Thu nhận enzyme Lysozyme từ lòng trắng trứng và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN: THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỀ TÀI: THU NHẬN LYSOZYME TỪ LỊNG TRẮNG TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ BẢO QUẢN THỰC PHẨM GVHD: NGÔ ĐẠI NGHIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN: VÕ ĐƠNG PHÁT TP HỒ CHÍ MINH-2018 05001170074 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU ii DANH MỤC HÌNH ẢNH iii I TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử Lysozyme 1.2 Phân loại Lysozyme 1.3 Đặc tính Lysozyme .3 II Lysozyme chất kháng khuẩn 2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật Lysozyme 2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật .4 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme 2.3.1 pH 2.3.2 Nhiệt độ 2.3.3 Sự có mặt chất điện ly 2.3.4 Điều kiện canh trường III SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG .8 3.1 Đặc điểm kỹ thuật tách Lysozyme từ lòng trắng trứng 3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme 3.2.1 Bản chất sắc ký trao đổi ion 3.2.2 Nguyên tắc sắc ký trao đổi ion 10 3.2.3 Cơ sở lý thuyết để tách Lysozyme kỹ thuật sắc ký trao đổi cation .11 3.2.4 Ưu điểm nhựa Amberlite FPC 3500 sắc ký ion trao đổi tách Lysozyme từ lòng trắng trứng 12 3.2.5 Quy trình tách Lysozyme sắc ký trao đổi ion dương 13 IV ỨNG DỤNG LYSOZYME TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM 15 V KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 i DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.Phân loại Lysozyme Bảng Hàm lượng Lysozyme nguồn khác Bảng Đặc tính hóa học vật lý Lysozyme .3 Bảng Đặc điểm Protein lòng trắng trứng 12 Bảng Ảnh hưởng Lysozyme đến việc bảo quản loại thực phẩm .18 ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Một phần thành phần polysaccharide thành tế bào vi sinh vật Hình Chuỗi amino acid HEW Lysozyme Hình Mơ hình khơng gian Lysozyme Hình Cơ chế xúc tác Lysozyme Hình Bản chất sắc ký trao đổi ion 10 Hình Sắc ký trao đổi ion dùng phân tách Protein 11 Hinh Quy trình tách Lysozyme từ lòng trắng trứng sắc ký trao đổi Cation 14 iii I TỔNG QUAN Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) biết protein chống vi sinh vật lòng trắng trứng, lòng trắng trứng gà nguồn cung cấp dồi để sản xuất Lysozyme Lysozyme từ trứng gà thuộc Lysozyme type c, nghiên cứu nhiều Lysozyme biết enzyme phân cắt liên kết β –1,4 glycoside Lysozyme có hoạt tính chống Vi sinh vật rộng đặc biệt gram dương tăng phổ tác dụng đến gram âm Lysozyme dạng tinh khiết cao, chiết xuất tốt dùng để kéo dài thời gian bảo quản nhiều loại thực phẩm, chất bảo quản xem chất bảo quản an toàn thực phẩm Ngoài ra, Lysozyme sử dụng ngành dược phẩm kháng sinh tự nhiên 1.1 Lịch sử Lysozyme Lysozyme Alexander Fleming phát năm 1922 cách tình cờ phịng thí nghiệm ơng Ơng vơ tình bị chảy nước mũi vào đĩa petri có canh trường vi khuẩn ông thấy vi khuẩn bị phân giải Hiện tượng ông nghiên cứu cẩn thận enzyme Lysozyme xác định Năm 1965, David Chilton Phillips khám phá cấu trúc Lysozyme cách phân tích X quang độ phân giải Å Trong nhiều năm, phân tích X quang phương pháp phân tích Lysozyme tốt tính chất đặc biệt loại enzyme Thứ nhất, Lysozyme dễ tinh từ lòng trắng trứng Thứ hai, Lysozyme dễ kết tinh, không giống hầu hết lại protein khác Người ta dựa vào tính chất Lysozyme để tinh enzyme Và cuối cùng, tinh thể Lysozyme