Tác động kháng khuẩn của huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn porphyromonas gingivalis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO TÁC ĐỘNG KHÁNG KHUẨN CỦA HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỂU CẦU LÊN VI KHUẨN PORPHYROMONAS GINGIVALIS LUẬN VĂN THẠC SĨ RĂNG-HÀM-MẶT Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -! TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO TÁC ĐỘNG KHÁNG KHUẨN CỦA HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỂU CẦU LÊN VI KHUẨN PORPHYROMONAS GINGIVALIS Chuyên ngành: Răng Hàm Mặt Mã số: 8720501 Luận văn Thạc sĩ Răng Hàm Mặt NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Trần Thị Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH ………………… i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT………………………………………… ii DANH MỤC BẢNG ………………………………………………………… iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ……………………………………………………… iv DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………… v MỞ ĐẦU……………………………………………………… …………… MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………….……… 1.1 Vi khuẩn bệnh nha chu………………………………………… 1.2 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis…………………………………… 1.3 Phân lập vi khuẩn Porphyromonas gingivalis……………………… 14 1.4 Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu……………… 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 31 2.1 Thiết kế nghiên cứu………………………………………………… 31 2.2 Vật liệu nghiên cứu………………………………………………… 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 33 2.4 Xử lý, phân tích số liệu …………………………………………… 40 2.5 Y đức……………………………………………………………… 40 2.6 Thời gian địa điểm nghiên cứu………………………………… 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………… 42 3.1 Nuôi cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis………………………… 42 3.2 Huyết tương giàu tiểu cầu………………………………………… 43 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu…………………………………………… 44 3.4 Thí nghiệm kháng bám dính vi khuẩn ……………………………… 45 3.5 Thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học……………………………… 48 CHƯƠNG BÀN LUẬN …………………………………………………… 50 4.1 Phân lập định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis………… 50 4.2 Thu thập huyết tương giàu tiểu cầu………………………………… 58 4.3 Nồng độ ức chế tối thiểu…………………………………………… 61 4.4 Thí nghiệm kháng bám dính vi khuẩn………………………… 65 4.5 Thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học vi khuẩn…………………… 67 KẾT LUẬN …………………………………………………………………… 71 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………… 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT- ANH Các túi màng Outer membrane vesicles Fibrin giàu tiểu cầu Platelet rich fibrin Huyết tương giàu tiểu cầu Platelet rich plasma Huyết tương nghèo tiểu cầu Platelet poor plasma Nhung mao Fimbriae Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum inhibitory concentration Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase chain reacion Phương pháp ion hoá mẫu hấp thụ dựa Matrix assisted laser desorption hỗ trợ chất lượng ionisation - Time of flight laser - Thời gian bay (MALDI-TOF) Thể tích tiểu cầu trung bình Mean platelet volume Thí nghiệm kháng bám dính Adhesion assay Thí nghiệm nhạy cảm/thí nghiệm kháng Biofilm susceptibility assay màng sinh học Thí nghiệm thời gian giết chết Time-kill test Vỏ vi khuẩn Bacterial capsule DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IL Interleukin LPS Lipopolysaccaride MIC Nồng độ ức chế tối thiểu MALDI-TOF Phương pháp ion hoá mẫu hấp thụ dựa hỗ trợ chất lượng laser - Thời gian bay PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp PRF Fibrin giàu tiểu cầu PRP Huyết tương giàu tiểu cầu DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác động PRP nha khoa phẫu thuật hàm mặt……… 24 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu tính kháng khuẩn PRP……………….… 27 Bảng 2.1 Phân loại mức độ viêm nha chu mạn ……………………………… 32 Bảng 3.1 Số lượng tiểu cầu máu toàn phần PRP…………………… 44 Bảng 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu PRP lên vi khuẩn thí nghiệm……… 45 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Độ kháng bám dính vi khuẩn PRP nhóm khoẻ mạnh………… 47 Biểu đồ 3.2 Độ kháng bám dính vi khuẩn PRP nhóm viêm nha chu……… 47 Biểu đồ 3.3 Độ nhạy cảm màng sinh học vi khuẩn với PRP nhóm khoẻ mạnh… 48 Biểu đồ 3.4 Độ nhạy cảm màng sinh học vi khuẩn với PRP nhóm viêm nha chu 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Porphyromonas gingivalis tạo quần thể màu đen đĩa thạch máu Hình 1.2 Đặc điểm khuẩn lạc………………………………………………… Hình 1.3 Porphyromonas gingivalis thâm nhập tế bào tua…………………… 11 Hình 1.4 Cấu trúc LPS màng vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 12 Hình 1.5 Bình kỵ khí………………………………………………………… 16 Hình 1.6 Cấu trúc tiểu cầu……………………………………………… 19 Hình 1.7 Ứng dụng huyết tương giàu tiểu cầu lĩnh vực y khoa…… 22 Hình 1.8 Minh họa cấu trúc bốn dạng tiểu cầu đậm đặc………………… 23 Hình 2.1 Quy trình ni cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis…………… 34 Hình 2.2 Quy trình thu thập mẫu PRP……………………………………… 37 Hình 2.3 Thí nghiệm MIC…………………………………………………… 38 Hình 3.1 Hệ vi khuẩn ni cấy từ mẫu mảng bám sau 10 ngày……………… 42 Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc ……………………………………………… 42 Hình 3.3 Kết định danh vi khuẩn phương pháp MALDI-TOF…… 43 Hình 3.4 Kết giải trình tự phương pháp Sanger 16S…………… … 43 Hình 3.5 PRP………………………………………………………………… 43 Hình 3.6 Nồng độ ức chế tối thiểu…………………………………………… 46 Hình 4.1 Vi khuẩn vị trí chúng mảng bám nướu………… 54 Hình 4.2 Các chủng vi khuẩn Gram (-) kết hợp với viêm nha chu tiến triển… 55 MỞ ĐẦU Viêm nha chu bệnh lý phức tạp, đa yếu tố, đa vi khuẩn đặc trưng phá huỷ thành phần mô nâng đỡ Mảng bám nướu người chứa tới 800 loại vi khuẩn [57] nghiên cứu Porphyromonas gingivalis, vi khuẩn Gram (-) kỵ khí, bệnh nguyên viêm nha chu mạn Vi khuẩn tiết sắc tố đen chứa nhiều yếu tố độc lực gây phá huỷ mô nha chu ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp tới đáp ứng viêm vật chủ [55] Các phương pháp điều trị viêm nha chu gồm phẫu thuật không phẫu thuật có mục tiêu loại bỏ mảng bám vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, kể biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn thực chặt chẽ, vi khuẩn xâm nhiễm phát triển mơ phía tổn thương [39] Sự tồn vi khuẩn làm ảnh hưởng q trình lành thương tái sinh mơ, ảnh hưởng tới kết điều trị Do đó, làm để kháng khuẩn tốt yếu tố quan trọng cho thành cơng lành thương phịng tránh tình trạng mạn tính Huyết tương giàu tiểu cầu (platelet rich plasma, PRP) phát triển gần biện pháp hỗ trợ lành thương tái sinh mô, ứng dụng nhiều lĩnh vực y khoa chỉnh hình, da liễu, thẩm mỹ, nha khoa phẫu thuật hàm mặt [65] Hạt alpha có tiểu cầu có khả giải phóng số lượng lớn peptide yếu tố tăng trưởng Điều giúp cho PRP có ảnh hưởng thúc đẩy q trình sinh học cần thiết cho trình lành thương tái sinh mơ [65] Bên cạnh đó, tác động kháng khuẩn vật liệu báo cáo số cơng trình nghiên cứu vi khuẩn miệng với kết khác [12], [21], [31] Đối với vi khuẩn gây bệnh nha chu, đặc biệt Porphyromonas gingivalis, nghiên cứu tác động PRP lên phát triển vi khuẩn bệnh nguyên cịn giới hạn Ngồi ra, nghiên cứu trước đây, PRP thu thập từ máu người tình nguyện khoẻ mạnh sử dụng chủng vi khuẩn thương mại để nghiên cứu [17], [106] Điều đặt câu hỏi vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy trực tiếp từ mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu, PRP người khoẻ mạnh bệnh nhân viêm nha chu tác động kháng khuẩn in vitro hay không, thực nghiên cứu với mục tiêu: *Mục tiêu chính: Đánh giá tác động kháng khuẩn in vitro PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy từ mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu *Mục tiêu cụ thể: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Xác định độ kháng bám dính vi khuẩn PRP Xác định độ nhạy cảm màng sinh học vi khuẩn Porphyromonas gingivalis với PRP CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn bệnh nha chu Viêm nha chu tình trạng viêm mạn vi khuẩn phá huỷ cấu trúc mô nha chu nâng đỡ gồm nướu, xương ổ răng, dây chằng nha chu xê măng Bệnh lý phổ biến người trưởng thành gây thể nặng không điều trị [55] Theo bảng cập nhật hệ thống phân loại bệnh nha chu Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015, bệnh nha chu chia thành hai nhóm bệnh lý nướu viêm nha chu, phụ thuộc vào phá huỷ bám dính nha chu Viêm nha chu có nhiều yếu tố nguy có hút thuốc đái tháo đường [8] Viêm nướu định nghĩa viêm mô nướu tích tụ mảng bám đặc trưng lâm sàng tình trạng sưng, đỏ chảy máu nướu Viêm nướu tồn giai đoạn dài không tiến triển thành viêm nha chu, trừ có rối loạn chỗ toàn thân vật chủ Ngược lại, viêm nha chu tình trạng viêm khơng hồi phục dẫn tới phá huỷ dây chằng nha chu xương ổ Hậu dẫn tới hình thành túi nha chu, đặc điểm lâm sàng viêm nha chu Túi nha chu bề mặt thuận lợi cho tập trung vi khuẩn hình thành mảng bám nướu [55], [57] Viêm nướu viêm nha chu mạn khởi phát tiến triển vi sinh vật mảng bám Màng sinh học vi khuẩn đối tượng nhiều nghiên cứu, có tới 800 lồi vi khuẩn khác nhận diện mảng bám người [57] Theo How cộng (2016), nghiên cứu giai đoạn từ 1930 tới 1970 chưa nhận diện vi khuẩn đặc hiệu nguyên nhân viêm nha chu Đó lý “thuyết khơng đặc hiệu” đề xuất Người ta cho viêm nha chu hiệp đồng vi sinh vật gây xác định loại vi khuẩn đóng vai trị yếu tố gây bệnh Tuy nhiên, từ cuối năm 1970, nhiều vi sinh vật đặc hiệu phân lập cho yếu tố nguyên nhân viêm nha chu [55] Trong điều kiện bình thường, có cân hệ tạp khuẩn miệng Bất kỳ thay đổi phá vỡ trạng thái cân này, vi khuẩn phát triển mức hay sức khỏe miệng sức khỏe toàn thân bị suy giảm, gây bệnh lý Vi khuẩn giữ vai trò quan trọng bệnh viêm nha chu, đáp ứng miễn dịch thể yếu tố định gây bệnh Các yếu tố môi trường miệng tăng pH nhiệt độ, tăng nguồn dinh dưỡng dịch nướu tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tăng trưởng Quan hệ vi khuẩn giữ vai trò quan trọng định sống cịn chúng Quan hệ hỗ trợ đối kháng Sự liên kết giúp cho số lồi vi khuẩn bám dính vào mơ nha chu Ngược lại, cạnh tranh đối kháng diễn hai hình thức: (a) vi khuẩn mạnh có nhiều hội tồn phát triển; (b) vi khuẩn tiết chất đối kháng để ngăn cản tập hợp hay để tiêu diệt vi khuẩn [76] Các vi khuẩn hình que kỵ khí Gram (-), màu đen Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia cho bệnh ngun gây viêm nha chu Hai lồi thường phân lập nhau, thể tồn mối quan hệ sinh thái học chúng Treponema denticola, xoắn khuẩn miệng xem bệnh nguyên viêm nha chu [55] Socransky (2005) đặt tên cho kết hợp “phức hợp đỏ” phát loại vi khuẩn định chủ yếu tiến triển bệnh lý Trong đó, Aggregatibacter actinomycetemcomitans bị nghi ngờ yếu tố nguyên nhân phổ biến bệnh viêm nha chu công trẻ vị thành niên [89] Độc lực vi khuẩn khả gây bệnh mạnh hay yếu loài vi khuẩn Các yếu tố độc lực định nghĩa thành phần cấu tạo chuyển hoá thể cần thiết cho nhiều giai đoạn chu kỳ sống gây tổn thương cho vật chủ Khả thể cư trú làm rối loạn chế kháng khuẩn bảo vệ vật chủ, khả tạo chất khởi phát phá huỷ mô, đặc điểm bệnh nguyên tiềm Độc lực vi khuẩn bao gồm độc tố, khả bám dính (vai trò nhung mao, vỏ nhầy hemagglutinin), khả xâm nhiễm vi khuẩn vào tế bào vật chủ (biểu độc lực đồng vận, hệ thống chất độc -kháng độc), tổn thương cho mô vật chủ (tạo túi màng ngoài, protein giàu leucin, enzym, sản phẩm chuyển hoá cuối), thay đổi hệ thống miễn dịch vật chủ [55] a/ Khả bám dính vi khuẩn vào mơ nha chu Bám dính bước trình nhiễm khuẩn Những cấu trúc vi khuẩn nhung mao chất bám dính giúp vi khuẩn có khả bám dính vào bề mặt răng, nướu, tế bào biểu mô, nguyên bào tạo sợi, hồng cầu, bạch cầu, màng đáy làm cho chúng có khả kết dính với [76] b/ Khả xâm nhiễm phá hủy mô nha chu Các vi khuẩn có khả xâm nhiễm phá hủy mô nha chu theo chế trực tiếp gián tiếp [53] - Cơ chế trực tiếp: Vi khuẩn phóng thích enzym nội độc tố Một số vi khuẩn Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia sản sinh protease phân hủy collagen, axit hyaluronic (thành phần mô liên kết), fibronectin (chất ngoại bào) giúp vi khuẩn phân tán mô dễ dàng Mặt khác, chất chuyển hóa cuối hợp chất sulfur bay hơi, amoniac, axit béo, indole từ Porphyromonas gingivalis số chất từ Fusobacterum nucleatum gây độc cho tế bào động vật - Cơ chế gián tiếp: Vi khuẩn tiết chất trung gian gây phá hủy mô Lipopolysaccaride (LPS) nội độc tố bên vách tế bào vi khuẩn Gram (-), có khả kích thích đại thực bào bạch cầu đơn nhân phóng thích cytokine tiền viêm interleukin-1 (IL-1), yếu tố hoại tử u α (TNF-α) prostaglandin Đây chất gây viêm có khả kích thích tiêu xương [53] c/ Khả trốn thoát chống trả hệ miễn dịch Một số vi khuẩn có khả “trốn thoát” khỏi hệ thống bảo vệ thể Ví dụ vỏ nhầy số loại vi khuẩn có khả chống lại tượng thực bào bạch cầu đại thực bào Một số vi khuẩn tiết chất catalase, superoxyde dismutase phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) (sản phẩm tạo từ bạch cầu đa nhân), nhờ mà vi khuẩn không bị tiêu diệt Nhiều lồi vi khuẩn có khả phá hủy hệ miễn dịch thể Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia Capnocytophaga tạo protease phá hủy kháng thể IgG IgA đặc hiệu Một số loài vi khuẩn sản sinh chất tiêu diệt bạch cầu, Aggregatibacter actinomycetemcomitans Campilobacter rectus tiết ngoại độc tố leukotoxin phá hủy bạch cầu đại thực bào Hơn nữa, leukotoxin làm cho nhiều tế bào miễn dịch thể chủ bị chết theo chương trình [76] 1.2 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Trong số bệnh nguyên nha chu, Porphyromonas gingivalis cho yếu tố nguyên nhân sinh bệnh học tiến triển tình trạng viêm bệnh nha chu [55] Số lượng Porphyromonas gingivalis cho tăng mạnh vùng viêm nha chu có tỉ lệ thấp khơng phát vùng nướu khoẻ mạnh viêm nướu liên quan mảng bám [55] Bên cạnh đó, Porphyromonas gingivalis cho có liên quan tới viêm nha chu người lớn Trước đây, tên gọi vi khuẩn Bacteroides gingivalis sau đổi thành Porphyromonas gingivalis Porphyromonas bắt nguồn từ tính từ “porphyreos" tiếng Hy Lạp có nghĩa màu tím danh từ “monas" có nghĩa đơn vị “Porphyromonas” nghĩa tế bào porphyrin, miêu tả việc quần thể vi khuẩn trở thành màu đen đĩa thạch máu sau tới 10 ngày tích tụ heme Khu vực cư trú Porphyromonas gingivalis khe nướu khoang miệng người Nó dựa vào lên men axit amin để sản xuất lượng, đòi hỏi thiết cho tồn túi nha chu sâu, nơi nguồn đường có sẵn thấp Là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, Porphyromonas gingivalis xâm chiếm thứ cấp mảng bám thường gắn dính vào vi khuẩn cư trú Streptococcus gordonii Prevotella intermedia [55] Socransky (2005) chứng minh loài vi khuẩn kết hợp với Treponema denticola Tannerella forsythia hình thành phức hợp đỏ [89] Một chứng bổ sung cho diện Porphyromonas gingivalis đến từ nghiên cứu miễn dịch học Các nhà nghiên cứu đồng ý mức kháng thể huyết Porphyromonas gingivalis cao bệnh nhân chẩn đoán viêm nha chu người lớn [55], [89] Về hình thái, tế bào Porphyromonas gingivalis cú dng hỡnh que ngn, kớch thc 0,5ì12àm Porphyromonas gingivalis tạo khuẩn lạc hình trịn, bề mặt trơn láng (đơi gồ ghề), đường kính 1–2mm thạch máu Sau khoảng 4-8 ngày, melanin lan rộng từ bờ khuẩn lạc vào trung tâm, tạo màu sắc đen Tuy nhiên, số lượng nhỏ khuẩn lạc khơng tạo melanin Là vi khuẩn kỵ khí, cần môi trường chứa chlorinated hemoglobin vitamin K (menadione) để phát triển Hemoglobin sản phẩm porphyrin Về đặc điểm sinh hoá, sinh trưởng môi trường chứa