục tiêu loại bỏ mảng bám vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, kể biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn thực chặt chẽ, vi khuẩn xâm nhiễm phát triển mơ phía tổn thương [39] Sự tồn vi khuẩn làm ảnh hưởng trình lành thương tái sinh mơ, ảnh hưởng tới kết điều trị Do đó, làm để kháng khuẩn tốt yếu tố quan trọng cho thành cơng lành thương phịng tránh tình trạng mạn tính Huyết tương giàu tiểu cầu (platelet rich plasma, PRP) phát triển gần biện pháp hỗ trợ lành thương tái sinh mô, ứng dụng nhiều lĩnh vực y khoa chỉnh hình, da liễu, thẩm mỹ, nha khoa phẫu thuật hàm mặt [65] Hạt alpha có tiểu cầu có khả giải phóng số lượng lớn peptide yếu tố tăng trưởng Điều giúp cho PRP có ảnh hưởng thúc đẩy q trình sinh học cần thiết cho trình lành thương tái sinh mơ [65] Bên cạnh đó, tác động kháng khuẩn vật liệu báo cáo số cơng trình nghiên cứu vi khuẩn miệng với kết khác [12], [21], [31] Đối với vi khuẩn gây bệnh nha chu, đặc biệt Porphyromonas gingivalis, nghiên cứu tác động PRP lên phát triển vi khuẩn bệnh nguyên cịn giới hạn Ngồi ra, nghiên cứu trước đây, PRP thu thập từ máu người tình nguyện khoẻ mạnh sử dụng chủng vi khuẩn thương mại để nghiên cứu [17], [106] Điều đặt câu hỏi vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy trực tiếp từ mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu, PRP người khoẻ mạnh bệnh nhân viêm nha chu tác động kháng khuẩn in vitro hay không, thực nghiên cứu với mục tiêu: *Mục tiêu chính: Đánh giá tác động kháng khuẩn in vitro PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy từ mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu *Mục tiêu cụ thể: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Xác định độ kháng bám dính vi khuẩn PRP Xác định độ nhạy cảm màng sinh học vi khuẩn Porphyromonas gingivalis với PRP CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thử nghiệm in vitro 2.2 Vật liệu nghiên cứu A Mẫu mảng bám nướu để nuôi cấy vi khuẩn Mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu B Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm: - Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh đồng ý tham gia nghiên cứu - Nhóm bệnh nhân viêm nha chu 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu A Mẫu mảng bám nướu nuôi cấy vi khuẩn Thu thập mảng bám nướu nhóm bệnh nhân viêm nha chu (Nhóm 1) liên tục xuất khuẩn lạc, thoả mãn tiêu chuẩn sau: • Tuổi: 20-65 • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Được chẩn đốn viêm nha chu mạn mức độ trung bình nặng theo tiêu chuẩn phân loại Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 (Bảng 2.1) B Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm thoả mãn tiêu chuẩn sau: - Nhóm (Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh) (4 người) • Tuổi: 20-65 • Khoẻ mạnh, khơng có triệu chứng nhiễm khuẩn, khơng có bệnh tồn thân • Khơng có thói quen hút thuốc • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Tình trạng nha chu khoẻ mạnh, tất độ sâu khe nướu nhỏ 3mm khơng có tượng phù nề hay chảy máu nướu - Nhóm (Nhóm bệnh nhân viêm nha chu) (4 người): • Tuổi: 20-65 • Khơng có thói quen hút thuốc lá, khơng có bệnh tồn thân • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Được chẩn đốn viêm nha chu mạn mức độ trung bình nặng theo tiêu chuẩn phân loại Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 [8] tham gia hai nhóm xét nghiệm công thức máu tổng quát tiến hành thu thập mẫu PRP để đảm bảo công thức máu bình thường khơng có bệnh lý tiểu cầu 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân không hợp tác, khó khăn việc cung cấp thơng tin, giao tiếp - Bệnh nhân có thai 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu phương pháp tiến hành 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Quy trình lấy mẫu nuôi cấy vi khuẩn thực theo phương pháp Doan Nguyen cộng (1999) [37] Chuẩn bị môi trường vận chuyển: 2ml Wilkins chalgren anaerobic broth base (Himedia - M863) vào ống ly tâm eppendorf Lấy mẫu: Cô lập vùng lấy mẫu gòn cuộn, làm mảng bám nướu, sử dụng 2-4 côn giấy cỡ 35-40 đưa vào túi nha chu từ 5mm trở lên, giữ 30 giây chuyển vào ống eppendorf chứa môi trường vận chuyển, đưa ống mẫu vào túi chứa gói tạo mơi trường kỵ khí (AnaeroPack®, Mitsubishi, Nhật Bản) chuyển phịng thí nghiệm cấy mẫu Cấy vi khuẩn từ mẫu: - Vi sinh vật tách học khỏi côn giấy với máy trộn Vortex mức cao 45 giây Phần huyền phù vi khuẩn pha loãng bậc 10 dung dịch vận chuyển - Sử dụng que trải tiệt