làm nhiễu xạ tia X với độ phân giải cao, loại cấu trúc protein có độ phân giải cao nhất: 0,94 Å 1.2 Phân loại Lysozyme Lysozyme lấy từ nhiều nguồn: vi sinh vật, virus, côn trùng, cây, động vật Người ta phân loại Lysozyme thành nhóm nhỏ dựa nguồn gốc, thứ tự acid amin chiều dài Lòng trắng trứng nguồn giàu Lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 g Lysozyme trứng Lysozyme lòng trắng trứng đại diện cho họ Lysozyme gọi Lysozyme type-c Những nghiên cứu cho thấy lớp biểu bì vỏ trứng chứa Lysozyme màng ngồi màng nhiều Lysozyme Lysozyme type-g có mặt loài chim Lysozyme type-c Lysozyme type-g có khối lượng phân tử khác trạng thái khác Lysozyme có mặt mơ động vật, huyết quan Lá lách gia súc chứa lượng Lysozyme lớn Lysozyme sữa bị có khối lượng phân tử với Lysozyme lịng trắng trứng hoạt độ gấp lần Lysozyme type-v (viral) Lysozyme virus, xác định khác với Lysozyme khác chỗ loại transglycosidase Lysozyme từ thực vật Lysozyme type-h type-b tùy thuộc vào nguồn gốc Lysozyme Bảng 1.Phân loại Lysozyme Loại Lysozyme Nguồn Tài liệu tham khảo Type-c Lòng trắng trứng gà Chipman Sharon, 1969 Type-g Các loài chim Prager Jolles, 1996 Type-h Thực vật Beintema cộng sự,1996 Type-b Thực vật Beintema cộng sự,1996 Type-i Động vật thân mềm, côn trùng Jolles Jolles, 1975 Bảng Hàm lượng Lysozyme nguồn khác Nguồn Lysozyme Lượng Lysozyme Lòng trắng trứng gà 2500-3500 μg/ml Lòng trắng trứng vịt 1000-1300 μg/ml Lòng trắng trứng ngỗng 500-700 μg/ml Nước mắt 3000-5000 μg/ml Sữa người 55-75 μg/ml Sữa bò 10-15 μg/ml Lá lách 50-160 mg/kg Tuyến tụy 20-35 mg/kg Nước ép đu đủ 8-9 μg/ml Nước ép bắp cải 7-8 μg/ml Nước mắt 2.6 mg/l 1.3 Đặc tính Lysozyme[5] Lysozyme lịng trắng trứng gà polypeptide 129 amino acid, có khối lượng phân tử 14,4 kDa có điểm đẳng điện 10.7 Lysozyme có liên kết disulfide vị trí Cys6-Cys127, Cys30-Cys115, Cys64-Cys80 Cys76-Cys94.Lysozyme có độ ổn định cao bốn liên kết disulfide chuỗi polypeptide enzyme làm protein có phân tử lượng nhỏ trở nên nhỏ gọn ổn định cao.Để trì hoạt tính enzyme cần hai bốn liên kết disulfide trì Hai bốn liên kết disulfide ổn định nhiệt, hoạt động giữ lại 100oC 1-2 phút Bảng Đặc tính hóa học vật lý Lysozyme Đặc tính Giá trị Khối lượng phân tử 14400 Da Amino acid 129 pI 10.7 Liên kết disulfide II Lysozyme chất kháng khuẩn 2.1 Hoạt tính chống Vi sinh vật Lysozyme.[2] Hoạt tính kháng khuẩn Lysozyme hiệu với vi khuẩn gram dương Thành tế bào vi sinh vật bao gồm chủ yếu lớp peptidoglycan.Vi khuẩn gram âm nhạy cảm với enzyme chúng có cấu tạo thành tế bào phức tạp Lớp peptidoglycan chất Lysozyme, bao phủ thêm bên lipoprotein, lipopolysaccharides peptide kỵ nước Lớp ngồi đóng vai trị rào cản để ngăn chặn enzyme tiếp cận đến vị trí hoạt động nó.Gần Lysozyme khơng tác dụng với vi khuẩn gram âm Các nghiên cứu để mở rộng phổ tác dụng Lysozyme thay đổi hiệu chỉnh Lysozyme hóa học kết hợp chất bảo quản khác Lysozyme kết hợp với peptide kị nước acid béo thành phần lysine, làm tăng thâm nhập phá vỡ màng vi khuẩn, giúp mở rộng phạm vi hoạt động Lysozyme với vi khuẩn gram âm, bao gồm Escherichia coli K12 (Ibrahim cộng sự, 1993, 1994) Glycosyl hóa mở rộng hoạt tính chống vi sinh vật đến vi khuẩn gram âm (Nakamura cộng sự, 1997) Thêm ethylene di - amine tetra acetic acid (EDTA) (Charter and Lagarde 2004 ), acid hữu cơ, nicin (Losso cộng sự, 2000) trypsin, lactoferrin (Baron Rehault,2007) giúp làm ổn định màng ngồi sinh vật Gram âm, cho phép Lysozyme xâm nhập qua màng ngồi từ mở rộng phổ hoạt tính Lysozyme Q trình đồng hóa áp suất cao thúc đẩy thay đổi cấu trúc vị trí hoạt động Lysozyme làm tăng hoạt tính kháng khuẩn chống lại Lactobacillus plantarum (Vannini cộng sự, 2004) 2.2 Cơ chế Lysozyme phá hủy thành tế bào vi sinh vật.