BM (bromothymol blue) hay PYG (peptone yeast glucose), Porphyromonas gingivalis sản xuất axit butyric axit acetic, với lượng nhỏ axit propionic, axit iso butyric, isoamyl propionate phenylacetic Porphyromonas gingivalis tạo indole, không sản xuất alpha fucosidase, không khử nitrate thành nitrite không thuỷ phân esculin tinh bột Thử nghiệm tế bào dương tính với MDH (malate dehydrogenase) glutamate dehydrogenase, âm tính với glucose phosphate dehydrogenase glucose 6-phosphate axit salt dehydrogenase Các đặc điểm enzym khả tạo axit acetic đặc điểm khác biệt Porphyromonas gingivalis so với vi khuẩn khác có hình thái [105] Về độc lực, Porphyromonas gingivalis cho sản xuất yếu tố độc lực xuyên qua nướu gây phá huỷ mô trực tiếp hay gián tiếp, cách tạo viêm [55] Các yếu tố độc lực Porphyromonas gingivalis bao gồm nhung mao (fimbriae), hemagglutinin, vỏ vi khuẩn (capsule), lipopolysaccharide (LPS), túi màng ngồi hoạt động enzym hố Các yếu tố có vai trị việc xâm nhiễm bám dính vi khuẩn (nhung mao, hemagglutinin, protein túi màng ngoài, gingipains), thay đổi đáp ứng vật chủ (vỏ nhầy vi khuẩn, LPS, Ig, protease bổ thể, nhung mao) làm tổn thương mô vật chủ (gingipains, collagenase, enzym thuỷ phân) [74] - Vỏ vi khuẩn (capsule) Để tồn khoang miệng, vi sinh vật phải gắn dính trước tiên vào bề mặt hay bề mặt niêm mạc, điều kiện bắt buộc trước nguy rửa trôi dịng nước bọt Sự gắn dính thường qua trung gian yếu tố bám dính (adhesin) bề mặt vi khuẩn thụ thể bề mặt tế bào Adhesin vi khuẩn thành phần thành tế bào liên kết với cấu trúc tế bào, vỏ vi khuẩn hay nhung mao Thành phần hoá học vỏ vi khuẩn khác biệt chủng vi khuẩn, chủ yếu dựa vào thành phần đường chúng Porphyromonas gingivalis biểu kiểu huyết kháng nguyên vỏ vi khuẩn, từ K1 tới K6 Các nghiên cứu sử dụng mơ hình động vật chứng minh chủng Porphyromonas gingivalis có vỏ nhầy có độc lực mạnh chủng khơng có vỏ nhầy Điều thể thông qua tổn thương mà chủng vi khuẩn gây Chủng khơng có vỏ 4.2 chỗ, GRAM-NEGATIVE nhầy thường gây áp xe không BACTERIA xâm lấn, chủng 4.2 GRAM-NEGATIVE BACTERIA có vỏ nhầy gây nhiễm trùng xâm lấn, dạng viêm tấy Đồng thời, 91 chủng khơng có vỏ nhầy dễ bị tiêu diệt đại thực bào tế bào hình tua Mặc dù cần nhiều chứng thấy đóng góp xác vỏ nhầy khả gây bệnh vi khuẩn Theo số nghiên cứu, bảo vệ cấu trúc vi khuẩn, vỏ nhầy góp phần tăng khả sống sót cách giảm tác dụng diệt khuẩn peptide kháng khuẩn nhỏ gọi defensins [55] FIGURE 4.20 (A) Porphyromonas gingivalis cells (Gram stain) (B) P gingivalis cells (SEM) P gingivalis cells are 0.5 àm ì 12 àm rods or coc- FIGURE 4.20 (A) Porphyromonas gingivalis cells (Gram stain) (B) P gingivalis cells (SEM) P gingivalis cells are 0.5 àm ì 12 àm rods or coc cobacilli, cells on solid medium form coccobacilli or very short rods Cells stain gram-negative (C) P gingivalis colonies (BHI blood agar) Hình 1.1 medium Porphyromonas gingivalis tạo rods Hình 1.2onĐặc điểm khuẩn lạc.colonieslustrous, cobacilli, cells oncolonies solid form coccobacilli or forms very short gram-negative (C)Colonies P gingivalis (BHI blood (D) P gingivalis (stereomicroscope) P gingivalis colonies 1–2Cells mm instain diameter blood agar are rounded, with aagar (D) P gingivalis colonies (stereomicroscope) gingivalis forms melanin coloniesspreads 1–2 mmfrom in diameter agar are smooth (or occasionally rough) surface AfterP 4–8 days’ culture, the edgeon to blood the center ofColonies the colony torounded, form blacklustrous, colonies.with quần thể màu đen đĩa thạch máu Porphyromonas gingivalis smooth (ornumber occasionally rough) surface After 4–8 days’ culture, melanin spreads from the edge to the center of the colony to form black colonie A small of colonies not produce melanin Khuẩn lạc hình trịn, dạng lồi, kích thước A small number of colonies not produce melanin 1-2mm, bề mặt láng bóng Porphyromonas are obligate anaerobes with an optiAs an obligate anaerobe, chlorinated hemoglobin and As2015” an anaerobe, chlorinated hemoglobin Porphyromonas are obligate anaerobes with opti°C On blood agaran plates, mum growth temperature of 37Nguồn: vitamin K1obligate are[105] required in the growth media Hemo- an “Xuedong Yuqing, vitamin K1 are required in the growth media Hemo mum growth temperature of 37 °C On blood agar plates, they can form colonies 1–3 mm in diameter that are pro- globin is the main product of porphyrin Characteristic mm in diameter arefew pro- colonies globin are is the main of porphyrin they can form colonies tuberant, lustrous, and1–3 with smooth surfacethat (very shown in product Figure 4.20(C) and (D) Characteristi 4.20(C) the andmain (D) termituberant, lustrous, and with smooth surface (very few colonies are shown with rough surface) When grown in BMinorFigure PYG media, primary endpoint product in PYG medium is nal acids byBM P gingivalis butyric and Whenproduced grown in or PYG are media, theacid main termi withThe rough surface) butyric acid andendpoint acetic acid There isina small acid, with a small of propionic acid,acid iso- an nal acids produced byamount P gingivalis are butyric The primary product PYG amount mediumofis acetic pionate propionate, andofphenylacetic acid iso acetic acid, acid,isoamyl with a small amount propionic acid, ount of butyric yric acid, and isoamyl propionate produced as well butyric acid, isoamyl propionate, and phenylacetic aci The genomic GC content of this genus is 46–54% The P gingivalis produces indoles, does not produce produced as well produced alpha fucosidase, does not reduce nitrite, type species is Porphyromonas asaccharolytica P gingivalis produces indoles,nitrate does tonot produc The genomic GC content of this genus is 46–54% The and does not hydrolyze esculin and starch Cells test - Nhung mao (fimbriae) Nhung mao (hay khuẩn mao) Porphyromonas gingivalis chứng minh có khả gắn vi khuẩn vào mô vật chủ hydroxyapatite phủ nước bọt [54] Loại fimbria đầu tiên, lớn dài, hay gọi nhung mao FimA, loại thứ hai nhỏ ngắn, nhung mao Mfa1 Ngoài việc trung gian gắn dính, nhung mao cịn có số đặc điểm hoá ứng động cảm ứng cytokine Chúng có khả miễn dịch cao, thể qua đáp ứng kháng thể trung gian tế bào huyết nước bọt [74] - Hemagglutinin Porphyromonas gingivalis tạo phân tử hemagglutinin Các enzym có mặt lớp màng ngồi vi khuẩn tiếp xúc với tế bào hay mô vật chủ Chúng tồn chu chất vận chuyển vào bề mặt tế bào Hemagglutinin thúc đẩy trình xâm nhiễm cách gắn vi khuẩn vào thụ thể (thường oligosaccharide) tế bào người Nhờ hemagglutinin, Porphyromonas gingivalis gắn vào tế bào hồng cầu sử dụng heme để phát triển [74] - Các protein túi màng (outer membrane proteins, outer membrane vesicles) Các protein giải phóng khỏi màng ngồi q trình phát triển dạng túi màng Trong túi nhỏ số lượng lớn enzym xuất vùng chu chất tế bào nguyên vẹn, bao gồm: phospholipase C, proesterase, alkaline phosphatase, hemolysin autolysin Các túi nhỏ hợp với màng ngồi lồi vi khuẩn khác, yếu tố độc lực giải phóng, làm suy yếu tế bào đích Các túi màng ngồi từ Porphyromonas gingivalis tăng cường sản xuất interferongamma tế bào T, từ làm tăng thêm vấn đề miễn dịch ghi nhận viêm nha chu [74] Bên cạnh đó, hình thành mảng bám đảm bảo tính tồn vẹn phụ thuộc vào tương tác thành viên chọn hệ vi sinh vật Các loài tập hợp với tạo thành mơi trường vi mơ phức tạp hay cịn gọi màng sinh học Porphyromonas gingivalis đóng vai trị quan trọng hình thành trì màng sinh học nha chu, tương tác với vi khuẩn Gram (+) Gram (-) chọn lọc thông qua trung gian protein nằm rải rác màng túi màng [54] - Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide (LPS) phân tử lớn có kích thước 10kDa Nó thành phần quan trọng màng vi khuẩn Về cấu tạo, LPS vi khuẩn bao gồm phần polysaccharide (O-kháng nguyên/O-antigen), oligosaccharide "lõi" phần kỵ nước gọi lipid A (hay nội độc tố) Lipid A, cùng, vùng sinh học hoạt động LPS gây bất hoạt hệ miễn dịch cách tương tác với thụ thể giống Toll [55] Hình 1.3 Porphyromonas gingivalis thâm nhập tế bào tua Nguồn: “How cộng sự, 2016” [53] Vi khuẩn sử dụng nhung mao Mfa1 protein phụ Ở vi khuẩn Gram (-), LPS có vai trị trì tính tồn vẹn cấu trúc tế bào, kiểm soát tiếp nhận phân tử kỵ nước hoá chất độc hại LPS coi yếu tố độc lực quan trọng vi khuẩn bệnh nguyên nha chu kích hoạt đáp ứng viêm vật chủ cản trở trình tái cấu trúc xương [55] Trên thực tế, hệ thống miễn dịch vật chủ nhận biết LPS Porphyromonas gingivalis so với LPS loài Gram (-) khác hoạt động nội độc tố vi khuẩn thấp, phần cấu trúc hố học thiếu nhóm phosphat 4’ khác biệt vị trí chất axit béo phần lipid A vi khuẩn [54] Trong trường hợp khơng có bảo vệ hiệu hệ thống miễn dịch, số lượng vi khuẩn nha chu tăng lên đáng kể Sự gia tăng vi khuẩn khu vực nướu với thất bại hệ thống bảo vệ vật chủ phù hợp với nguyên nhân quan sát bệnh nha chu Bên cạnh việc gây tổng hợp cytokine gây viêm, LPS Porphyromonas gingivalis ức chế phân chia khống hóa tế bào tạo xương tế bào gốc dây chằng nha chu, ảnh hưởng tới q trình tái tạo mơ nha chu [55] Hình 1.4 Cấu trúc LPS màng vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Nguồn: “How cộng sự, 2016” [53] - Proteinase (gingipains) Arg-proteinases Lys-proteinases proteinase cysteine đặt tên chung gingipains Các enzym xuất bề mặt (trong màng ngoài) vi khuẩn, nơi chúng tiếp xúc với tế bào mô vật chủ, không gian chu chất để vận chuyển đến bề mặt tế bào, túi bị bong tróc khỏi màng ngồi q trình tăng trưởng Các loại gingipains bao gồm gingipains arginine đặc hiệu (Arggingipain-A, RgpA Arg gingipain-B, RgpB) gingipain lysine đặc hiệu (Lys-gingipain, Kgp) Các gingipains chứng minh chất điều chỉnh tăng cường tính thấm mạch máu, có khả gây tính thấm mạch máu huyết tương người tách bradykinin trực tiếp từ kininogen có trọng lượng phân tử cao Khả làm tăng đáng kể khả thẩm thấu mạch máu vị trí viêm nha chu dẫn đến tăng lưu lượng chất nướu Gingipains có hoạt động hố ứng động cho bạch cầu đa nhân làm gia tăng nồng độ tế bào vật chủ vị trí mô tiềm năng, gây phá hủy xương Bên cạnh đó, Porphyromonas gingivalis có khả chống chọi với hệ thống bổ thể người Sức đề kháng phụ thuộc phần lớn vào hoạt động phân giải protein gingipains làm suy giảm thành phần khác bổ thể Quá trình thể qua mặt trao đổi chất, Porphyromonas gingivalis vi khuẩn khơng phân giải đường, nghĩa khơng thể chuyển hóa carbohydrate, nên phải dựa vào nguồn cacbon lượng từ protein Do đó, khả phân giải protein lớn thành peptide nhỏ chế quan trọng đặc biệt cho phát triển nhân lên vật chủ Thêm vào đó, vi khuẩn địi hỏi phân tử chứa sắt (hemin) để tăng trưởng Việc phân giải protein lớn transferrin hemoglobin để cung cấp cho thể vi khuẩn góp phần gây tác động tiêu huyết [55], [74] - Collagenase Collagenase vi khuẩn có khả phân huỷ collagen típ I cho nguyên nhân phá huỷ mô liên kết viêm nha chu [55] 1.3 Phân lập vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Các mẫu mảng bám phân tích kính hiển vi lần đầu van Leeuwenhoek, phương pháp nuôi cấy môi trường dinh dưỡng cho vi khuẩn sau phát triển Quy trình ni cấy vi khuẩn mảng bám cải thiện theo thời gian nhờ ứng dụng phương pháp kỵ khí, mơi trường chứa máu chất dinh dưỡng phức tạp đa dạng vi khuẩn nuôi cấy Các nghiên cứu năm 1960 chứng minh giá trị phương pháp nuôi cấy kỵ khí, thành cơng ứng dụng nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu nha chu sâu từ năm 1970 Phương pháp nuôi cấy kỵ tiếp tục cung cấp cho ngày nhiều hiểu biết hệ vi sinh vật miệng, đặc biệt bệnh nha chu sâu răng, phương pháp để định danh vi khuẩn thay đổi từ thử nghiệm sinh hố thành phương pháp giải trình tự rRNA 16S Khi vi khuẩn phát phương pháp phân tử, việc làm để ni cấy chúng phục vụ cho nghiên cứu chuyên sâu trở thành mối quan tâm sau Mặc dù tiềm ni cấy kỵ khí khả phát phần lớn lồi ni cấy mẫu, nhược điểm phương pháp đòi hỏi nhiều thời gian công sức, giới hạn số lượng mẫu phân tích Thêm vào đó, ni cấy khơng đánh giá có mặt số vi khuẩn khó mọc [92] Ni cấy khơng chọn lọc cho phương pháp hiệu để bộc lộ tất thành phần bệnh nguyên hệ vi khuẩn nha chu, nhằm nhận biết diện bệnh nguyên nha chu gặp, xác định độ nhạy kháng khuẩn bệnh nguyên nha chu Tuy nhiên, với mục đích nuôi cấy loại vi khuẩn bệnh nguyên đặc hiệu, cần sử dụng môi trường chọn lọc riêng biệt ưu tiên phát triển vi khuẩn Để phân tích vi khuẩn túi nha chu đặc hiệu, mảng bám nướu mẫu dịch nướu phù hợp [37] Các yếu tố cần thiết để nuôi cấy mẫu vi khuẩn bao gồm: môi trường ni cấy phù hợp (có chứa nguồn lượng, carbon yếu tố vi lượng), pH, nhiệt độ, nồng độ oxy thay đổi tuỳ theo loại vi khuẩn [50] Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có vị trí cư ngụ sâu túi nha chu Do đó, quy trình lấy mẫu ni cấy vi khuẩn địi hỏi tiêu chuẩn khắt khe việc đảm bảo trì mơi trường khơng có oxy Trong phần lớn nghiên cứu, thu thập mảng bám nướu thực cách đưa côn giấy vô khuẩn vào túi nha chu Điều áp dụng cho việc nuôi cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Việc lấy mẫu thực bệnh nhân viêm nha chu có túi sâu từ 5mm trở lên [79] Đối với hầu hết vi khuẩn kỵ khí vi khuẩn vi hiếu khí, mẫu phải gửi đến phịng thí nghiệm sớm tốt trì mơi trường yếm khí Điều nhằm giảm thiểu chết vi khuẩn nhạy cảm với oxy trình vận chuyển Để giảm xâm nhập oxy, paraffin lỏng vô trùng đặt mơi trường vận chuyển Đối với mẫu lâm sàng nuôi cấy kịp thời phải vận chuyển khoảng cách dài, túi kỵ khí (có sẵn thị trường) mơi trường lỏng có sẵn ống xoắn ốc đóng kín paraffin lỏng sử dụng để vận chuyển [105] Trong nghiên cứu nuôi cấy Porphyromonas gingivalis, nhiều loại dung dịch vận chuyển môi trường nuôi cấy mẫu khác sử dụng Môi trường vận chuyển saline đệm phosphate (PBS), brucella broth, VMG I, VMGA III Trong mơi trường ni cấy thạch Wilkins Chalgren, trypticase soy, brucella brain heart infusion (BHI) hay thạch máu Columbia Tuy nhiên, tất bổ sung máu cừu máu ngựa, hemin vitamin K dựa vào đặc điểm sinh trưởng riêng biệt vi khuẩn [70], [77] STRAIN CULTURE AND CULTIVATION-BASED TECHNIQUES Fig 22 The anaerobic jar (1) clamp (2) cover (3) palladium catalyst (4) H2+CO2 generator (5) redox indicator (6) culture plates Hình 1.5 Bình kỵ khí Nguồn: “Goldman E, 2015” [48] Object of study: (1) Phần giữ (2) Nắp (3) Xúc tác palladium (4) Túi tạo H2+CO2 (5) Miếng thị khí (6) Đĩa Clostridium spp from soil nuôi cấy Materials and equipment: Điều kiện cần thiết cho phát triển Porphyromonas gingivalis soil or sediment sample mL sterile distilled water in test tubes vortex mixer anaerobic jar redox indicator strip gas generator envelope palladium catalyst scissors pipette, sterile pipette tips glass spreader (alcohol for sterilisation) bismuth sulphite agar medium (see Appendix as Wilson-Blair type agar) Bunsen burner incubator áp dụng cho tất nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn đảm bảo nhiệt độ 37ºC, môi trường với thành phần khí khơng chứa oxy từ 4-10 ngày Chính thế, buồng kỵ khí cung cấp mơi trường nuôi cấy phù hợp cho nghiên cứu vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có Porphyromonas gingivalis, sử dụng rộng rãi phòng xét nghiệm vi sinh Túi tạo môi Practise: Prepare a 6-member 10-foldđáp dilution series from sample trường kỵ khí ứng cácsoilu cầu này, ví dụ: BBL GasPak® (Becton Spread each member of the dilution series onto Wilson-Blair type agar medium Dickinson microbiology systems (BD), Cockeysville, Md.), AnaeroPack® Put the inoculated Petri-dishes with their surface down into the anaerobic jar (Fig 22) Open