CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨYPOLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝNƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝ NƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NI CÁ TRA Nghiên cứu sinh thực LÊ QUANG KHÔI Khóa: 2011 – 2015 Cần Thơ, 9/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝ NƯỚC – ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA Người hướng dẫn khoa học PGS.TS HÀ THANH TOÀN Nghiên cứu sinh thực LÊ QUANG KHƠI Khóa: 2011 – 2015 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Cần Thơ, 9/2013 ii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH HÌNH iii DANH SÁCH BẢNG iii TÓM LƯỢC iv BẢNG CHÚ THÍCH v CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Phospho tác động chúng đến chất lượng nước .1 Sự hấp thu giải phóng phospho hịa tan Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra Mục đích chuyên đề Yêu cầu chuyên đề CHƯƠNG 2: QUÁ TRÌNH LOẠI BỎ PHOSPHO HỊA TAN Loại bỏ phospho hóa chất 2 Cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat Loại bỏ phospho đường sinh học thơng qua q trình EBPR 11 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 Phương tiện nghiên cứu 14 1 Thiết bị, dụng cụ 14 Nguyên vật liệu .15 Phương pháp nghiên cứu 15 Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P 15 2 Chụp kính hiển vi điện tử truyền quét (Transmission Electron Microscopy) 15 3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase (ppk 1) .16 Định danh dòng TGT025L 17 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường tổng hợp 17 i Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Thí nghiệm loại bỏ phosphat nước ao ni cá tra (qui mơ 10 lít) 18 Thí nghiệm loại bỏ phosphat nước ao ni cá tra 100 lít .19 Phương pháp phân tích 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .20 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn phân lập .20 1 Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat 20 dòng vi khuẩn 20 Kết chụp TEM 20 Kết PCR 21 4 Kết định danh 22 Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường tổng hợp 23 Sự biến đổi số pH theo thời gian 23 2 Sự biến đổi số OD.600 nm hàm lượng PO43- theo thời gian 23 Kết loại bỏ phosphat nước ao nuôi cá tra 25 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian thí nghiệm qui mơ 10 lít 25 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian thí nghiệm qui mơ 100 lít 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 Kết luận 28 Đề nghị 28 Tài liệu tham khảo .29 ii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Hệ thống tăng cường loại bỏ phospho sinh học (van Loosdrecht et al., 1997) .11 Hình 2: Các đặc điểm sinh hóa q trình EBPR .12 Hình 3: Ảnh chụp TEM dòng TGT025L 21 Hình 4: Sản phẩm PCR dịng vi khuẩn gel agarose 1,2 % 21 Hình 5: Cây phả hệ dịng vi khuẩn xây dựng dựa trình tự 16S rRNA .22 Hình 6: Biến đổi pH theo thời gian dòng vi khuẩn 23 Hình 7: Sự biến đổi hàm lượng PO43- số OD.600 nm theo thời gian .24 Hình 8: Hiệu suất loại bỏ phosphat dòng vi khuẩn 25 Hình 9: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian .26 Hình 10: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian nghiệm thức .27 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Hóa chất thường dùng để trầm orthophosphat sản phẩm chúng Bảng 2: Chỉ số sinh học hóa học để đánh giá khả loại bỏ phospho Bảng 3: Acid béo hịa tan hình thành bể kỵ khí .11 Bảng 4: Cấu trúc phân tử đơn vị cấu tạo nên poly-β-hydroxyalkanoates .12 Bảng 5: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk 16 Bảng 6: Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường .20 Bảng 7: Kết định tên dịng vi khuẩn dựa trình tự gen 16S rRNA .22 iii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học TÓM LƯỢC Loại bỏ hay chuyển hoá phospho đường sinh học phương pháp phổ biến áp dụng Một số lồi vi sinh vật dị dưỡng có khả hấp thu phosphat dự trử chúng dạng polyphosphat nội bào chúng gọi vi sinh vật tích lũy polyphosphat (polyphosphate accumulating organisms-PAOs) Trong đó, vi khuẩn tích lũy polyphosphat nhóm vi khuẩn có vai trị quan trọng xử lý nước thải đường sinh học Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphat nội bào, góp phần vào q trình loại bỏ phospho hịa tan nước Mục đích chun đề tìm hiểu q trình loại bỏ phosphat hịa tan vi sinh vật tuyển chọn dòng vi khuẩn phân lập có hiệu suất loại bỏ phosphat cao để ứng dụng xử lý phospho hòa tan nước phạm