[4] Lysozyme xúc tác trình thủy phân liên kết glycoside, liên kết axit Nacetylmuramic (NAM) N-acetylglucosamine (NAG) polysaccharides thành tế bào vi khuẩn Khi làm vậy, làm hư hỏng tính tồn vẹn thành tế bào hoạt động tác nhân diệt khuẩn Mối liên kết NAM-NAG với vị trí phân chia Lysozyme Hình Hình Một phần thành phần polysaccharide thành tế bào vi sinh vật, cho thấy luân phiên axit N-acetylmuramic (NAM) Nacetylglucosamine (NAG) Polysacharide chất cho Lysozyme, phân cắt liên kết glycoside vị trí định Lysozyme lịng trắng trứng gà chuỗi polypeptide đơn có độ dài 129 amino acid ( Hình ) với phân tử lượng 14400 Da Từ liệu X-Ray, thấy có khe rảnh cấu trúc Lysozyme (Hình 3) Trung tâm hoạt động nằm khe rảnh này.Trình tự amino acid Hình cấu trúc khơng gian Lysozyme Hình , chuỗi amino acid rảnh gấp lại Protein đánh dấu hình Hình Chuỗi amino acid HEW Lysozyme,với thành phần amino liên kết với đánh dấu màu xám Asp 52 Glu 35, thành phần trung tâm hoạt động, đánh dầu đỏ vàng tương ứng Hình Mơ hình khơng gian Lysozyme, thành phần đánh dấu Asp với màu đỏ, Glu màu vàng số chất liên kết với màu xám Trung tâm hoạt động Lysozyme rảnh dài có chứa đường polysaccharide thời điểm.Khi liên kết với polysaccharide, enzyme thủy phân liên kết glucoside Nếu đường đoạn polysaccharide đánh dấu từ A-F vị trí phân cắt D E Hình Hai mảnh polysaccharide giải phóng Hình mơ tả giai đoạn phản ứng này.Và mô tả chi tiết bên Hình Cơ chế xúc tác Lysozyme Lưu ý amino acid liên quan đến xúc tác (Glu 35 Asp 52 ) đề cập.Các giai đoạn đươc mô tả chi tiết (dựa Phillips, 1966) 1) Khi liên kết với enzyme, chất cần phải thay đổi cấu tạo hình dạng Ở vị trí D bị thay đổi cấu tạo (khơng thể sơ đồ) để chứa nhóm -CH2OH không gây tiếp xúc không thuận lợi với enzyme Bằng cách enzyme buộc chất chấp nhận cấu hình gần với trạng thái thay đổi 2) Amino acid vị trí 35 Glutamic acid (Glu 35) với proton mà dễ dàng chuyển tới cực nguyên tử oxy liên kết glycoside, cách liên kết C-O chất bị cắt (Hình 4a b) 3) Ở vị trí D chuỗi polysaccharide lúc có điện tích dương Phản ứng trung gian gọi axonium ion (Hình 4b) Enzyme ổn định chất trung gian theo cách Thứ nhất, nhóm cacboxylat Asp 52 gần nằm gần có điện tích âm, tương tác với điên tích dương oxonium ion (sự chia sẻ điện tích nguyên tử C O gọi cộng hưởng giống chia sẻ electron nguyên tử nhóm peptide).Như oxonium trung gian trạng thái chuyển tiếp Thông thường, trung gian không ổn định phản ứng.Asp 52 giúp ổn định oxonium ion khơng phản ứng với nó.Điều do, khoảng cách Å, nhóm phản ứng xa 4) Enzyme tách vị trí E với polysaccharide đính kèm nó, sản sinh chất Glycosyl-Enzyme trung gian Oxonium phản ứng với phân tử nước từ mơi trường,tạo nhóm hydroxyl tái proton hóa Glu 35.