the redox indicator and place it next to the plates so that the indicator strip can be seen from the outside (the indicator strip will turn blue within (Mitsubishi gas seconds) chemical of America, Inc., New York) [70] Take care that palladium catalyst has been regenerated (by incineration) or replace with a fresh one Để định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis, bên cạnh việc dựa Cut the gas generator envelope with scissors, and add 8-10 mL water with a pipette (according to the manufacturers’ instructions) Close the jar and screw on the clamp, then put the jar into an incubator at 28°C hình màu sắc đặc trưng khuẩn lạc,(seengười ta15) tiến hành nhuộm After dáng one week of incubation, determine the CFU number for the original sample EXERCISE EXERCISE 32: DEMONSTRATION OF THE ANAEROBIC CHAMBER (GLOVE-BOX) Gram, phân tích sinh hố sử dụng phương pháp đại PCR (polymerase chain reaction), MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight) 49 XML to PDF by RenderX XEP XSL-FO F ormatter, visit us at http://www.renderx.com/ Để lưu trữ vi khuẩn, tương tự lồi khác, sử dụng phương pháp cấy chuyền, cất giữ mẫu nhiệt độ thấp (4-8ºC, -20ºC hay -80ºC) đông khô [50] Porphyromonas gingivalis bệnh nguyên viêm nha chu Mặc dù việc phát vi khuẩn thực dễ dàng nhanh chóng nhờ phương pháp phân tử, ni cấy đóng vai trị quan trọng để tạo nguồn vi khuẩn cho phân tích chuyên sâu Dựa vào đặc điểm riêng biệt Porphyromonas gingivalis, lựa chọn mơi trường điều kiện nuôi cấy đặc hiệu ưu tiên cho sinh trưởng tăng sinh cho vi khuẩn bệnh nguyên nha chu 1.4 Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu 1.4.1 Huyết tương giàu tiểu cầu 1.4.1.1 Định nghĩa Theo Dohan cộng (2005), huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) định nghĩa phần giàu tiểu cầu, có sau quay ly tâm máu có chất chống đơng PRP định nghĩa thể tích huyết tương tự thân chứa nồng độ tiểu cầu người cao bình thường [111] 1.4.1.2 Tiểu cầu Tiểu cầu tế bào nhỏ tế bào máu, có hình trịn hình bầu dục với đường kính xấp xỉ 2µm (1,2-2,3µm) Bình thường số lượng tiểu cầu máu từ 150 000 đến 400 000/mm3 Đời sống trung bình tiểu cầu 10 ngày trước bị thực bào đại thực bào hệ thống lưới nội mô [108] Về cấu tạo, bên tiểu cầu có cấu trúc phức tạp, gồm hệ thống vi quản ngoại vi, hệ thống ống dày đặc, ti thể, nhiều hạt [58] Các hạt đặc chứa nồng độ cao phân tử nhỏ ADP/ATP, canxi, ma-giê serotonin Chúng có tính axit nhẹ đồng thời chứa protein màng D63 (LAMP 3) LAMP Thông thường tiểu cầu có từ 3-9 hạt đặc [58] Ngược lại, hạt alpha có số lượng từ 50 đến 80, có đường kính khoảng 200500nm, chứa nhiều protein bao gồm yếu tố tăng trưởng có chức quan trọng q trình làm lành vết thương [101], ví dụ : - Yếu tố tăng trưởng giống insulin (insulin-like growth factor, IGF): điều tiết sinh lý học bình thường gần loại tế bào thể tham gia vào trình tổng hợp sụn khớp - Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (transforming growth factor beta, TGF-β: β1, β2): thúc đẩy phân bào tế bào gốc trung mơ, ngun bào xương, tăng q trình khống hố xương, tham gia q trình tổng hợp chất sụn khớp - Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (platelet derived growth factor, PDG αα, ββ, αβ): thu hút đại thực bào tới nơi tổn thương; PDGF kết hợp với TGF-β, IGF có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng mạch máu, phân chia tế bào, hình thành da, chất xương, tổng hợp collagen - Yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch máu (vascular endothelial growth factor, VEGF): thúc đẩy hình thành mạch máu - Yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor, EGF): thúc đẩy tăng trưởng tế bào biệt hóa, hình thành mạch máu, hình thành collagen - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (fibroblast growth factor 2, FGF-2): thúc đẩy tăng trưởng tế bào biệt hóa hình thành mạch máu - Yếu tố tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu (platelet derived endothelial growth factor, PDEGF) - Yếu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu (platelet derived angiogenesis factor, PDAF) Bên cạnh yếu tố tăng trưởng, tiểu cầu cịn giải phóng số chất khác có vai trị q trình hình thành cục máu đơng lành thương fibronectin, vitronectin, sphingosine 1-phosphate, v.v [108] Về chức năng, tiểu cầu nguồn cung cấp yếu tố tăng trưởng tự nhiên, tham gia vào trình đơng - cầm máu khởi đầu q trình làm lành vết thương [22] 1.4.2 Phân loại phương pháp thu nhận huyết tương giàu tiểu cầu Trong truyền máu huyết học, tiểu cầu đậm đặc (platelet concentrates) sử dụng để điều trị phòng ngừa chảy máu bệnh lý giảm tiểu cầu, có nguyên nhân suy tuỷ xương, ung thư bạch cầu hay máu nghiêm trọng trình phẫu thuật kéo dài Tiểu cầu đậm đặc tiêu chuẩn sử dụng cho truyền máu đặt tên huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) thường chứa 0,5×1011 tiểu cầu đơn vị [42] Hình 1.6 Cấu trúc tiểu cầu Nguồn: “Zapata cộng sự, 2014” [108] Việc sử dụng chế phẩm từ máu để đóng vết thương kích thích q trình lành thương bắt đầu việc dùng keo fibrin, miêu tả lần cách 40 năm chứa fibrinogen đậm đặc Ngày nay, keo fibrin chế tạo từ huyết tương người, Tisseel (Baxter, USA) sử dụng rộng rãi Các loại keo fibrin tự thân cho lựa chọn tốt tránh nguy nhiễm khuẩn, chúng sử dụng giới hạn độ phức tạp chi phí cao [42] Do đó, sử dụng tiểu cầu đậm đặc để cải thiện lành thương thay keo fibrin, miêu tả lần Whitman cộng [103] Tiểu cầu chứa lượng lớn yếu tố phát triển Đồng thời, phát triển vật liệu thể qua nhiều quy trình chuẩn bị, kit kiểu ly tâm Tất sản phẩm gọi PRP, tên với tiểu cầu đậm đặc dùng cho truyền máu nguyên bản, chúng khác hệ thống quy trình thực Tất kỹ thuật tách chiết PRP có có điểm chung sau: máu thu thập với chất chống đơng trước hay q trình phẫu thuật đưa vào máy ly tâm Thời gian chuẩn bị tiểu cầu đậm đặc khác thường hoàn thành vòng Lần ly tâm thứ nhằm phân tách máu thành ba lớp: hồng cầu phía cùng, huyết tương không tế bào (hay nghèo tiểu cầu, PPP) lớp phủ màu trắng - buffy coat - giữa, chứa bạch cầu tiểu cầu Bước thứ hai thay đổi tuỳ theo quy trình có mục đích loại bỏ lớp hồng cầu PPP để thu thập lớp buffy coat Cuối cùng, tiểu cầu đậm đặc đưa vào vùng phẫu thuật ống tiêm, với thrombin và/hoặc canxi clorua (hoặc yếu tố tương tự) để kích hoạt tiểu cầu trùng hợp fibrin [42] Fibrin giàu tiểu cầu (platelet rich fibrin, PRF) Choukroun đề xuất sản phẩm phát triển quy trình Máu thu thập không sử dụng chất chống đông ly tâm Q trình đơng máu tự nhiên diễn cho phép thu thập dễ dàng khối fibrin giàu tiểu cầu bạch cầu (L-PRF) mà khơng cần biến đổi hố sinh nào, không chất chống đông, không thrombin hay canxi clorua Kỹ thuật đơn giản, tự nhiên có chi phí hợp lý [110] Để phân loại tiểu cầu đậm đặc, Ehrenfest Dohan cộng (2009) đề xuất ba thơng số đánh giá Thơng số (A) liên quan tới kit quy trình ly tâm sử dụng Trong A1 thể dạng ly tâm, A2 thể thời gian thực A3 liên quan tới chi phí thiết bị kit Thông số thứ hai (B) liên quan tới đặc điểm sản phẩm thu Trong B1 thể thể tích cuối sản phẩm thu được, B2, B3 cho biết tỉ lệ tiểu cầu bạch cầu chất lượng chúng (B4) Thông số thứ ba (C) liên quan tới mạng lưới fibrin nâng đỡ tiểu cầu bạch cầu ứng dụng điều trị C1 thể mật độ mạng lưới C2 cho biết dạng trùng hợp fibrin [42] Các sản phẩm tiểu cầu đậm đặc chia thành bốn loại: huyết tương giàu tiểu cầu nghèo bạch cầu (P-PRP), huyết tương giàu tiểu cầu bạch cầu (L-PRP), fibrin giàu tiểu cầu (P-PRF) fibrin giàu tiểu cầu bạch cầu (L-PRF) [42] Theo Magalon cộng (2014), thị trường có 16 hệ thống tách chiết tiểu cầu, sử dụng phương pháp thu thập phân tách khác Điều dẫn tới khác biệt thành phần, nồng độ tiểu cầu đậm đặc tuỳ theo hệ thống sử dụng đó, dẫn đến đa dạng khác biệt kết nghiên cứu sử dụng vật liệu sinh học [64] 1.4.3 Ứng dụng huyết tương giàu tiểu cầu PRP ứng dụng nhiều lĩnh vực y khoa, đặc biệt phẫu thuật nhờ khả hỗ trợ lành thương tái tạo mô Trong y học thể thao, PRP sớm sử dụng để điều trị tổn thương xương nhanh chóng ứng dụng rộng rãi lĩnh vực [83] Các nghiên cứu PRP đa dạng lĩnh vực phẫu thuật tim mạch, nhi khoa, sản khoa, niệu khoa, phẫu thuật thẩm mỹ nhãn khoa Đặc biệt, lĩnh vực da liễu, PRP ứng dụng không cho tái sinh mô, lành thương, điều trị sẹo, trị bỏng trẻ hố da, cịn được sử dụng cho bệnh lý rụng tóc [71] Hình 1.7 Ứng dụng huyết tương giàu tiểu cầu lĩnh vực y khoa Nguồn: “Conde Montero, 2015” [69] Theo tác giả Albanese (2006), PRP sớm ứng dụng nha khoa phẫu thuật miệng Các chứng khoa học liên quan tới tác động hiệu PRP tranh luận việc sử dụng đồng thời với vật liệu ghép khác quy trình kỹ thuật khác Bên cạnh đó, tác giả đưa so sánh số nghiên cứu ứng dụng PRP nha khoa phẫu thuật miệng đánh giá tác động PRP cho nghiên cứu (Bảng 1.1) [5] 1.4.4 Tác động kháng khuẩn huyết tương giàu tiểu cầu 1.4.4.1 Định nghĩa kháng khuẩn Kháng khuẩn khả ức chế phát triển nhân lên vi khuẩn Mỗi nhóm chất kháng khuẩn thường có chế hoạt động khác Các vi khuẩn Gram (-) Gram (+) khác cấu trúc vách tế bào Sự khác định khả chất kháng khuẩn ức chế tăng trưởng vi khuẩn Gram (-) hay Gram (+) Tuy nhiên, số chất hoạt động hai loại vi khuẩn gọi phổ rộng Các chất kháng khuẩn can thiệp vào tổng hợp thành tế bào, ức chế tổng hợp protein, can thiệp vào trình tổng hợp axit nucleic hay ức chế đường chuyển hố [91] Hình 1.8 Minh họa cấu trúc bốn dạng tiểu cầu đậm đặc Nguồn: “Ehrenfest Dohan cộng sự, 2009”[40] Hai thông số: bạch cầu (khối tròn màu xanh) mật độ fibrin (sợi màu vàng nâu) đóng vai trị quan trọng Tiểu cầu tích tụ sợi fibrin Ở sản phẩm P-PRP L-PRP (hình trên), mạng lưới fibrin chưa trưởng thành chứa nhiều vi sợi có đường kính nhỏ (mũi tên màu đỏ) phản ứng trùng hợp đơn giản Mạng lưới nâng đỡ tiểu cầu ứng dụng phẫu thuật tan nhanh keo fibrin Ở P-PRF L-PRF, sợi fibrin dày (mũi tên màu đen) kết nối nhiều sợi fibrin với nhau, tạo nên chất vững Bảng 1.1 Tác động PRP nha khoa phẫu thuật hàm mặt Tác giả Năm Số bệnh nhân Tái khám (tuần) Thủ thuật Kết Tác động PRP Arenaz-Bua 2012 cộng [15] 82 12-24 Nhổ Khơng thúc đẩy hình thành xương sau ứng dụng PRP Khơng có cải thiện đau, sưng, khít hàm nhiễm khuẩn Yếu Alissa cộng [6] 2010 23 12 Nhổ Tăng có ý nghĩa lành thương mơ mềm xương, giảm có ý nghĩa đau biến chứng sau phẫu thuật Mạnh Menezes cộng [69] 2012 60 48-192 Điều trị khuyết hổng xương Có hiệu sử dụng PRP với vật liệu ghép khác khuyết hổng khơng có tác dụng sử dụng PRP Yếu Anitua cộng 2006 [11] 295 Cấy ghép implant Cải thiện tiên lượng implant Mạnh Gentile cộng [48] 2010 15 2-4-12-24 Tái tạo xương hàm PRP có hiệu phương diện hài lòng bệnh nhân Mạnh Cabbar cộng [30] 2011 10 28 Nâng xoang Khơng có khác biệt có ý nghĩa quan sát thấy Yếu Bocanegra cộng [23] 2012 14 Điều trị lộ xương hoại tử hàm hàm Liền xương niêm mạc nhanh, giảm đau giảm tổn thương miệng Mạnh [23], [30], [48], [11], [69], [15], [6] 1.4.4.2 Các phương pháp xác định tính kháng khuẩn Có nhiều phương pháp xét nghiệm sử dụng để đánh giá tầm sốt in vitro hoạt tính kháng khuẩn hợp chất loại chiết xuất Các phương pháp phổ biến bao gồm phương pháp khuếch tán (diffusion), phương pháp pha lỗng (dilution) thí nghiệm thời gian diệt khuẩn (timekill) Đối với phương pháp khuếch tán, chọn lựa phương pháp đĩa giấy khuếch tán qua thạch (Kirby-Bauer method), phương pháp khuếch tán qua giếng thạch hay phương pháp đường vng góc (cross streak) đo kích thước vùng ức chế (zone of inhibition) Phương pháp pha loãng mơi trường lỏng hay thạch sử dụng để định lượng hoạt tính kháng in vitro lên vi khuẩn nấm xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu, MIC (minimum inhibitory concentration) Giá trị MIC định nghĩa nồng độ thấp chất kháng khuẩn thử nghiệm ức chế phát triển trông thấy vi sinh vật thử nghiệm biểu diễn đơn vị µg/l hay mg/l tỉ lệ pha loãng hợp chất chiết xuất thí nghiệm Ngồi ra, nghiên cứu sâu tác động kháng khuẩn chất, nhiều tác giả sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy (flow cytofluorometric) hay phương pháp phát quang sinh học ATP [19] Đối với vi khuẩn tạo màng sinh học, khả kháng vi khuẩn chất cịn xác định thơng qua thí nghiệm kháng bám dính vi khuẩn (bacterial adhesion assay) [20] thí nghiệm nhạy cảm hay kháng màng sinh học (biofilm susceptibility assay) [63] 1.4.4.3 Các nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn PRP Nhiễm khuẩn biến chứng nghiêm trọng ảnh hưởng tới lành thương tái sinh mơ [39] Mặc dù có ý kiến cho tiểu cầu thúc đẩy nhiễm khuẩn chúng tạo điều kiện thuận lợi cho bám dính vi khuẩn vào thành mạch, tiểu cầu cho có vai trò quan trọng hàng rào bảo vệ vật chủ chống lại vi sinh vật gây bệnh Chúng tế bào máu nhận tổn thương nội mạc, gây xâm lấn vi khuẩn nhanh chóng tích tụ vùng nội mạc bị nhiễm trùng [16] Trong tiềm tái tạo chế phẩm giàu tiểu cầu phát từ ngày đầu giới thiệu lĩnh vực phẫu thuật tái tạo miệng hàm mặt, tương đối nghiên cứu tìm hiểu tác động kháng khuẩn, dù có tăng nhanh cơng trình nghiên cứu sử dụng vật liệu năm Một phần chế phía sau tác động kháng khuẩn PRP chưa rõ ràng PRP chứa hỗn hợp phức tạp nồng độ tiểu cầu huyết tương phụ thuộc vào quy trình sản xuất nó, thành phần bạch cầu thay đổi, chất sợi dày đặc hay mỏng Vì vậy, đặc điểm chế hoạt động thành phần, tác động đồng vận thành phần việc chống nhiễm khuẩn, nghiên cứu Từ giả định tiểu cầu biểu số lượng lớn thụ thể vi khuẩn tiềm có khả trơ hố vi khuẩn giải phóng vơ số phân tử tham gia trình bảo vệ vật chủ, nhiều nghiên cứu phân lập đặc trưng hoá phân tử kháng khuẩn tiểu cầu Bên cạnh đó, chúng có vai trị gián tiếp việc thu hút bạch cầu tới vùng viêm nhiễm, điều hoà khả thực bào, tiêu diệt vi sinh vật thơng qua đường tín hiệu khác [44] Các nghiên cứu tính kháng khuẩn PRP thực phịng thí nghiệm mơ hình động vật Các phương pháp sử dụng bao gồm thí nghiệm đường cong giết chết (killing curves/ time-kill), thí nghiệm khuếch tán Kirby-Bauer hay xác định nồng độ ức chế tối thiểu Chế phẩm tiểu cầu đậm đặc sử dụng bao gồm P-PRP, L-PRP hai, với chất kích hoạt khác Đối tượng vi khuẩn đa dạng bao gồm vi khuẩn Gram (-), Gram (+), nấm [39] [31], [65], [3], [17], [67], [106], [41], [66], [39], [56], [81], [40], [32], [28], [94], [12], [107] Bảng 1.2 Một số nghiên cứu tính kháng khuẩn PRP Tác giả Năm Loại Đối tượng vi khuẩn Thí nghiệm Kết Çetinkaya cộng [31] 2018 PRP*/ PPP* Staphylococcus aureus, Enterococcus spp kháng vancomycine, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa kháng carbapenem Khuếch tán time-kill PRP PPP có khả kháng MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Maghsoudi cộng [65] 2017 PRP*-1 thu sau bước ly tâm PRP*-2 thu sau bước ly tâm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus epidermidis, Shigella sp.và Serratia sp Khuếch tán qua thạch phương pháp pha loãng PRP-1 giảm tỉ lệ phát triển số chủng, PRP-2 ức chế Shigella sp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus epidermidis Aggour cộng [3] 2017 PRP***/ PPP*** Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Staphylococcus aureus Candida albicans **** Khuếch tán qua thạch PRP PPP kích hoạt hai nhóm khoẻ mạnh viêm nha chu kháng vi khuẩn thí nghiệm PRP PPP khơng kích hoạt khơng thể tính kháng khuẩn Badade cộng [17] 2016 PRF*/ PRP* Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans Khuếch tán qua thạch Porphyromonas gingivalis Aggregatibacter actinomycetemcomitans bị ức chế PRP không PRF Mariani cộng [67] 2015 P-PRP* L- PRP* Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae Pha loãng thạch P-PRP L-PRP thể khả kháng khuẩn tương đồng Yang cộng [106] 2015 PRP*/ PRF* Fusebacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis,