vi phịng thí nghiệm Trong số 20 dịng vi khuẩn phân lập tuyển chọn ban đầu, có dịng có khả làm giảm nhanh hàm lượng phosphat với hiệu suất loại bỏ từ 55,3 tới 76,6% sau 36 chủng vi khuẩn vào môi trường nước thải tổng hợp Kết thí nghiệm ứng dụng dịng vi khuẩn để loại bỏ phosphat cho thấy rằng, dịng TGT013L TGT025L có khả làm giảm hàm lượng phosphat nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/l xuống cịn 4,1 2,6 mg/l sau 25 thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường tương ứng 76,5% 85,3% (ở pH khoảng pH 8,1; số OD.600 nm khoảng 0,6) Kết chụp TEM PCR cho thấy dòng vi khuẩn có gen đồng hóa phosphat thành dạng hạt poly-phosphat nội bào Chúng xác định có mối quan hệ gần gũi với Acinetobacter radioresistens Kurthia sp (cùng tỉ lệ tương đồng với trình tự 16S rRNA Genbank, 99%) Ứng dụng dòng vi khuẩn loại bỏ phosphat hịa tan nước ao ni cá tra Kết loại bỏ phosphat mơi trường mơ hình 10 lít có hiệu suất từ 75,6 đến 88,7% sau 36 giờ; mơ hình 100 lít từ 60,35 đến 80,90% sau 48 cấy bổ sung vi khuẩn với hàm lượng PO 43- cịn lại mơi trường thấp Hai dịng vi khuẩn có nhiều tiềm ứng dụng để xử lý phospho hịa tan nước Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphat, loại bỏ phosphat, nước ao cá tra iv Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học BẢNG CHÚ THÍCH ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long DPABs: Denitrifying polyphosphate accumulating bacteria (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ) EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường loại bỏ P sinh học) N: Nitơ P: Phospho PAB: Polyphosphate accumulating bacteria (vi khuẩn tích lũy poly-P) PHAs: Polyhydroxyalkanoates PHB: Polyhydroxybutyrate Poly-P: Polyphosphate TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét) SCFAs: Short chain fatty acids (axid béo mạch ngắn) v Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Nghề nuôi cá tồn 4000 năm vài kỷ mở rộng thành nghề nuôi trồng thủy hải sản nước nước mặn (Trần Bá Cừ et al., 2003) Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) mặt hàng xuất tiêu thụ nội địa quan trọng ngành thủy sản Đồng sông Cửu Long (Dương Tấn Lộc, 2006) Trong năm qua, nghề ni cá tra nói riêng ni thủy sản nói chung phát triển ngày mạnh mẽ, ngành thủy sản An Giang đạt mức tăng trưởng cao với kết vượt kế hoạch nhiều tiêu như: diện tích ni đạt 2.384 ha, tăng 24,3% so với kỳ, sản lượng 263.592 tấn, giá trị xuất 125.000 tấn, tương đương 335 triệu USD (Tạp chí Khoa học Cơng nghệ An Giang, số 06/2007) Nuôi trồng thủy sản đặc biệt cá tra, mạnh phát triển kinh tế Đồng Bằng Sông Cửu Long việc thải nước trực tiếp từ ao nuôi thủy sản ngồi mơi trường tự nhiên khơng thể kiểm sốt Do nguy nhiễm nguồn nước mặt điều không tránh khỏi Các nguồn gây ô nhiễm nước chủ yếu thức ăn tồn đọng, chất thải tiết cá, bùn đáy ao… Thành phần chất gây ô nhiễm chủ yếu protein, lipid, acid béo, photpholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng…(Nguyễn Văn Châu, 2008) Đây vấn đề mà ngành chức quan tâm tìm giải pháp hợp lý cho việc phát triển nghề nuôi thủy sản bền vững Q trình ni thủy sản dẫn đến tích tụ nhiều chất hữu ao ni nguyên nhân gây ô nhiễm cho thủy vực Sự phân giải chất hữu dư thừa làm cho nồng độ nitơ (N) phospho (P) hòa tan vượt mức chịu đựng thủy sản 1 Phospho tác động chúng đến chất lượng nước Phospho xác định yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sống P thành phần cấu tạo nên hợp chất quan trọng sống như: phân tử di truyền DNA, RNA; phân tử cấu trúc protein, lipid; phân tử dự trữ lượng cho tế bào ATP, poly-P…Tuy nhiên, P vừa yếu tố kiểm soát tăng trưởng phát triển sinh vật chúng nhân tố chủ yếu gây tượng phú dưỡng hóa Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả tăng sinh khối thủy sinh vật tảo, tảo lam…Bowman et al., (2007), rằng, lượng nhỏ P nước 0.1 mg/l trì thời gian dài gây phát triển mạnh mẽ tảo Sự biểu nhận biết rõ tượng bùng nổ tảo, Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học giảm hàm lượng oxy hòa tan kéo theo nước ô nhiễm nặng, cá chết, thực vật – động vật thủy sinh bị tiêu diệt Trong vài trường hợp, có xuất tảo độc Microsystis Sự dư thừa lượng dinh dưỡng nước làm gia tăng hoạt động vi sinh vật có hại Pfisteria Điều tác động đến kinh tế thông qua ảnh hưởng chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái ảnh hưởng đến sức khỏe người Sự hấp thu giải phóng phospho hịa tan Sự hấp thu giải phóng P hịa tan