(Hình 4c d) 5) Enzyme giải phóng vị trí D với polysaccharide đính kèm phản ứng hồn thành 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Lysozyme, ví dụ như: pH, nhiệt độ, ion, khả tiếp cận với liên kết để phá hủy thành tế bào vi khuẩn… 2.3.1 pH Đối với Lysozyme lòng trắng trứng, thí nghiệm tiến hành dung dịch trung tính dung dịch acid, hoạt động Lysozyme dung dịch acid luôn mạnh so với mơi trường trung tính Sự ức chế hoạt động Lysozyme bắt đầu pH 5,7, pH tối ưu Lysozyme khoảng 6,2 khả dung giải tốt pH 6,0-7,0 (Boasson, 1938; Smolelis Hartsell, 1949) 2.3.2 Nhiệt độ Sự dung giải tế bào vi khuẩn Lysozyme lòng trắng trứng tăng tăng nhiệt độ đến 60oC (Smolelis Hartsell, 1949) 2.3.3 Sự có mặt chất điện ly Hoạt động dung giải Lysozyme lịng trắng trứng tốt có có mặt muối Ka với lực ion khoảng 0,1 (Salton, 1957) Lysozyme dung giải dung dịch muối Mg hay Ca so với dung dịch muối K Na (Smolelis Hartsell, 1949) 2.3.4 Điều kiện canh trường Sự dung giải tế bào vi khuẩn bao gồm phá vỡ cấu trúc bề mặt tế bào Vì thế, yếu tố ảnh hưởng đến bền cấu trúc bề mặt tế bào hay chất ngăn cản tiếp xúc Lysozyme chất ảnh hưởng đến hoạt động dung giải Lysozyme (Salton, 1957) III SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH LYSOZYME TỪ LÒNG TRẮNG TRỨNG 3.1 Đặc điểm kỹ thuật tách Lysozyme từ lịng trắng trứng.[5] Có nhiều phương pháp tách Lysozyme từ lòng trắng trứng phát triển.Hầu hết chúng tiến hành phịng thí nghiệm để có enzyme có hoạt tính cao số có tính khả thi quy mơ thương mại quy trình kết tủa kết tinh lọc màng , sắc ký gel, sắc ký lực, siêu lọc Phương pháp kết tủa phương pháp cổ điển phịng thí nghiệm quy trình thương mại để tách Lysozyme từ lòng trắng trứng dựa kết tủa trực tiếp enzyme với muối NaCl 5% Cần phải thực vài q trình hịa tan tái kết tinh để thu enzyme có độ tinh khiết cao Để giảm nồng độ muối phần lòng trắng trứng sau tách Lysozyme siêu lọc Nói đặc tính hóa lý Lysozyme, khối lượng phân tử thấp đặc điểm để kỹ thuật lọc màng có tính khả thi, đặc biệt kỹ thuật siêu lọc để tách Lysozyme Tuy nhiên, khả Lysozyme tĩnh điện liên kết với ovomucin protein tĩnh điện khác lòng trắng trứng giảm khả khuyếch tán qua màng Cơ chế nhận biết chất sở phương pháp sắc ký lực Chất hấp phụ sử dụng chitin, sau vật liệu cải tiến glucochitin chitosan sử dụng để phục hồi Lysozyme Kỹ thuật sắc ký lực không chập nhận để sản xuất quy mơ lớn chi phí cao, chọn lọc ligands, dòng chảy lòng trắng trứng khơng pha lỗng kém, quy trình rửa giải tốn kém, nhiều thời gian không đặc hiệu với protein khác lòng trắng trứng Điểm đẳng điện cao Lysozyme giúp tách enzyme khỏi protein lòng trắng trứng khác sắc ký trao đổi ion Việc ứng dụng nhựa trao đổi ion bước tiến hiệu việc tách enzyme Các loại hạt nhựa carboxymethyl cellulose (CMC), carboxymethyl-sephadex,… có mặt thị trường với mức giá vừa phải, sử dụng cho việc trao đổi thời gian dài Sấy thăng hoa sấy phun sử dụng để làm nước chế phẩm Lysozyme dạng lỏng.Cả hai kỹ thuật khơng giảm hoạt tính enzyme 3.2 Sắc ký trao đổi ion để tách Lysozyme 3.2.1 Bản chất sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion dựa tượng trao đổi thuận nghịch ion linh động pha tĩnh rắn với ion dung dịch phân tích cho dung dịch qua cột nạp đầy pha tĩnh.Pha tĩnh trường hợp gọi chất trao đổi ion (ionit).Bản chất trình tách lực khác ion dung dịch với nhóm chứa ion ionit Hình Bản chất sắc ký trao đổi ion 3.2.2 Nguyên tắc sắc ký trao đổi ion  Trước tiên protein gắn thuận nghịch với chất trao đổi tương tác ion nhóm mang điện tích trái dấu  Sau protein chiết rút riêng biệt nhờ việc tăng dần lực ion làm cho tương tác ion bị bẻ gãy thông thường dùng gradient muối NaCl hay gradient pH Bởi nhóm có chứa điện tích phân tử điều chỉnh được, điện tích bề mặt phụ thuộc nhiều vào pH dung dịch Trong trường hợp protein cấu tạo từ nhiều acid amin khác nhau, nên điện tích bề mặt thay đổi ta thay đổi pH bề mặt môi trường Một protein khơng chứa điện tích điểm pH pI Tuy nhiên ,Ở môi trường pH > Pi phân tử P thể tính axit cho ion H+, số điện tích âm lớn số điện tích dương , đa anion , tích điện âm Nếu pH2.6 mEq/g), sử dụng làm nhựa trao đổi cation Ưu điểm: Việc sử dụng nhựa Amberlite FPC 3500 dễ dàng hơn, đơn giản hiệu Amberlite FPC 3500 hoạt động tốt hơn CMC Một vấn đề nhựa CMC hạt mịn CMC bề mặt chất lỏng dẫn đến mát nhựa suốt bước cân rửa giải để nghiên cứu quy mơ cơng nghiệp Nhựa 12 Amberlite FPC 3500 có hạt lớn (0,3-1,18 mm so với đường kính 25-60 μm), giúp dễ dàng xử lý, có khả trao đổi ion cao (> 2,6 so với 1,0 mEq / mL), giá thành thấp nhựa cellulose CM Nhựa trao đổi cation CM-Toyopearl 650M có kích thước hạt nhỏ có khả trao đổi ion thấp giá thành cao nhựa Amberlite FPC 3500 (0.24 so với 2.6 mEq / mL) Do đó, Amberlite FPC 3500 loại nhựa trao đổi cation tốt cho Lysozyme tách lịng trắng trứng so với nhựa khác.Vì khơng có hóa chất thêm vào trứng, protein dung dịch trắng trứng Lysozyme khơng có thay đổi vật lý hóa học Như vậy, tách Lysozyme sử dụng nhựa FPC 3500 chọn làm bước cho tách ly nhiều protein lòng trắng trứng Sau loại bỏ Lysozyme, nhựa dễ dàng tái tạo cách rửa nhựa đến lần với thể tích 3% HCl, rửa đến lần với 10 thể tích nước cất, sau cân với 0,1 M glycine-NaOH đệm, pH 9,0 đến 9,3, trước sử dụng lại 3.2.5 Quy trình tách Lysozyme sắc ký trao đổi ion dương.[6] Trứng gà trắng pha loãng với lượng nước cất tương ứng, bổ sung nhựa Amberlite FPC 3500 (0,5 g / 10 ml lịng trắng trứng lỗng), sau hỗn hợp khuấy 12 phòng lạnh (4°C) cách sử dụng máy khuấy với tốc độ thấp (RW20 digital, IKA Works Inc., Wilmington, NC) Dung dịch lọc qua giấy lọc (cho quy mơ phịng thí nghiệm) ly tâm cho 3.400 g 20 phút 4°C (để nghiên cứu cho quy mô lớn) nhựa thu lại rửa nhiều lần với nước cất, sau lần với 0,1 M glycine-NaOH đệm, pH 9,3 Lysozyme bị giữ lại nhựa rửa dung dịch 0,1 M Glycine-NaOH, pH 9,3, chứa 0.5 M NaCl Dung dịch rửa giải khử muối cách sử dụng phận siêu lọc trang bị hộp sợi rỗng (kích cỡ 10 kDa) Sau đem sấy thăng hoa sấy phun để bảo quản Hoạt tính Lysozyme kiểm tra phương pháp ELISA Vidal cộng (2005) Phương pháp cho hiệu suất tốt lên đến 88% độ tinh khiết 95% 13 Lòng trắng trứng đồng Bổ sung nhựa Amberlite FPC 3500 (0,5 g / 10 ml) sau lắc 12 4oC Tái tạo nhựa, nhựa rửa với nước, đệm glycineNaOH pH=9.3,Rửa giải với với 0,1 M glycine-NaOH đệm, pH 9,3, chứa 0,5M NaCl Khử muối tiến hành sấy thăng hoa sấy phun Lysozyme , Kiểm tra hoạt tính với phương pháp ELISA Hinh Quy trình tách Lysozyme từ lòng trắng trứng sắc ký trao đổi Cation 14 IV ỨNG DỤNG LYSOZYME TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM[3] Lysozyme có số tính chất thích hợp để ứng dụng thực phẩm, protein bền nhiệt hoạt động khoảng (1-100oC) có khả hoạt động sau đến phút nhiệt độ sơi Do ổn định suốt q trình sấy phun sấy thăng hoa.Nó khơng bị bất hoạt dung mơi khơng hoạt tính hịa tan nước Nó có chứng minh hoạt động khoảng pH 4-10 (Chung and Hancock, 2000) Cheese: ứng dụng biết nhiều Lysozyme công nghiệp thực phẩm, để kiểm soát phát triển vi sinh vật gây hư hỏng (Bevilacqua cộng sự, 2010; Doosh Sawsan, 2014).Việc sử dụng Lysozyme việc sản xuất hard cheese semi-hard cheese nghiên cứu vào đầu năm 1980 với việc Pháp nước cho phép ứng dụng công nghiệp Lysozyme sản xuất phô mai Cộng đồng Châu Âu năm 