Nghiên cứu in vitro tác động của huyết tương giàu tiểu cầu (prp) lên mô nha chu

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu in vitro tác động huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) lên mô nha chu Mã số: 2016.3.1.345 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu in vitro tác động huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) lên mô nha chu Mã số: 2016.3.1.345 Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 MỞ ĐẦU Viêm nha chu bệnh lý gây bám dính mơ liên kết, tiến triển đến xương dây chằng nha chu, làm di lệch, lung lay sau khơng điều trị thích hợp Ngày nay, bệnh phổ biến chiếm tỷ lệ cao đặc biệt nước phát triển Hầu hết liệu pháp điều trị nha chu hướng tới việc làm giảm độ sâu túi nha chu, trì cải thiện mức độ bám dính lâm sàng Trong thập kỷ qua, mục tiêu điều trị nha chu chuyển từ “lành hóa” sang “tái tạo” mơ nha chu, đảo ngược q trình hư hại mơ nha chu bệnh gây Áp dụng kỹ thuật tái tạo mô có hướng dẫn (Guided Tissue Regeneration – GTR), phương pháp sử dụng màng tự tiêu màng sinh học để tái tạo khiếm khuyết nha chu tạo nên cách mạng, phá bỏ quan niệm bệnh nha chu khơng hồn ngun tồn lâu ngành nha chu Gần đây, với tiến sinh học phân tử, việc tái tạo mô nha chu thông qua chất trung gian sinh học, yếu tố tăng trưởng polypeptide (PGFs) quan tâm PGFs có khả điều hịa hoạt động sinh học bao gồm bám dính, di cư, tăng sinh biệt hóa tế bào xương mô liên kết Sử dụng huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) liệu pháp tự thân với lượng tiểu cầu tập trung nhiều mức bình thường khoảng 3-4 lần, mở hướng khả quan tái tạo mô nha chu bị khuyết hổng (1,2) Tiểu cầu nguồn phong phú yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGF-β), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (bFGF) interleukin (3) Tiểu cầu giải phóng nhiều protein có hoạt tính sinh học có khả thu hút đại thực bào, tế bào gốc trung mơ có ngun bào sợi, ngun bào xương Do vậy, khơng thúc đẩy việc loại bỏ mơ bị thối hóa hoại tử, mà cịn kích thích tái tạo mơ lành hóa Một nguyên nhân mà PRP sử dụng rộng rãi thời gian qua có tính an toàn nguồn thay tự nhiên để phẫu thuật PRP có vai trị quan trọng việc ứng dụng điều trị đặc biệt thơng qua kích thích tế bào nội sinh nhờ thành phần yếu tố tăng trưởng tự nhiên Chiquet cs (2015) cho nguyên bào sợi tế bào có nguồn gốc trung mơ, chịu trách nhiệm sản xuất hầu hết chất ngoại bào mô liên kết, quan trọng việc sửa chữa lành thương, thông qua tăng sinh, di cư biệt hóa tế bào (4) Nguyên bào sợi mô khác đặc trưng cho biểu gene, đặc điểm tăng trưởng khả vận động… So với nguyên bào sợi da, nguyên bào sợi nướu biểu kiểu hình riêng biệt, tăng khả điều hịa q trình viêm tái tạo chất ngoại bào (5,6) Năm 2004, Seo cộng phân lập thành công tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSC) Những tế bào biệt hóa tạo thành dây chằng nha chu, xương ổ răng, xê măng, thần kinh ngoại biên mạch máu (7) Tại Việt Nam, Trần Lê Bảo Hà cộng phân lập thành công hPhPDLSC vào năm 2014 (7) Nhiều yếu tố chứng minh có vai trị ảnh hưởng đến tính chất hPDLSC bao gồm nguồn gốc mơ, tuổi đối tượng hiến tặng, tình trạng viêm, môi trường nuôi cấy đặc biệt yếu tố tăng trưởng Với mục đích đánh giá tác động PRP nồng độ khác lên mô nha chu in vitro, cụ thể nguyên bào sợi nướu tế bào gốc dây chằng nha chu người, khảo sát đáp ứng sinh học loại tế bào nuôi cấy in vitro phương diện: tăng sinh di cư tế bào PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cấy chuyền nguyên bào sợi nướu hay tế bào gốc dây chằng nha chu người Nguồn tế bào nguyên bào sợi nướu tế bào gốc dây chằng nha chu người hệ P3 cung cấp từ phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh lý học Cơng nghệ sinh học động