 Aggregatibacter actynomicetemcomitans MIC, timekill thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học Ức chế phát triển vi khuẩn Tác giả Năm Loại Đối tượng vi khuẩn Thí nghiệm Kết Edelbute cộng [41] 2015 P-PRP* (hết hạn 1ngày) Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii Thí nghiệm pha loãng in vitro in vivo, ex vivo chuột Kháng có ý nghĩa chủng vi khuẩn thí nghiệm Mariani cộng [66] 2014 P-PRP* Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Pha lỗng thạch Có tác động kháng khuẩn chống lại nhiễm khuẩn phẫu thuật Drago cộng [39] 2014 P-PRP* Enterococcus faecalis, Streptococcus oralis, Streptococcus, Staphylococcus aureus MIC PRP có khả kháng lại tất chủng vi khuẩn thí nghiệm Itravia cộng [56] 2014 P-PRP*/ L-PRP* Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus Time-kill Giảm có ý nghĩa phát triển tất chủng vi khuẩn, tương đồng hai loại PRP Rozalski cộng [81] 2013 P-PRP* (1-3 ngày sau hạn sử dụng) Staphylococcus aureus Thí nghiệm time-kill, MIC thí nghiệm ức chế màng sinh học PRP thể khả kháng khuẩn tốt Drago cộng [40] 2013 P-PRP* Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Streptococcus agalactiae, Streptococcus oralis MIC PRP có khả kháng Enterococcus faecalis, Candida albicans, Streptococcus agalactiae, Streptococcus oralis; Chen cộng [32] 2013 PRP** Staphylococcus aureus,
 Escherichia coli,
 Pseudomonas aeruginosa Phương pháp pha loãng Khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus; tác động đồng vận kháng vi khuẩn PRP kháng sinh Tác giả Năm Loại Đối tượng vi khuẩn Thí nghiệm Kết Burnouf cộng [28] 2013 PRP*, tiểu cầu dung giải Escherichia coli,
 Enterobacter cloacae,
 Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,
 Bacillus subtilis, Bacillus cereus Khuếch tán qua thạch PRP kháng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Tohidnezhad cộng [94] 2012 P-PRP* Escherichia coli,
 Bacillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis Thí nghiệm khuếch tán PRP thể khả kháng loại vi khuẩn thí nghiệm Anitua cộng [12] 2012 P-PRP* L-PRP* Staphylococcus aureus,
 Staphylococcus epidermidis Time-kill Có khả kháng vi khuẩn vài tiếng tác dụng, tiềm sử dụng cho hậu phẫu Yang cộng [107] 2010 L-PRP* Staphylococcus aureus,
 Escherichia coli,
 Pseudomonas aeruginosa Time-kill PRP khơng có tác dụng kháng vi khuẩn thí nghiệm *Máu từ người tình nguyện khoẻ mạnh, **Từ bệnh nhân đái tháo đường, ***Từ hai nhóm bệnh nhân: khoẻ mạnh viêm nha chu mạn, ****Vi khuẩn nuôi cấy trực tiếp từ mẫu lâm sàng Các nghiên cứu tính kháng khuẩn PRP cách gần 20 năm ngày phát triển, đa dạng chủng vi khuẩn khác Các vi khuẩn nghiên cứu chủ yếu chủng vi khuẩn thương mại, ngoại trừ số nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn nuôi cấy trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm Vi khuẩn xuất nhiều nghiên cứu Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) Đây vi khuẩn phổ biến người, người ta ước tính 1/2 dân số người lớn bị nhiễm vi khuẩn Nó khơng gây bệnh nằm da khoẻ mạnh, nhiên xâm nhập vào máu nội mô, vi khuẩn gây tình trạng nhiễm trùng nghiêm trọng Tụ cầu vàng nguyên nhân hàng đầu viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, nhiễm trùng da, mô mềm, nhiễm trùng máu, phổi, hay chí gây nhiễm trùng phận giả gắn vào thể Hơn nữa, MRSA Staphylococcus aureus cịn có khả kháng methicillin, nafcillin, oxacillin, cephalosporins [95] Do đó, việc phịng ngừa đối phó với vi khuẩn này, lĩnh vực phẫu thuật, quan trọng Đối với vi khuẩn nha chu, có nghiên cứu thực tính kháng khuẩn lên nhóm vi khuẩn [3], [17], [106] Vi khuẩn sử dụng nghiên cứu chủng có sẵn phịng thí nghiệm Các chủng vi khuẩn thương mại giúp việc ni cấy đơn giản nhanh chóng, đồng thời dễ dàng so sánh kết nghiên cứu, nhiên độc lực vi khuẩn giảm sút trình cấy chuyền nhiều lần đơng khơ [106] Bên cạnh đó, hầu hết mẫu PRP thu thập từ máu người tình nguyện động vật khoẻ mạnh, có nghiên cứu Aggour cộng (2017) so sánh mẫu PRP hai nhóm khoẻ mạnh nhóm bệnh nhân [3] Theo Bảng 2.1, dù sử dụng phương pháp khác nhau, chủng vi khuẩn khác biệt, hầu hết nghiên cứu tác động kháng khuẩn PRP, coi vật liệu tiềm kháng khuẩn sau phẫu thuật CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thử nghiệm in vitro 2.2 Vật liệu nghiên cứu A Mẫu mảng bám nướu để nuôi cấy vi khuẩn Mảng bám nướu bệnh nhân viêm nha chu B Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm: - Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh đồng ý tham gia nghiên cứu - Nhóm bệnh nhân viêm nha chu 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu A Mẫu mảng bám nướu nuôi cấy vi khuẩn Thu thập mảng bám nướu nhóm bệnh nhân viêm nha chu (Nhóm 1) liên tục xuất khuẩn lạc, thoả mãn tiêu chuẩn sau: • Tuổi: 20-65 • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Được chẩn đốn viêm nha chu mạn mức độ trung bình nặng theo tiêu chuẩn phân loại Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 (Bảng 2.1) B Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm thoả mãn tiêu chuẩn sau: - Nhóm (Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh) (4 người) • Tuổi: 20-65 • Khoẻ mạnh, khơng có triệu chứng nhiễm khuẩn, khơng có bệnh tồn thân • Khơng có thói quen hút thuốc • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Tình trạng nha chu khoẻ mạnh, tất độ sâu khe nướu nhỏ 3mm khơng có tượng phù nề hay chảy máu nướu - Nhóm (Nhóm bệnh nhân viêm nha chu) (4 người): • Tuổi: 20-65 • Khơng có thói quen hút thuốc lá, khơng có bệnh tồn thân • Khơng sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước tham gia nghiên cứu tháng • Được chẩn đốn viêm nha chu mạn mức độ trung bình nặng theo tiêu chuẩn phân loại Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Phân loại mức độ viêm nha chu mạn Tiêu chuẩn Mức độ nhẹ Mức độ trung bình Mức độ nặng Độ sâu thăm dò >3mm 30% chiều dài chân >5mm Mất xương phim Nguồn: “American academy of Periodontology, 2015”[8] Người tham gia hai nhóm xét nghiệm công thức máu tổng quát tiến hành thu thập mẫu PRP để đảm bảo công thức máu bình thường khơng có bệnh lý tiểu cầu 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân không hợp tác, khó khăn việc cung cấp thơng tin, giao tiếp - Bệnh nhân có thai 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu phương pháp tiến hành 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Quy trình lấy mẫu nuôi cấy vi khuẩn thực theo phương pháp Doan Nguyen cộng (1999) [37] Chuẩn bị môi trường vận chuyển: 2ml Wilkins chalgren anaerobic broth base (Himedia - M863) vào ống ly tâm eppendorf Lấy mẫu: Cô lập vùng lấy mẫu gòn cuộn, làm mảng bám nướu, sử dụng 2-4 côn giấy cỡ 35-40 đưa vào túi nha chu từ 5mm trở lên, giữ 30 giây chuyển vào ống eppendorf chứa môi trường vận chuyển, đưa ống mẫu vào túi chứa gói tạo mơi trường kỵ khí (AnaeroPack®, Mitsubishi, Nhật Bản) chuyển phịng thí nghiệm cấy mẫu Cấy vi khuẩn từ mẫu: - Vi sinh vật tách học khỏi côn giấy với máy trộn Vortex mức cao 45 giây Phần huyền phù vi khuẩn pha loãng bậc 10 dung dịch vận chuyển Hình 2.1 Quy trình ni cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis - Sử dụng que trải tiệt trùng cấy dung dịch pha lỗng vào đĩa petri chứa mơi trường Wilkins Chalgren anaerobic agar có bổ sung 5% máu cừu (môi trường nuôi cấy) - Ủ đĩa petri túi kỵ khí bình GasPak 37ºC từ 7-10 ngày Sau ủ, khuẩn lạc có kiểu hình đặc trưng làm cấy chuyền, định danh phương pháp MALDI-TOF, thực trung tâm Oucru, Bệnh viện nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Sau có kết vi khuẩn cần tìm, gửi mẫu khuẩn lạc dung dịch Tris-EDTA giải trình tự với đoạn mồi đặc hiệu - Lưu trữ vi khuẩn môi trường nuôi cấy glycerol 25% điều kiện âm sâu (nitơ lỏng) 2.3.1.2 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu Quy trình thu thập PRP thực theo bước hướng dẫn nhà sản xuất Bước 1: Lấy ba ống máu, ống 8,5ml Hút 100µl để đếm tiểu cầu Bước 2: Đặt ba ống máu vào máy ly tâm Ly tâm mẫu chế độ 2000 vòng/phút 10 phút Đặt thêm ống nước 8,5ml để cân Bước 3: Thu tiểu cầu Lấy nhẹ nhàng ba ống máu khỏi máy ly tâm Dùng pipette hút nhẹ nhàng dịch màu vàng bên lớp hồng cầu cho vào ống khác Bước 4: Làm giàu tiểu cầu Ly tâm ống chứa dịch vàng chế độ 3500 vòng/phút vòng phút Sau hút nhẹ nhàng dịch màu vàng huyết tương nghèo tiểu cầu phía ống khác, vừa hút vừa huyền phù đều, chừa lại khoảng 5ml đáy ống Đếm số tiểu cầu cách hút khoảng 100µl PRP, pha loãng với dung dịch amoni oxalat cho vào buồng đếm hồng cầu Bước 5: Hoạt hoá tiểu cầu ống chứa chất hoạt hoá Ép khối đông đặc huyền phù Sử dụng xi lanh hút dịch PRP, gắn màng lọc ép dịch PRP qua màng lọc vào ống PRP thành phẩm Thu 4-5ml dịch PRP vô trùng Bước 6: Dán nhãn phân nhóm mẫu PRP hai nhóm người tham gia khoẻ mạnh bệnh nhân viêm nha chu 2.3.1.