1995 cho phép sử dụng chất bảo quản phơ mai (E1105) mà khơng có giới hạn liều nào, điều có nghĩa việc thêm Lysozyme cần thiết để ngăn ngừa hư hỏng.Từ trở đi, dùng để thay Nitrate (Schneider cộng sự, 2011) công nhận sản phẩm tự nhiên hiệu chống Clostridium tyrobutyricum, loại vi khuẩn gây hương vị không mong muốn tượng nở hoa muộn (late blowing) cheese (Pellegrino Tirelli, 2000) Trong trình ủ chín cheese, tượng nở hoa muộn xảy Clostridium tyrobutyricum tiến hành lên men butyric.Sự chuyển hóa acid lactic dẫn đến sản sinh axit hữu khác khí H2 CO2 Sự tích tụ khí dẫn đến tạo thành lỗ khí vết nứt cho cheese Các thông số công nghệ, pH, hoạt tính nước, hàm lượng muối, nhiệt độ chín, ảnh hưởng đến hoạt động Lysozyme Clostridium spp Ví dụ, Nồng độ ion cao (muối 0.2 M) ức chế ảnh hưởng hiệu Lysozyme (Chung Hancock, 2000) Liều Lysozyme 25g / l sữa ngăn ngừa tượng nở hoa muộn thời gian 60 ngày 15 ° C (59 ° F) Lượng Lysozyme phô mai thường dao động từ 50 đến 350 mg / kg phô mai (Avila cộng sự, 2014) Lysozyme có tính đặc hiệu cao để ngăn ngừa vi khuẩn gây ô nhiễm mà không ức chế q trình ủ chín, cịn góp phần làm tăng tốc độ ủ chín cheese Cụ thể, phân giải vi khuẩn gây hư hỏng bắt đầu giải phóng enzyme, đóng vai trị then chốt trình phân giải Protein suốt trình ủ chín (Abdou cộng sự, 2013) Rượu vang: Ngoài ứng dụng bơ sữa, việc sử dụng Lysozyme sử dụng cho rượu vang Vào năm 1999, sau phê duyệt lần năm 1997 Tổ chức Vine and Wine Quốc tế, Lysozyme thức cho phép chất thay tự nhiên bổ sung sulfur dioxide, hợp chất có độc tính cho người Lưu huỳnh dioxide khơng phải ln ln thay Lysozyme Lysozyme khơng thể hồn tồn tự ngăn ngừa hư hỏng vi sinh vật, Lysozyme có hiệu việc kiểm sốt, phần, chất nhiễm bẩn nấm men vi 15 khuẩn axetic gây axit dễ bay rượu vang (Liburdi cộng sự, 2014) Lysozyme sử dụng trình sản xuất rượu để ngăn ngừa hư hỏng vi khuẩn Gram dương để trì hỗn q trình lên men gây malolactic Cụ thể, Lysozyme sử dụng trình lên men rượu để hạn chế gia tăng vi khuẩn lactic không mong muốn, chủ yếu Pediococcus spp, Lactobacillus spp, and Leuconostoc mesenteroides, để kiểm sốt q trình lên men malolactic Quá trình lên men malolactic trình phụ thường xảy cuối q trình lên men,trong vi khuẩn Lactic tách cacboxyl L-malic acid, tự nhiên tìm thấy nho, từ dẫn đến L-malic acid giải phóng CO trình Malolactic lên men làm giảm axit rượu ổn định hoạt tính vi sinh vật (Carrillo cộng sự, 2014; Liburdi cộng sự, 2014) Quy định Ủy ban EC số 643/2006 quy định bổ sung tối đa tỷ lệ Lysozyme 500 mg / lít rượu (Commission Regulation, 2006) Lysozyme sử dụng giai đoạn khác sản xuất rượu vang liều khác nhau, dao động từ 100 đến 500 mg / L tùy thuộc vào mục tiêu (Carrillo cộng sự, 2014).Hoạt tính Lysozyme khơng bị ảnh hưởng đáng kể quy trình cơng nghệ thơng thường sử dụng sản xuất rượu vang Hơn nữa, enzyme không ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan rượu vang, khơng làm thay đổi màu rượu trắng suốt trình bảo quản chúng (Carrillo cộng sự, 2014) Cuối cùng, khơng gây bất lợi ảnh hưởng đến phát triển men Saccharomyces giai đoạn trình lên men (Roldán cộng sự, 2012) Tuy nhiên, Lysozyme ổn định loại rượu vang trắng so với rượu đỏ, hoạt tính kháng khuẩn Lysozyme vi khuẩn lactic khác với rượu vang trắng đỏ Trong rượu vang đỏ, Lysozyme bị tổn hại giải phóng polyphenol khỏi bã nho Lysozyme liên kết với tanin phenol khác rượu vang đỏ dẫn đến bất ổn định màu sắc hình