dạng phosphat phụ thuộc vào yếu tố nhạy cảm phản ứng oxy hóa khử điều kiện hiếu khí kỵ khí Trong điều kiện hiếu khí P hấp thu giải phóng trở lại điều kiện kỵ khí diện Fe3+/Fe2+ (Zhou et al., 2005) Trước đây, trình hấp thu P hòa tan xem trình loại bỏ đường hóa học (Peng et al., 2007) Tuy nhiên, nhiều chứng cho thấy trình sinh học đóng vai trị quan trọng (Gächter et al 1988) Bên cạnh xử lý P hòa tan đường hóa học, nhiều vi sinh vật có khả hấp thu lượng lớn phosphat tồn trữ chúng dạng poly-P nội bào Nhiều nghiên cứu cho hai q trình hóa học sinh học có vai trị quan trọng q trình hấp thu giải phóng phosphat (Khoshmanesh et al., 1999) Tác động vi khuẩn trình hấp thu giải phóng phosphat thơng qua đường trực tiếp như: phân hủy hợp chất hữu cơ, tích tụ phóng thích phosphat gián tiếp thơng qua q trình khống hóa (Davelaar 1993) Chính vậy, vi khuẩn tích lũy polyP xem xét sử dụng trình loại bỏ thành phần dinh dưỡng hệ thống xử lý nước thải (Mino et al., 1998), bên cạnh đó, chúng diện ao hồ tự nhiên (Davelaar 1993) Loại bỏ PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày ứng dụng đặc tính hữu dụng chúng là: dễ ứng dụng, hiệu mặt kinh tế thân thiện với môi trường sống Một số vi khuẩn có khả hấp thu tồn trữ P nguồn phospho nội bào, nguồn P cần thiết cho tế bào môi trường sống thiếu hụt phospho, chúng xem vi khuẩn tích lũy poly-phosphat Vi khuẩn tích lũy poly-phosphat biết đến vi sinh vật có khả hấp thu phosphat tự mơi trường đồng hóa chúng dạng hạt poly-phosphat (poly-P) nội bào Quá trình xem trình làm tăng cường loại bỏ P sinh học Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học - Vận hành lấy mẫu: Sụt khí giờ/ngày - đêm, sụt từ 7g30 sáng – 15g30 g chiều ngưng sụt khí 30 phút lấy mẫu Định kỳ 12 lấy mẫu lần kiểm pH, PO43- Thí nghiệm loại bỏ phosphat nước ao ni cá tra 100 lít Từ kết thí nghiệm trên, chọn lọc nghiệm thức loại bỏ phosphat tốt để tiến hành thí nghiệm Dịch vi khuẩn tiến hành nhân sinh khối lít mơi trường Filipe et al., (2001) (0,5 lít/dịng) Dịch huyền phù vi khuẩn có đạt số OD.600 nm đạt 0,6 sử dụng cho bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí thành nghiệm thức, lần lặp lại Tổng cộng có đơn vị thí nghiệm (100 lít/đơn vị [thùng]) Các đơn vị thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên xơ nhựa 200 lít Nghiệm thức (nghiệm thức đối chứng): mẫu nước ao nuôi cá tra không cấy bổ sung vi khuẩn Nghiệm thức thí nghiệm 1: mẫu nước ao ni cá tra có cấy bổ sung 1000 ml vi khuẩn, bao gồm 500 ml dòng + 500 ml dòng 2, ly tâm 5000 vòng/10 phút Thu sinh khối tế bào Hòa sinh khối 150 ml nước cất khử trùng, lắc Sau chủng vào đơn vị thí nghiệm (50 ml/đơn vị, tỉ lệ 1%) - Vận hành lấy mẫu: Sụt khí giờ/ngày - đêm, sụt từ 7g30 sáng – 15g30 g chiều ngưng sụt khí 30 phút lấy mẫu Định kỳ 24 lấy mẫu lần kiễm PO43- Phương pháp phân tích pH xác định pH kế (Eutech, 510) Hàm lượng PO 43- xác định thông qua phương pháp Molypdate blue (so màu bước sóng 880 nm máy Beckman Coulter DU 640B) Mật số vi khuẩn xác định thông qua số OD.600 nm máy quang phổ (Beckman Coulter DU 640B) phương trình tuyến tính số OD.600 nm mật số vi khuẩn [CFU, đếm phương pháp nhỏ giọt Hoben Somasegaran, (1982)] Số liệu thí nghiệm xử lý so sánh ANOVA với phép thử Turkey để tìm khác biệt trị số trung bình nghiệm thức phần mềm phân tích thống kê Minitab 16 19 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn phân lập 1 Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat 20 dòng vi khuẩn Bảng 6: Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường 20 dòng vi khuẩn Tên Hàm Hàm Hiệu Tên Hàm Hàm Hiệu dòng lượng lượng suất dòng lượng lượng suất 3333PO4 PO4 loại bỏ PO4 PO4 loại bỏ ban đầu lại (%) ban đầu lại (%) 36 36 TGT018L 19,8 10,4 47,5 KGT004L 20,3 16,8 17,1 TGH003L 19,9 16,6 16,6 CTH010L 19,7 17,9 9,0 TGT025L 19,8 4,6 76,6 AGH006L 20,3 9,0 55,8 STT011L 18,8 17,3 8,0 VLH013L 19,1 8,2 57,3 BTT003L 20,9 14,8 29,0 VLH002L 18,1 16,1 11,0 STH009L 20,3 13,2 35,1 DTT001L 20,5 13,6 33,5 BTT006L 20,7 9,2 55,3 CTT002L 18,2 13,9 24,0 TGT013L 19,7 5,6 71,3 DTT021L 22 20,8 5,6 CTH020L 20,1 13,9 30,7 AGT005L 19,8 15,7 20,7 TVT003L 21,6 20,2 6,4 BLH006L 19,1 14,9 22,0 Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat 20 dịng vi khuẩn tích lũy polyphosphat phân lập mơi trường Fillipe et al., (2001) Kết theo dõi ghi nhận sau 36 cho thấy dòng vi khuẩn có khả làm giảm hàm lượng PO 43-, có dịng có khả làm giảm mạnh TGT025L, TGT013L, VLH013L, AGH006L