trùng cấy dung dịch pha lỗng vào đĩa petri chứa mơi trường Wilkins Chalgren anaerobic agar có bổ sung 5% máu cừu (mơi trường nuôi cấy) - Ủ đĩa petri túi kỵ khí bình GasPak 37ºC từ 7-10 ngày Sau ủ, khuẩn lạc có kiểu hình đặc trưng làm cấy chuyền, định danh phương pháp MALDI-TOF, thực trung tâm Oucru, Bệnh viện nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Sau có kết vi khuẩn cần tìm, gửi mẫu khuẩn lạc dung dịch Tris-EDTA giải trình tự với đoạn mồi đặc hiệu - Lưu trữ vi khuẩn môi trường nuôi cấy glycerol 25% điều kiện âm sâu (nitơ lỏng) 2.3.1.2 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu Quy trình thu thập PRP thực theo bước hướng dẫn nhà sản xuất Bước 1: Lấy ba ống máu, ống 8,5ml Hút 100μl để đếm tiểu cầu Bước 2: Đặt ba ống máu vào máy ly tâm Ly tâm mẫu chế độ 2000 vòng/phút 10 phút Đặt thêm ống nước 8,5ml để cân Bước 3: Thu tiểu cầu Lấy nhẹ nhàng ba ống máu khỏi máy ly tâm Dùng pipette hút nhẹ nhàng dịch màu vàng bên lớp hồng cầu cho vào ống khác Bước 4: Làm giàu tiểu cầu Ly tâm ống chứa dịch vàng chế độ 3500 vòng/phút vòng phút Sau hút nhẹ nhàng dịch màu vàng huyết tương nghèo tiểu cầu phía ống khác, vừa hút vừa huyền phù đều, chừa lại khoảng 5ml đáy ống Đếm số tiểu cầu cách hút khoảng 100μl PRP, pha loãng với dung dịch amoni oxalat cho vào buồng đếm hồng cầu Bước 5: Hoạt hoá tiểu cầu ống chứa chất hoạt hố Ép khối đơng đặc huyền phù Sử dụng xi lanh hút dịch PRP, gắn màng lọc ép dịch PRP qua màng lọc vào ống PRP thành phẩm Thu 4-5ml dịch PRP vô trùng Bước 6: Dán nhãn phân nhóm mẫu PRP hai nhóm người tham gia khoẻ mạnh bệnh nhân viêm nha chu 2.3.1.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu Quy trình thực cho mẫu PRP: - Pha loãng dãy nhị phân chế phẩm PRP (180μl/giếng) với 0,9% saline bổ sung đĩa 96 giếng - Chlorhexidine gluconate 0,12% sử dụng chứng dương môi trường nuôi cấy không bổ sung huyết tương chứng âm - Với giếng, 20μl dung dịch huyền phù vi khuẩn pha lỗng thêm vào Sau ủ kỵ khí nhiệt độ 37ºC 24 giờ, thêm vào giếng 20μl dung dịch resazurin đánh giá đổi màu dung dịch giếng Giá trị MIC nồng độ thấp dãy nồng độ thử nghiệm không làm đổi màu xanh resazurin Sử dụng resazurin đơn giản, cho kết nhanh chóng dễ dàng quan sát - Mỗi nghiệm thức thực giếng lặp lại lần với kết tương đồng 2.3.1.4 Thí nghiệm vi khuẩn bám vào đĩa ni cấy Quy trình thực cho mẫu PRP - Vi khuẩn phát triển qua đêm mơi trường ni cấy kỵ khí Tổng thể tích 150μl huyết tương dung dịch vi khuẩn cho vào giếng đĩa 96 giếng vô trùng xử lý bề mặt sẵn nhà sản xuất - Các giếng đối chứng chứa môi trường nuôi vi khuẩn tiến hành song song - Các đĩa ủ kỵ khí 24 nhiệt độ 37ºC Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa dung dịch saline đệm phosphate (PBS) pH 7,2 Các vi khuẩn bám vào giếng cố định với methanol 15 phút thổi khơ Sau nhuộm giếng dung dịch tím kết tinh 0,1% phút Rửa nước cất Đĩa để khô bổ sung 100μl ethanol 95% vào giếng - Độ hấp thụ giếng sau đo máy đọc phiến quang phổ bước sóng 595nm - Mỗi nghiệm thức thực giếng thí nghiệm lặp lại lần với kết tương đồng 2.4 Xử lý, phân tích số liệu Kết ni cấy trình bày dạng hình ảnh Kết thí nghiệm trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± ĐLC) Sử dụng kiểm định phi tham số Wilcoxon để so sánh khác biệt nhóm Giá trị p0,05 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh KIẾN NGHỊ - Tính kháng khuẩn PRP cần nghiên cứu cỡ mẫu lớn vi khuẩn bệnh nguyên nha chu khác Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum - Thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học kháng bám dính cần thực mơ hình hydroxy-apatit phủ nước bọt vi khuẩn bám dính tiên phong để mô bề mặt lâm sàng 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Ngày tháng năm 20 Trưởng đơn vị/khoa (Ký tên ghi rõ họ tên) Ngày 11 tháng 10 năm 2018 Chủ nhiệm đề tài (ký tên ghi rõ họ tên) Phạm Anh Vũ Thụy Ngày……tháng……năm 20… Cơ quan chủ trì (ký tên đóng dấu) ... NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mã số: Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi? ?m nha chu... tác động kháng khuẩn in vitro PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy từ mảng bám nướu bệnh nhân vi? ?m nha chu *Mục tiêu cụ thể: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu PRP lên vi khuẩn Porphyromonas. .. giúp tác giả khẳng định tác động đồng vận protein kháng khuẩn tiểu cầu với kháng sinh nafcillin, ampicillin vancomycin Tác động tượng cho thấy khả giảm bám dính vi khuẩn vào tiểu cầu, nhạy cảm vi