thành chất kết tủa (Tirelli De Noni, 2007, Liburdi cộng sự, 2014) Khi Lysozyme có mặt sản phẩm cuối cùng,việc đưa chất gây dị ứng trứng phải ghi nhãn ghi nhãn rượu vang theo Quy định Ủy ban châu Âu số 579/2012 (Commission Regulation, 2012c) Bia: Việc sử dụng Lysozyme làm chất bảo quản bia phê duyệt (Commission Regulation, 2012b) Lysozyme có hiệu việc kiểm sốt phát triển vi khuẩn làm hỏng bia, đặc biệt vi khuẩn axit lactic Một số lượng hạn chế vi khuẩn axit lactic thích ứng với hoa bia có khả làm hỏng bia Lactobacillus brevis and Pediococcus damnosus nguyên nhân gây acid lactic diacetyl dẫn đến loại hương vị không mong muốn độ đục cao sản phẩm cuối Khi vấn đề ô nhiễm vi sinh vật sản xuất tiêu dùng, enzyme dùng giai đoạn khác trình sản xuất bia để tránh nhiễm kéo dài thời gian sử dụng (Vaughan cộng sự, 2005) Lysozyme, bổ sung vào bia nồng độ 100 ppm, có tác dụng ức chế mạnh mẽ vi khuẩn lactic có ổn định suốt thời hạn sử dụng mà không ảnh hưởng bất lợi đến hương vị 16 bia độ bền bọt (Silvetti cộng sự, 2010) Lysozyme hoạt động tốt vi sinh vật gram dương nồng độ 100 mg / L bia, khơng có tác dụng chống lại số loại vi sinh vật gây hư hỏng khác (men Acetobacter aceti), Lysozyme cần thêm kết hợp phương pháp bảo quản khác, để đảm bảo ổn định bia suốt trình bảo quản (Franchi đồng sự, 2012) Các ứng dụng khác: Lysozyme sử dụng chất chống vi sinh vật hiệu việc kéo dài thời hạn sử dụng số thực phẩm bao gồm rau tươi, cá, sản phẩm cá chế biến, thịt, thịt chế biến, trái hải sản Các tính chất kháng vi sinh vật Lysozyme việc sử dụng chúng để kiểm soát tốt trình lên men vi sinh vật hư hỏng chế biến thực phẩm khác trình bày Bảng Đặc biệt Lysozyme có hiệu chống lại vi khuẩn gây bệnh cho gia súc gia cầm, kiểm sốt hình thành độc tố Clostridium botulinum cá, gia cầm nhiều loại rau củ (Hughey cộng sự, 1989, Natress cộng sự, 2001, Sung cộng sự, 2011, Juneja cộng sự, 2012) Hiện tượng giảm trọng lượng hơ hấp hư hỏng, giảm cách phủ Lysozyme bề mặt (Han cộng sự, 2008) Bao bì hoạt tính sinh học: Lysozyme đại diện cho chất bảo quản sinh học nghiên cứu nhiều Khơng giống hệ thống bao bì thông thường, kéo dài thời hạn sử dụng, bao bì chống vi sinh vật biết đến bao bì hiệu có khả giết ức chế vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm Hệ thống cho phép kiểm soát giải phóng Enzyme với tỷ lệ phù hợp từ màng bề mặt thực phẩm, nơi mà phản ứng gây hư hỏng diễn mạnh mẽ Sự giải phóng bền vững cho phép trì nồng độ cần thiết để ức chế phát triển vi sinh vật trình bảo quản thực phẩm Lysozyme kết hợp vào vật liệu đóng gói thực phẩm có khả kéo dài thời hạn sử dụng thực phẩm không đông lạnh, ướp lạnh chế biến tối thiểu cách ngăn ngừa nhiễm bẩn phát triển vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm sinh vật gây bệnh (Leśnierowski Cegielska-Radziejewska, 2012; Alhazmi cộng sự, 2014) Việc bổ sung Lysozyme polymeric matrix hỗ trợ cố định, hấp thụ áp dụng thành công Một vài vật liệu chitosan, alginate, gelatin, carrageenan, whey protein, sodium caseinate, soy protein, vật liệu nhựa, polyvinyl alcohol and cellulose acetate, sử dụng làm chất mang Lysozyme (Bayarri cộng sự, 2014) Các màng hoạt tính có chứa Lysozyme phát triển Ví dụ phân tử Lysozyme kết hợp với chuỗi methoxyl pectin hình thành nên nhiều phức hợp phân tán đồng màng Lysozyme màng nhắm tới vi sinh vật nhạy cảm với Lysozyme số chủng Bacillus spp Và Clostridium spp Có thể sản xuất pectinolytic