BTT006L với hiệu suất loại bỏ phosphat hòa tan 76,6; 71,3; 57,3; 55,8; 55,3 % sau 36 nuôi cấy bổ sung vi khuẩn môi trường (Bảng 6) Các dòng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Kết chụp TEM Kết chụp hình vi khuẩn kính hiển vi điện tử truyền quét (TEM) dòng TGT025L cho thấy mối tương quan đặc điểm hình thái cấu trúc bên tế bào Hình 20 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học (a) Vi khuẩn nuôi sau ngày môi trường tích lũy poly-P, sinh khối ly tâm sử dụng cho chụp TEM Lớp cắt mỏng (70 nm) có hạt nhuộm đậm màu điện tử xuất rãi rác khắp tế bào, thể diện hạt poly-P Điều cho thấy dịng TGT025L có khả hấp thu phosphat ngoại bào đồng hóa chúng thành hạt poly-P dự trữ tế bào Hình (b) Hình 3: Ảnh chụp TEM dịng TGT025L: [(a) (x20,000)], [(b) (x50,000)] Kết PCR Kết phân tích PCR với cặp mồi tổng 27F 1492R nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P cho thấy dòng vi khuẩn phân lập cho band DNA vị trí 1500bp hình (a] Kết nhận diện gen ppk cho kiểu gen ppk dạng IIA phù hợp với nghiên cứu He McMahon, (2011), dòng TGT025L TGT013 cho band DNA gần vị trí 105 bp [hình (b)] Hình 4: Sản phẩm PCR dòng vi khuẩn gel agarose 1,2 % (1) Thang chuẩn DNA 100 bp ladder marker; (2, 9) đối chứng âm; (3, 4, 5, 6, 7) sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA dòng vi khuẩn TGT025L, BTT006L, TGT013L, AGH006L VLH013L; (8) chuẩn DNA marker-C (100 - 1200 bp); (10, 11) sản phẩm PCR đoạn gen ppk dòng TGT013L TGT025L Ảnh chụp ngày 25/03/2013 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại học Cần Thơ 21 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học 4 Kết định danh Sử dụng chương trình BLASTN để tìm kiếm xác định trình tự gen 16S rRNA ngân hàng gen có độ tương đồng gần gũi với trình tự 16S rRNA dòng vi khuẩn phân lập Cây phả hệ cho thấy dòng TGT025L gần gũi với giống Kurthia sp (JQ398850) (Hình 5) với mức tương đồng 99% (Bảng 7) Bacilli Gamma-proteobacteria Actinobacteria Hình 5: Cây phả hệ dòng vi khuẩn xây dựng dựa trình tự 16S rRNA theo phương pháp Maximum Likehood [Chương trình MEGA5.0, (Tamura, 2011)] Bảng 7: Kết định tên dịng vi khuẩn dựa trình tự gen 16S rRNA Nhóm xếp loại dịng Lồi có quan hệ gần gũi Tỉ lệ tương đồng (%) Chiều dài (bp) Kurthia sp (JQ398850) 99 1114 Acinetobacter radioresistens (GU145275) 99 1277 Bacilli Planococcaceae TGT025L Gammaproteobacteria Moraxellaceae TGT013L 22 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Kết kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat môi trường tổng hợp Sự biến đổi số pH theo thời gian Theo dõi thay đổi số pH môi trường sau cấy bổ sung dòng vi khuẩn tuyển chọn vào môi trường Fillipe et al (2001) Kết quan sát cho thấy số pH có thay đổi rõ rệt theo thời gian nghiệm thức (Hình 6) Hình 6: Biến đổi pH theo thời gian dịng vi khuẩn Từ Hình cho thấy pH nghiệm thức có xu hướng gia tăng Trong đó, dịng TGT025L, TGT013L AGH006L cho thấy số pH môi trường tăng nhanh đạt 8,0 sau 20 ni cấy Sau đó, pH có xu hướng giảm nhẹ Filipe et al., (2001) chứng minh tăng trưởng phát triển PAO, trình loại bỏ phosphat, phân hủy PHAs điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng pH Khi pH thấp ảnh hưởng lên trình trao đổi chất PAB, tốc độ hấp thu phosphat khoảng 37% pH 7,5, bên cạnh tốc độ phân hủy PHAs tăng trưởng PAB giảm đáng kể pH giảm xuống 6,5 khả loại bỏ phosphat môi trường giảm theo Khi pH tăng 7,5 khơng có ảnh hưởng bất lợi lên PAB, mang lại ổn định trình EBPR 2 Sự biến đổi số OD.600 nm hàm lượng PO43- theo thời gian (a) (b) 23 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học (c) (d) (e) (f) Hình 7: Sự biến đổi hàm lượng PO 43- số OD.600 nm theo thời gian: (a) dòng TGT025L, (b) dòng AGH006L, (C) dòng TGT013L, (d) dịng BTT006L, (e) dịng VLH013L; (f) phương trình tuyến tính số OD.600 nm mật số vi khuẩn (CFU) Năm dòng vi khuẩn tăng sinh tốt môi trường Filipe et al., (2001) đạt mật số >108 (CFU) sau 25 nuôi cấy Trong 10 đầu dòng TGT013L, TGT025L AGH006L tăng sinh nhanh (OD.600 nm>0,4; tương đương mật số>10 CFU/ml) khác biệt với dòng BTT006L VLH013L (OD.60nm>0,2; tương đương mật số>10 CFU/ml) Sự tăng nhanh sinh khối dòng TGT013L, TGT025L AGH006L kéo theo hàm lượng phosphat cịn lại mơi trường thấp (hàm lượng PO 43- 15 mg/l) [Hình (a), (b), (c), (d), (e)] Sau 10 dịng có xu hướng tiếp tục tăng sinh đạt mật số tối đa [OD.600 nm>0,6; tương đương mật số >108 CFU/ml), Hình (f)] sau 25 Hiệu suất loại bỏ phosphat có biến động dòng vi khuẩn chúng thể khả khác cấy bổ sung vào môi trường khác (Filipe et al., 24 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học 2001) Trong thí nghiệm này, hàm lượng phosphat cịn lại mơi trường dịng vi khuẩn sau 25 thí nghiệm có khác biệt lớn (Hình 8) kết thể tương quan với kết Fillipe et al (2001) Usharani et al., (2011) Usharani et al., (2011) nghiên cứu khả loại bỏ phosphat hòa tan dòng vi khuẩn riêng rẽ hay có kết hợp ba dịng vi khuẩn lại với cho thấy rằng, dòng riêng rẽ Pseudomonas sp YLW-7 có hiệu suất loại bỏ phosphat cao đạt 68% Trong kết hợp dòng Pseudomonas sp YLW-7, Bacillus sp RS-1, Enterobacter sp KLW-2 hiệu suất loại bỏ đạt từ 63,4 đến 92,5% (tùy thuộc vào khác biệt nguồn carbon môi trường) sau 72 cấy bổ sung vi khuẩn Khi so sánh hiệu suất loại bỏ phosphat dịng vi khuẩn thí nghiệm, Hình cho thấy dịng TGT025L TGT013L có lực cao khả hấp thu PO43dẫn đến hiệu suất loại bỏ phosphat cao đạt 85,3% dòng TGT025L 76,6% dòng TGT013L sau 25 cấy bổ sung vi khuẩn, khác biệt có ý nghĩa thống kê với dòng BTT006L (51%), VLH013L (39,4%) AGH006L (29,4%) Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L Kurthia sp TGT025L chọn để ứng dụng xử lý phosphat nước ao ni cá tra Hình 8: Hiệu suất loại bỏ phosphat dòng vi khuẩn sau 25 nuôi cấy môi trường tổng hợp Dịng vi khuẩn có mẫu tự theo sau khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% (phép thử Turkey, Minitab 16) Kết loại bỏ phosphat nước ao nuôi cá tra Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian thí nghiệm qui mơ 10 lít Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L Kurthia sp TGT025L nuôi tăng sinh môi trường Fillipe et al (2001) có hàm lượng PO 43- ban đầu 25 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học khoảng 21 mg/l Sau nuôi vi khuẩn, phần lượng PO 43- vi khuẩn sử dụng để tăng sinh làm giảm nhẹ hàm lượng PO 43- dẫn đến có khác biệt hàm lượng PO43- ban đầu nghiệm thức thí nghiệm đối chứng (Hình 9) Hình 9: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian Theo dõi biến đổi hàm lượng PO 43- môi trường theo thời gian kiểm tra định kỳ sau 12 thí nghiệm Kết Hình cho thấy hàm lượng PO 43- có xu hướng giảm mạnh theo thời gian nghiệm thức thí nghiệm có khác biệt so với đối chứng Sau 12 hàm lượng PO43- lại môi trường nghiệm thức DC, TGT025L, TGT013L TGT013L + TGT025L 17,6; 8,7; 12,3 7,6 mg/l với hiệu suất loại bỏ 17,54; 50,89; 34,29 58,30% Điều cho thấy hàm lượng PO43- có giảm mạnh sau 12 Sự giảm hàm lượng PO43- tiếp tục quan sát sau 24 36 Sau 36 hàm lượng PO 43- lại nghiệm thức DC, TGT025L, TGT013L TGT013L + TGT025L 11,6; 4,3; 3,7 2,1 mg/l với hiệu suất loại bỏ 45,6; 75,6; 80,0 88,7% Kết thí nghiệm cho thấy rằng, nghiệm thức có phối hợp dòng vi khuẩn cho hiệu loại bỏ PO43- tốt Sự tương tác dòng vi khuẩn TGT013L TGT025L mang lại kết tốt bổ sung dòng vi khuẩn riêng rẽ điều quan sát Usharani et al., (2011) Tổ hợp dòng vi khuẩn sử dụng để xử lý nước ao nuôi cá tra qui mơ 100 lít 26 Chun đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian thí nghiệm qui mơ 100 lít Để hạn chế ảnh hưởng chất cịn lại mơi trường ni vi khuẩn cấy bổ sung vào nước ao nuôi cá tra Dịch huyền phù vi khuẩn ly tâm thu sinh khối Sinh khối hịa vào nước cất vơ trùng, sau cấy bổ sung vào nước ao ni cá tra Hàm lượng PO43- nước ao nuôi cá tra ban đầu khoảng 3,5 mg/l Hình 10: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian nghiệm thức Theo dõi biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian nghiệm thức DC thí nghiệm (TGT025L+TGT013L) Kết Hình cho thấy hàm lượng PO 43- có xu hướng biến đổi khác nghiệm thức DC thí nghiệm Ở nghiệm thức đối chứng có tăng nhẹ hàm lượng PO43- sau 24 đầu, sau giảm nhẹ trì hàm lượng khoảng 4,6 mg/l Ngược lại, nghiệm thức thí nghiệm hàm lượng PO 43- giảm theo thời gian Hiệu loại bỏ phosphat mơi trường nghiệm thức thí nghiệm đạt 33,69% sau 24 80,9% sau 48 cấy bổ sung vi khuẩn Hàm lượng phosphat hòa tan cịn lại mơi trường thấp [0,7 mg/l, (Hình 10)] Ở hàm lượng PO 43- hạn chế tăng trưởng phát triển mạnh mẽ tảo, nguyên nhân gây phú dưỡng hóa hạn chế hàm lượng oxy hòa tan nước (Boyd, 1998) 27 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Vi khuẩn tích lũy poly-phosphat nhóm vi khuẩn có vai trị quan trọng xử lý nước thải đường sinh học Chúng hấp thu lượng lớn phosphat hịa tan tích lũy thành poly-phosphat nội bào, góp phần vào q trình loại bỏ phospho hịa tan q trình xử lý