vật, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh, phát triển giúp trì dịng tế bào có Các tế bào cấy chuyền sang hệ P4 nuôi môi trường DMEM/F12, ủ ấm 370C, 5% CO2 đạt độ che phủ bề mặt bình Roux đến khoảng 80% Tế bào gốc dây chằng nha biểu marker (dấu ấn phân tử) tế bào gốc trung mô CD44, CD73 CD90, đồng thời sở hữu đặc tính đa tiềm biệt hóa thành loại tế bào khác nguyên bào xương tế bào tạo mỡ in vitro (8) Tách chiết PRP Quy trình thu nhận PRP thực kit tách chiết huyết tương giàu tiểu cầu (NEW PRPPRO KIT) theo hướng dẫn nhà sản xuất (Công ty TNHH Thế Giới Gen) Máu ngoại vi lấy từ người tình nguyện 20-30 tuổi, khỏe mạnh, khơng hút thuốc, khơng có tiền sử bệnh máu Máu thu vào ống lấy máu, ống 8,5ml Sau quay ly tâm 2000 vòng/phút 10 phút, hút nhẹ dịch màu vàng bên cho vào ống Đem ly tâm lần với tốc độ 3500 vòng/phút phút Hút bỏ 10ml dịch vàng bên huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP), hút 5ml dịch đáy ống vào ống nghiệm sẵn có 100 µl dung dịch CaCl2 để kích hoạt tiểu cầu giải phóng yếu tố tăng trưởng Sau 15 phút, tách khối đông đặc ống Phần dung dịch lại thu nhận huyết tương giàu tiểu cầu dạng hoạt hóa Thử nghiệm tăng sinh Để đánh giá ảnh hưởng PRP lên tăng sinh loại tế bào, sử dụng phương pháp đếm tế bào buồng đếm thử nghiệm hình thành colony Mơi trường DMEM/F12 có bổ sung FBS 10% (Sigma) nhóm chứng dương mơi trường DMEM/F12 khơng huyết nhóm chứng âm thí nghiệm Đối với phương pháp đếm tế bào: Tế bào cấy vào đĩa 96 giếng (103 tế bào/giếng) nuôi ổn định 24 tủ ủ 370C, 5% CO2 Nhóm thí nghiệm sử dụng mơi trường DMEM/F12 khơng huyết có bổ sung PRP 1%, 2%, 5% Thay môi trường cách ngày giếng Sau 1, 3, 5, ngày, tế bào tách khỏi bề mặt nuôi Trypsin/EDTA 0,25% xác định số lượng tế bào buồng đếm Đối với thử nghiệm hình thành colony: Tế bào cấy vào đĩa giếng khảo sát mật độ 2ml tế bào/đĩa, 103 tế bào/ml, nuôi tủ ủ 370C, 5% CO2 Thay môi trường cách ngày 14 ngày để theo dõi hình thành colony (tiêu chuẩn colony có 50 tế bào) Đĩa tế bào ni cấy sau nhuộm với crystal violet 0,54% glutaraldehyde 6% quan sát Thử nghiệm di cư Sử dụng phương pháp Scratch-wound healing (SWH) để đánh giá di cư loại tế bào ảnh hưởng PRP Nguyên bào sợi nướu hay tế bào gốc dây chằng nha chu người cấy vào đĩa có đường kính 35mm với mật độ 5x104 tế bào đĩa Khi độ bao phủ đạt 80%, tiến hành tạo đường rạch bề mặt đĩa nuôi cấy micropipette đầu týp 1ml Các tế bào khơng dính kết đĩa ni cấy rửa trôi lần PBS (phosphat buffer saline) Bổ sung PRP vào môi trường nuôi cấy 24 Ở mốc 0, 24 48 giờ, quan sát di cư tế bào vào đường rạch kính hiển vi quang học với vật kính 4X 10X Hình ảnh thu phân tích phần mềm Image-Analysis J 1.51j8 để ghi nhận phần trăm diện tích vết thương cịn lại mà tế bào chưa di cư (vùng vô bào) Kết phần trăm thấp chứng tỏ khả di cư tốt Phân tích số liệu Tất thí nghiệm lặp lại lần Số liệu phân tích sử dụng phần mềm SPSS phiên 23 (IBM, New York, USA) Phép kiểm Mann-Whitney dùng để so sánh số lượng khúm tế bào sau hai tuần nuôi cấy nhóm PRP với nhóm chứng Phép kiểm One way ANOVA test Post-hoc Dunnett T3 (nếu có khác biệt phương sai) Tukey HSD (nếu không khác biệt phương sai) để so sánh số tế bào tăng sinh, phần trăm diện tích vùng vơ bào thời điểm khác nhóm thí nghiệm nhóm chứng KẾT QUẢ I NGUYÊN BÀO SỢI NƯỚU NGƯỜI Thử nghiệm tăng sinh Biểu đồ Số lượng tế bào môi trường nuôi cấy ngày 1, 3, 5, (phương pháp đếm tế bào) Nhìn chung, mơi trường khác thí nghiệm này, tế bào hGF ni cấy có tăng giảm theo thời gian Ở mơi trường có PRP 1%, đường biểu diễn số lượng tế bào giống với nhóm chứng âm nhóm chứng dương: tăng sinh từ ngày đến ngày đạt đỉnh vào ngày 5, sau giảm vào ngày Vào ngày ngày 5, số lượng tế bào nhóm PRP 1% thấp nhóm chứng dương cao nhóm chứng âm có ý nghĩa thống kê (p