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu Quy trình thực cho mẫu PRP: - Pha lỗng dãy nhị phân chế phẩm PRP (180µl/giếng) với 0,9% saline bổ sung đĩa 96 giếng - Chlorhexidine gluconate 0,12% sử dụng chứng dương môi trường nuôi cấy không bổ sung huyết tương chứng âm - Với giếng, 20µl dung dịch huyền phù vi khuẩn pha loãng thêm vào Sau ủ kỵ khí nhiệt độ 37ºC 24 giờ, thêm vào giếng 20µl dung dịch resazurin đánh giá đổi màu dung dịch giếng Giá trị MIC nồng độ thấp dãy nồng độ thử nghiệm không làm đổi màu xanh resazurin Sử dụng resazurin đơn giản, cho kết nhanh chóng dễ dàng quan sát - Mỗi nghiệm thức thực giếng lặp lại lần với kết tương đồng 2.3.1.4 Thí nghiệm vi khuẩn bám vào đĩa ni cấy Quy trình thực cho mẫu PRP - Vi khuẩn phát triển qua đêm mơi trường ni cấy kỵ khí Tổng thể tích 150µl huyết tương dung dịch vi khuẩn cho vào giếng đĩa 96 giếng vô trùng xử lý bề mặt sẵn nhà sản xuất - Các giếng đối chứng chứa môi trường nuôi vi khuẩn tiến hành song song - Các đĩa ủ kỵ khí 24 nhiệt độ 37ºC Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa dung dịch saline đệm phosphate (PBS) pH 7,2 Các vi khuẩn bám vào giếng cố định với methanol 15 phút thổi khơ Sau nhuộm giếng dung dịch tím kết tinh 0,1% phút Rửa nước cất Đĩa để khơ bổ sung 100µl ethanol 95% vào giếng Ly tâm lần Lấy máu tĩnh mạch Tách bỏ phần hồng cầu Ly tâm lần Hút bỏ PPP hoạt hố PRP ! Hình 2.2 Quy trình thu thập mẫu PRP - Độ hấp thụ giếng sau đo máy đọc phiến quang phổ bước sóng 595nm - Mỗi nghiệm thức thực giếng thí nghiệm lặp lại lần với kết tương đồng Hình 2.3 Thí nghiệm MIC Từ A-F: pha loãng 1/2 tới 1/64 dung dịch PRP Giếng 1-3: Mẫu PRP đối tượng thứ nhất, 5-7: Mẫu PRP đối tượng thứ hai, 9-11: Mẫu PRP đối tượng thứ ba Blank: Giếng chứa môi trường nuôi cấy (-): Giếng chứa dung dịch vi khuẩn, chứng âm (+): chứng dương CHX: Dung dịch chlorhexidine, chứng dương PVD: Dung dịch povidine, chứng dương 2.3.1.5 Thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học Quy trình thực cho mẫu PRP: - 150µl dung dịch vi khuẩn cho vào giếng đĩa 96 giếng vơ trùng có xử lý bề mặt - Ủ kỵ khí nhiệt độ 37ºC 48 - Lấy bỏ dịch nuôi cấy, thay 150µl PRP vào giếng Các giếng đối chứng thay 150µl mơi trường ni cấy - Ủ kỵ khí nhiệt độ 37ºC Sau lấy bỏ dung dịch, rửa dung dịch saline đệm phosphate (PBS) pH 7,2 Cố định với methanol 15 phút thổi khơ Sau nhuộm dung dịch tím kết tinh 0,1% phút Rửa nước cất Đĩa để khô bổ sung 100µl ethanol 95% vào giếng - Độ hấp thụ giếng sau đo máy đọc phiến quang phổ bước sóng 595nm - Mỗi nghiệm thức thực giếng thí nghiệm lặp lại lần với kết tương đồng 2.3.2 Phương tiện nghiên cứu 2.3.2.1 Thiết bị nghiên cứu - Bình chứa ni tơ lỏng - Cân phân tích (Sartorius, Đức) - Cân điện tử (Javeder, Đài Loan) - Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật Bản) - Máy đo mật độ quang học (MicroLab, Ấn Độ) - Máy đo pH (Trans Instrument, Singapore) - Máy khuấy từ gia nhiệt (Stuart, Anh) - Máy lắc tròn (Logex, Mỹ) - Máy lắc vortex (Digisystem laboratory instrument, Đài Loan) - Máy ly tâm (Unicare US-06S) - Nồi hấp khử trùng (Hirayama, Nhật Bản) - Tủ ấm (N-Biotek, Hàn Quốc) - Tủ cấy vi sinh (Aura vertical, Ý) - Tủ sấy (Memmert, Đức) - Tủ lạnh, tủ đơng 2.3.2.2 Hố chất Wilkin chalgren anaerobic broth, agar A, hemin, menadione, resazurin, serum bò, máu cừu, TE buffer, chlorhexidine 0,12%, povidine 10%, ethanol 96%, tím kết tinh, dung dịch saline 0,9%, glycerol 25%, dung dịch PBS, methanol, paraffin 2.3.2.3 Dụng cụ nghiên cứu Bình thuỷ tinh 500ml, chai trung tính, ống đong, cốc đong, đĩa petri 90mm, ống nghiệm thuỷ tinh 18mm, ống falcon, que trải, que cấy, kẹp gắp, ống ly tâm eppendorf, bình GasPak, đĩa 96 giếng xử lý bề mặt, đầu típ xanh, vàng, pipette, màng lọc sợi thuỷ tinh, túi kỵ khí, lam kính, buồng đếm tế bào, đèn cồn, bơng 2.4 Xử lý, phân tích số liệu Kết ni cấy trình bày dạng hình ảnh Kết thí nghiệm trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± ĐLC) Sử dụng kiểm định phi tham số Wilcoxon để so sánh khác biệt nhóm Giá trị p0,05* p>0,05** *: Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê số lượng tiểu cầu máu tồn phần nhóm bệnh nhân viêm nha chu nhóm khoẻ mạnh **: Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê số lượng tiểu cầu PRP nhóm bệnh nhân viêm nha chu nhóm khoẻ mạnh *, **: Kiểm định phi tham số Wilconxon 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu PRP tất đối tượng tham gia nghiên cứu sau pha loãng bậc 2, biểu diễn từ tỉ lệ 1/2 tới tỉ lệ 1/64 Sau sử dụng resazurin để xác định MIC, PRP đối tượng tham gia nghiên cứu thể khả ức chế vi khuẩn nồng độ tối thiểu 1/2, có đối tượng người khoẻ mạnh có PRP thể nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn Porphyromonas gingivalis mức 1/4, qua đổi màu giếng có tỉ lệ pha lỗng tương ứng Kết thể Bảng 3.2 Hình 3.6 Bảng 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu PRP lên vi khuẩn thí nghiệm PRP MIC (biểu diễn tỉ lệ pha loãng PRP nồng độ tiểu cầu trung bình) Người khoẻ mạnh 1/4 (275,6 ×106/ml) Người khoẻ mạnh 1/2 (528,7×106/ml) Người khoẻ mạnh 1/2 (500,3×106/ml) Người khoẻ mạnh 1/2 (287,3 ×106/ml) Bệnh nhân viêm nha chu 1/2 (386,8 ×106/ml) Bệnh nhân viêm nha chu 1/2 (593,5×106/ml) Bện nhân viêm nha chu 1/2 (448,3×106/ml) Bệnh nhân viêm nha chu 1/2 (418,2 ×106/ml) 3.4 Thí nghiệm kháng bám dính vi khuẩn Nghiên cứu đánh giá tác động ức chế bám dính vi khuẩn Porphyromonas gingivalis lên đáy giếng đĩa 96 giếng Nồng độ PRP tất đối tượng thí nghiệm 50%, ủ đĩa 24 nhiệt độ 37ºC điều kiện kỵ khí Nồng độ tiểu cầu thí nghiệm trung bình nhóm người khoẻ mạnh 466,9 ×106/ml Nồng độ tiểu cầu trung bình nhóm bệnh nhân viêm nha chu 461,7×106/ml Kết cho thấy tất mẫu PRP làm giảm bám dính vi khuẩn lên đáy đĩa so sánh với nhóm chứng với p0,05 (Biểu đồ 3.1 3.2) Hình 3.6 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
 (A): Kết MIC người khoẻ mạnh thứ nhất, thứ hai thứ ba; (B): Kết MIC bệnh nhân viêm nha chu thứ nhất, thứ hai thứ ba; (C): Kết MIC người khoẻ mạnh bệnh nhân viêm nha chu thứ tư KM: Khoẻ mạnh, BN: Bệnh nhân, CHX: Chlorhexidine, chứng dương , PVD: Povidine, chứng dương (-): Nhóm chứng âm Giếng màu hồng: Sự diện vi khuẩn làm đổi màu xanh resazurin Giếng màu xanh: Khơng có mặt vi khuẩn, resazurin khơng đổi màu Tỉ lệ vi khuẩn bám dính (%) 120 100 100 * 80 * 72,5 * 60 * 58,9 53,8 50,2 40 20 Chứng KM KM KM KM Biểu đồ 3.1 Độ kháng bám dính vi khuẩn PRP nhóm khoẻ mạnh Biểu diễn phần trăm vi khuẩn bám dính nhóm chứng, n=4, sai số biểu diễn độ lệch chuẩn *: Kiểm định phi tham số Wilcoxon cho thấy có khác biệt độ giảm bám dính có ý nghĩa PRP đối tượng nhóm chứng (p