Từ kết nghiên cứu cho thấy, dòng vi khuẩn tích lũy poly-P tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ phosphat hòa tan cao Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L Kurthia sp TGT025L cho hiệu loại bỏ PO43- cao môi trường tổng hợp sau 25 thí nghiệm Sự loại bỏ PO 43- thực hoạt động gen ppk dạng IIA q trình chuyển hóa phosphat thành dạng poly-P tích lũy tế bào Tổ hợp dịng vi khuẩn mang lại hiệu loại bỏ phosphat hịa tan nước ao ni cá tra cao hàm lượng PO43- cịn lại mơi trường thấp Kết nghiên cứu đăng kỷ yếu hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc diễn ngày 27 tháng năm 2013 Hà Nội Đề nghị Ứng dụng tổ hợp vi khuẩn xử lý phosphat hịa tan nước ao ni cá tra mơ hình thực tế 28 Chun đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Dương Tấn Lộc 2006 Để thị trường cá tra bền vững Tạp chí khoa học Cần Thơ 16 , 2023 Huỳnh Trường Giang, Vũ Ngọc Út Nguyễn Thanh Phương 2008 Biến động yếu tố môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh An Giang Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, (1),pp.1-9 Lê Anh Tuấn 2008 Nước cho nuôi trồng thủy sản chiến lược quy hoạch thủy lợi đa mục tiêu Đồng Bằng Sông Cửu Long Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 2, pp 205-209 Lê Bảo Ngọc 2004 Đánh giá chất lượng môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh xã Tân Lộc, huyện Thốt Nốt, Thành Phố Cần Thơ Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng, Luận văn cao học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Châu 2008 Bài giảng công nghệ xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản NXB Đại học Quốc gia TP HCM Trần Bá Cừ, Nguyễn Thu Hiền, Trần Bá Hoành, Trần Mạnh Kỳ, Đặng Văn Sử, Lê Đĩnh Thái, Nguyễn Văn Thân, Phạm Ngọc Thịnh 2003 Từ điển bách khoa sinh học, NXB Kỹ thuật, Chương Tiếng Anh Ahn J., S Schroeder, M Beer, S Mcllroy, R C Bayly, J W May, G Vasiliadis and R J Seviour 2007 Ecology of the Microbial Community removing Phosphate from Wastewater under Continuously Aerobic Conditions in a Sequencing Batch Reactor Applied and Environmental Microbiology, 73, pp.2257 - 2270 Auling G., F Pilz, H-J Busse, S Karrash, M Streichan and G Schon 1991 Analysis of the poly-P accumulating microflora in Prus eliminating, anaerobic-aerobic activated sludge systems by using Diaminopropane as a biomarker for rapid estimation of Acinetobacter spp Applied and Environmental Microbiology, pp 3585-3592 Barker P S., P C Dold 1996 Denitrification behavior in biological excess phosphorus removal activated sludge system Water res, 30, pp 769-780 Beer M., H M Stratton, P C Griffiths and R J Seviour 2006 Which are the polyphosphate accumulating organisms in full scale activated sludge enhanced biological phosphate removal system in Austalia? Applied of Microbiology, 100, pp 233-243 Bond P L., P Hugenholtz, J Keller And L L Blackall 1995 Bacterial community structure of phosphate removing and non-phosphate removing activated sludges from sequencing batch reactor Applied and Environmental Microbiology, 61(5), pp 1910-1916 Bond P L., R Erhart, M Wagner, J Keller, L L Blackall 1999 Identification of some of the the major groups of bacteria in efficient anf non-efficient biolical phosphorus removal activated sludge systems Appl Environ Microbiol., 65(9), pp 4077-4088 Boswell C D., R E Dick, H Eccles and L E Macaskie 2001 Phosphate uptake and release by Acinetobacter johnsonii in continuous culture and coupling of phosphate 29 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học release to heavy metal accumulation, Journal of industrial Microbiology & Biochechnology, 26, pp.33-340 Boyd C E 1998 Water quanlity for pond aquaculture Deparment of fisheries and apllied aquacultures aubum University Alabama 36849 USA Carr E H Eason, S Feng, A Hoogenraad, R Croome, J Soddell, K Lindrea and R Seviour 2001 RAPD-PCR typing of Acinetobacter isolates from activated sludge systems designed to remove phosphorus microbiologically Journal of Applied microbiology, 90, pp 309-319 Crocetti G R., P Hugenholtz, P L Bond, A Schuler, J Keller, D Jenkings, and L L Blackall 2000 Identification of Poly-P-Accumulating Organisms and Design of 16S rRNA-Directed Probes for Their Detection and Quantitation Applied and environmental microbiology, 66(3), pp.1175-1182 Davelaar D 1993 Ecological significance of bacterial polyphosphate metabolism in sediment Hydrobiologia, 253, pp.179–192 