enzyme sản phẩm có chứa trái rau (Bayarri cộng sự, 2014) 17 Bảng Ảnh hưởng Lysozyme đến việc bảo quản loại thực phẩm Sản phẩm Ảnh hưởng Liều dùng Ức chế Listeria monocytogenes 1000 μg/mL Sản phẩm từ sữa: Sữa Ức chế Bacillus anthracis mg/mL Hard cheeses Ức chế C tyrobutyricum 50–350 mg/kg Italian mozzarella Ức chế Hafnia alvei kéo dài thời hạn sử dụng kết hợp với disodium ethylenediaminetetraacetic acid 0.0078 g/L cheese Thịt sản phẩm từ thịt: Thịt heo Ức chế Brochothrix thermosphacta Carnobacterium spp Sử dụng độc lập kết hợp với nisin 130–195 μg/cm2 Ức gà Kéo dài thời gian sử dụng mg/mL Xúc xích Ức chế B thermosphacta, L mesenteroides, Lactobacillus sakei 25.5 g/L of Lysozyme–nisin bologna Ức chế L monocytogenes sử dụng kết hợp với nisin and ethylenediaminetetraacetic acid Thịt bò xay Ức chế B anthracis mg/g Fillet cá da trơn Ức chế L monocytogenes mg/mL of water Các sản phẩm từ cá hồi Ức chế L monocytogenes mg/mL of water (1:3) Cá sản phẩm từ cá: Trái rau quả: 18 Rau tươi Ức chế L monocytogenes 100 mg/kg Kiểm sốt phịng ngừa lên men malolactic 100–150 mg/L Ổn định rượu vang sau trình lên men malolactic, bảo vệ rượu vang suốt trình lên men rượu chưa đạt yêu cầu 250–300 mg/L Ức chế hoàn toàn lên men malolactic 500 mg/L Ức chế vi khuẩn sinh lactic 100 mg/kg Đồ uống có cồn: Rượu vang Bia V KẾT LUẬN  Lysozyme enzyme có đặc tính chống vi sinh vật tìm thấy rộng khắp từ mô động vật thực vật đến VSV  Hiện nay, Lysozyme từ lòng trắng trứng gà Lysozyme ứng dụng công nghiệp công nghiệp thực phẩm  Lysozyme phân cắt liên kết β-1,4-glycoside axit N-acetylmuramic Nacetylglucosamine peptidoglycan, thành phần cấu tạo thành tế bào vi khuẩn  Lysozyme có hiệu chủ yếu chống lại vi khuẩn Gram dương, phổ mở rộng theo hướng Gram âm, thơng qua hiệu chỉnh, hóa học, kết hợp với chất bảo quản khác  Sắc ký trao đổi ion có nhiều ưu điểm so với phương pháp khác kỹ thuật hiệu để tách Lysozyme khỏi Protein khác lịng trắng trứng với chi phí vừa phải phù hợp cho hiệu đạt 88% với độ tinh khiết cao 95% phù hợp cho quy mô thương mại  Sự an tồn ổn định cơng nghệ Lysozyme làm trở thành chất bảo quản lý tưởng cho cơng nghiệp thực phẩm, gây dị ứng Hội Đồng Châu Âu yêu cầu phải ghi nhãn  Trong trình sản xuất phomai, Lysozyme ngăn ngừa phát Clostridium tyrobutyricum, nguyên nhân gây tượng nở hoa muộn (late blowing) phô mai Sự nở hoa muộn tạo thành khí suốt q trình lên mên butyric xảy q trình ủ chín phơ mai tạo nên kết không mong muốn như: lỗi cấu trúc thông qua phát triển 19 mắt có hình dáng khơng đúng, tạo mùi vị khơng mong muốn khối phơ mai bị vỡ hồn tồn  Lysozyme kiểm sốt phát triển vi sinh vật sinh lactic bia rượu vang  Các loại thực phẩm khác bảo quản cách phủ Lysozyme bề mặt 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO [ 21 ... Quy trình tách Lysozyme từ lòng trắng trứng sắc ký trao đổi Cation 14 iii I TỔNG QUAN Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) biết protein chống vi sinh vật lòng trắng trứng, lòng trắng trứng gà nguồn... Lysozyme thành nhóm nhỏ dựa nguồn gốc, thứ tự acid amin chiều dài Lòng trắng trứng nguồn giàu Lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 g Lysozyme trứng Lysozyme lòng trắng trứng đại diện cho họ Lysozyme. .. Jolles, 1975 Bảng Hàm lượng Lysozyme nguồn khác Nguồn Lysozyme Lượng Lysozyme Lòng trắng trứng gà 2500-3500 μg/ml Lòng trắng trứng vịt 1000-1300 μg/ml Lòng trắng trứng ngỗng 500-700 μg/ml Nước