De Silva S S., B A Ingram, Phuong T Nguyen, Tam M Bui, Geoff J Gooley, Giovanni M Turchini 2010 Estimation of Nitrogen and Phosphorus in Effluent from the Striped Catfish Farming Sector in the Mekong Delta, Vietnam Royal Swedish Academy of Sciences(www.kva.se/en) Filipe C D M, G T Daigger, C P Leslie Grady Jr 2001 Stoichiometry and kinetics of acetate uptake under anaerobic conditions by an enrichment culture of phosphorus accumulating organisms at different pHs Biotechnology and bioengineering, 76(1), pp 32-43 Fuhs G W and M Chen 1975 Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for treatment of wastewater Microbial Ecol, 2(2), pp.119-138 Gächter, R., J S Meyer & A Mares 1988 Contribution of bacteria to release and fixation of phosphorus in lake sediments Limnology and Oceanography, 33, pp.1542–1558 Gloess S., H-P Grossart, M Allgaier, S Ratering and M Hupfer 2008 Use of Laser microdissection for phylogenetic characterization of polyphosphate accumulating bacteria Applied and Environmental Microbiology, 74(13), pp 4231-4235 He Shaomei and K D McMahon 2011 ‘Candidatus accumulibacter’ gen expression in response to dynamic EBPR conditions The ISME journal, 5, pp 329-340 He Shaomei, Daniel L Gall, and Katherine D McMahon 2007 “Candidatus Accumulibacter” Population Structure in Enhanced Biological Photphorus Removal Sludges as Revealed by Poly-P Kinase Genes Applied and Environmental Microbiology, 73, pp.5865 - 5874 Hesselmann R P W., C Werlen, D Hahn, J R van der Meer, A J B Zehnder 1999 Enrichment, phylogenetic analysis and detection of a bacterium that performs enhanced biological phosphrus removal im activated sludge Sust Appli Microbial., 22(3), pp 454-465 Hoben H J and P Somasegaran 1982 Comparison of the Pour, Spread, and Drop Plate Methods for Enumeration of Rhizobium spp in Inoculants Made from Presterilized Peat Applied and Environmental Microbiology, 44, pp 1246 – 1247 30 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ivanov V., V Stabnikov, W Q Zhuang, J H Tay and S T L Tay 2005 Phosphate removal from the retunred liquor of munucipal wastewater treatment plant using iron recucing bacteria Journal of Applied Microbiology, 98, pp 1152-1161 Kampfer P., R Erhart, C Beimfohr, J Bohringer, M Wagner and R Amann 1996 Characterization of bacterial communities from activated sludge: culture-dependent numerical identification versus in situ identification using group-and genus-specifc rRNA-targeted oligonucleotide probes Microbial Ecol., 32, pp.101-121 Khoshmanesh A., B T Hart, A Duncan, R Beckett 1999 Biotic uptake and release of phosphorus in a wetland sediment Environ Technol., 20, pp.85–91 Kong Y., J L nielsen and P H Nielsen 2005 Identify ecophysiology of uncultured Actinobacterial poly-P accumulating organisms in full scale enhanced biological Prus removal plants Applied and Environmental Microbiology, 71(7), pp 40764085 Lane, D J 1991 16S/23S rRNA sequencing In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics ed Stackebrandt, E and Goodfellow, M pp 115–175 Chichester: John Wiley and Sons Le Quang Khoi and Cao Ngoc Diep 2013a Isolation and phylogenetic analysis of polyphosphate accumulating organisms in water and sludge of intensive catfish ponds in the Mekong Delta, Vietnam American Jornal of Life Scienses, 1(2), pp 6171 Lê Quang Khôi Cao Ngọc Điệp 2013b Phân lập phân tích đa dạng vi khuẩn tích lũy polyphơtphat chất thải trại chăn ni heo Đồng Bằng Sơng Cửu Long Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 10(2), pp 58-67 Lin-lin B., LI Dong, LI Xiang-kun, H Rong-xin, Z Jie, LV Yang, XIA Guang-qing 2007 Phosphorus accumulation by bacteria from continuos-flow two-sludge system Journal of environmental sciences, 19, pp 391-395 Liu W T 1995 Function, dynamics, and diversity of microbial population in anaerobic aerobic activated sludge processes for biological phosphate removal Ph.D thesis, University of Tokyo Liu W., A T Nielsen, J Wu, C Tsai, Y Matsuo, S Moloin 2001 In situ identification of polyhydroxyalkanoate accumulating traits for microbial populations in a biological phosphorus removal process Environ Microbiol., 3(2), pp 110-122 McMahon K D., M A Dojka, N R Pace, D Jenkins and J D Keasling 2002 Polyphosphate kinase genes from activated sludge carrying out enhanced biological phosphorus removal Appl Environ Microbiol, 68, pp 4971-4978 Mino, T., Van Loosdrecht, M.C.M., and Heijnen, J.J .1998 Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process Water Res 32, pp 3193–3207 Nakamura K., Hiraishi A., Yoshimi Y., Kawarasaki M.,Masuda K and Kamagata Y.1995 Microlunatus phos-phovorus gen.nov., sp nov., a new Gram-positive polyphosphate accumulating bacterium isolated from activated sludge Int J Syst Bacteriol, 45, pp.17-22 31 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Nakamura K., K Masuda., and E Mikami 1991 Isolation of a new type of poly-P accumulating bacteria and its phosphate removal characristics Journal of fermentation and bioengineering, 71, pp 258-263 Nguyen H T T., L V Quy, A A Hansen, J L Nielsen and H Nielsen 2011 High diversity and abundence of putative poly-P accumulating Tetrasphaera related in activated sludge systems Microbiol Ecol., 76, pp 256-267 Oehmen A., P C Lemos, G Carvalho, Z Yuan, J Keller, L L Backall, M A M Reis 2007 Advances in enhanced biological Prus removal: from micro to macro scale Water Research, 41, pp 2272-2300 Ohtake H, K Takahashi, Y Tsuzuki and K Toda 1985 Uptake and release of phosphate by a pure culture of Acinetobacter calcoaceticus Water res., 19(12), pp 1587-1594 Peng J F., B Z Wang, Y H Song, P Yuan, Z H Liu 2007 Adsorption and release of phosphorus in the surface sediment of a wastewater stabilization pond Ecol Eng, 31, pp 92–97 Phan Lam T., Tam M Bui, Thuy T T Nguyen, Geoff J Gooley, Brett A Ingram, Hao V Nguyen, Phuong T Nguyen, Sena S De Silva 2009 Current status of farming practices of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296, pp 227-236 Shoda M., T Ohsumi and S Udaka 1980 Screening for high phosphate accumulating bacteria Agric Biol Chem., 44(2), pp 319-324 Sidat M., F Bux and H.C Kasan 1999 Poly-P accumulation by bacteria isolated from activated sludge Water SA., 25(2) Stephenson T 1987 Acinetobacter: Its role in biological phosphorus removal In advances in water pollution control: Biological phosphae removal from wastewater, Ramadori R (Ed.): Pergamon Press: Oxford United Kingdom, pp 313-316 Szabó G., B Khayer, A Rusznyák, I Tátrai, G Dévai, K Márialigeti and A K Borsodi 2011 Seasonal and spatial variability of sediment bacterial communities inhabiting the large shallow Lake Balaton Hydrobiologia, 663, pp 217-232 Tamaki H., Y Sekiguchi, S Hanada, K Nakamura, N Nomura, M Matsumura and Y Kamagata 2005 Comparative analysis of bacterial diversity in freshwater dediment of a shallow eutrophic lake by molecular and improved cultivation based techniques Applied and environmental microbiology, 71(4), pp 2162-2169 Tamura K., D Peterson, N Peterson, G Stecher, M Nei and S Kumar 2011 MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods Mol Biol, 28(10), pp 2731–2739 Tandoi V., M Majone, J May and R Ramadori 1998 The behaviour of polyphosphate accumulating Acinetobacter isolates in an anaerobic-aerobic chemostat Wat Res., 32(10), pp 2903-2912 Usharani K., M Muthuchamy, L Perumalsamy 2011 Biological removal of phosphate from synthetic wastewater using bacterial consortium Iranian Journal of Biotechnology, 9(1), pp 37-49 32 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học van Loosdrecht M C M., C M Hooijmans, D Brdjanovic, J J Heijnen 1997 Biological phosphate removal processes Appl Microbiol Biotechnol., 48, pp 289296 Van Veen H W., T Abee, G J J Korstee, H Pereira, W N Konings, A J B Zehnder 1994 Generation of a proton motive force by the excretion of metal phosphate in the poly-P accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A J Biol Chem., 269 (3) Wagner M., R Erhart, W Manz, R Amann, H Lemmer, D Wedi and K H Schleifer 1994 Development of an rRNA-targeted oligonucleotide probe specific for the genus Acinetobacter and its application for in situ monitoring in activated sludge Appl.Environ Microbiol, 60(3), pp 792-800 Wentzel M C., P L Dold, G A Ekama, G V R Marais 1989 Enhanced polyphosphate organisms culture in activated sludge sysrem Part III: Kinetic model Water SA, 15 (2), pp 89-102 Wong M T., T Mino, R J Seviour, M Onuki, W T Liu 2005 In situ identification and characterization of the microbial community structure of full-scale enhanced biological Prus removal plants in Japan Water Res., 39(13), pp 2901-2914 Zhou A M., H X Tang, D S Wang 2005 Phosphorus adsorption on natural sediments: modeling and effects of pH and sediment composition Water Res., 39, pp.1245– 1254 33