CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨSỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨYPOLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤTTHẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở DB SÔNG CỬU LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Nghiên cứu sinh thực LÊ QUANG KHÔI Khóa: 2011 – 2015 Cần Thơ, 12/2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SỰ HIỆN DIỆN VÀ VAI TRỊ CỦA VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYPHOSPHATE TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA VÀ CHẤT THẢI TRẠI CHĂN NUÔI HEO Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Người hướng dẫn khoa học PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP Nghiên cứu sinh thực LÊ QUANG KHƠI Khóa: 2011 – 2015 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Cần Thơ, 12/2012 ii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH HÌNH iii DANH SÁCH BẢNG .iv TÓM LƯỢC v BẢNG CHÚ THÍCH vi Chương ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Khái quát tình hình nghiên cứu ngồi nước 1 P tác động chúng đến chất lượng nước 1 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra trại chăn nuôi heo ĐBSCL 1 Loại bỏ P sinh học 1 Poly-P 1 Chuyển hóa điều hịa trao đổi chất PAOs 1 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P 14 1 Tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn poly-P ao hồ 17 1 Nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ 18 1.2 Phạm vi nghiên cứu chuyên đề 19 Mục đích chuyên đề 19 2 Yêu cầu chuyên đề 20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 Phương tiện nghiên cứu 21 1 Thiết bị, dụng cụ .21 2 Nguyên vật liệu 22 Hóa chất 22 2 Phương pháp 25 2 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm .25 2 Phương pháp lấy mẫu .25 i Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học 2 Phương pháp phân lập vi khuẩn tích lũy Poly-P 25 2 Xác định khả hình thành Poly-P nội bào 26 2 Gram staining 27 2 Chụp kính hiển vi điện tử (electron microscopy) 27 2 Nhận diện PAOs .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 Kết 29 1 Phân lập mô tả PAOs 29 Chụp SEM (Scanning electron microscopy) .31 3 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 31 Chụp TEM .32 Định danh phân tích phát sinh loài PAOs 33 Thảo luận 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 Kết luận 41 Đề nghị 41 Tài liệu tham khảo .43 ii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cấu trúc chuỗi poly-P Hình 2: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia .6 Hình 3: Hiệu trích poly-P nước lạnh, nước nóng NaOH Hình 4: Mơ tả đặc điểm sinh hóa q trình EBPR Hình 5: Mối tương quan tốc độ hấp thu phosphate hàm lượng COD ngoại bào 11 Hình 6: Sơ đồ mơ tả đồng vận chuyển MeHPO4/H+ 12 Hình 7: Ảnh chụp SEM với kích thước dịng vi khuẩn phân lập 31 Hình 8: Ảnh chụp TEM .32 Hình 9: Cây phát sinh lồi dạng Maximum Likehood .32 Hình 10: Tỉ lệ lớp dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra .38 iii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các chất sử dụng điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) Bảng 2: Trình tự primer dùng nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAOs 22 Bảng 3: Kết phân lập dòng vi khuẩn .29 Bảng 4: Kết kiểm hàm lượng poly-P nội bào 30 Bảng 5: Tỷ lệ phần trăm đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập .31 Bảng 6: Kết phân lập dịng vi khuẩn nước ao ni ca tra 33 Bảng 7: Hàm lượng poly-P nội bào dịng vi khuẩn phân lập nước ao ni cá tra 34 Bảng 8: Các dòng vi khuẩn tích lũy Polyphosphate phân lập từ nước ao ni cá tra 35 Bảng 9: Mối quan hệ phát sinh lồi dịng vi khuẩn phân lập 37 iv Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học TÓM LƯỢC Vi khuẩn tích lũy polyphosphate (polyphosphate accumulating organisms - PAOs) nhóm vi khuẩn có vai trị quan trọng xử lý nước thải đường sinh học Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphate nội bào, góp phần vào q trình loại bỏ phospho hòa tan nước Áp dụng phương pháp phân lập truyền thống kỹ thuật sinh học phân tử thông qua phương pháp thể tài liệu nghiên cứu trước cho thấy PAOs có đa dạng thành phần nước ao ni cá tra Kết có 439 dịng phân lập từ 196 mẫu chất thải từ ao cá tra trại chăn ni heo Trong có 191 dịng phân lập từ 70 mẫu nước ao nuôi cá tra 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải trại chăn nuôi heo Kết kiểm tra hàm lượng polyphosphate nội bào dòng phân lập cho thấy hàm lượng polyphosphate dao động từ mg/l đến 148,1 mg/l sau ngày nuôi vi khuẩn môi trường Khả tích lũy polyphosphate dao động lớn tùy thuộc vào dịng vi khuẩn Có 398/439 dịng vi khuẩn phân lập có khả tích lũy polyphosphate với hàm lượng từ – 19,5 mg/l (chiếm 90,66%) Chỉ có 45/439 dịng vi khuẩn phân lập có hàm lượng polyphosphate tích lũy nội bào từ 19.6 – 148,1 mg/l (trong có 29/439 dịng tích lũy từ 20 – 50 mg/l, 11/439 dịng có hàm lượng từ 50 – 100 mg/l dịng tích lũy từ 100 – 148,1 mg/l) Dựa trình tự 16S rRNA, 21 dịng 191 dịng phân lập từ nước ao ni cá tra nằm bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gammaproteobacteria Các dịng có quan hệ gần gũi với giống Bacillus chiếm tỉ lệ cao (52.4%) dòng phân lập, dịng có khả tích lũy poly-P cao Burkholderia vietnamiensis TVT003L lớp Beta-proteobacteria, Acinetobacter radioresistens TGT013L lớp Gamma-proteobacteria Arthrobacter protophomiae VLT002L lớp class Actinobacteria Kết hợp chụp TEM xác định phosphate tồn trữ tế bào dạng hạt polyphosphate Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphate, loại bỏ phosphate, ao cá tra, Bacilli, Actinobacteria v Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học BẢNG CHÚ THÍCH ĐBSCL: Đồng Bằng Sơng Cửu Long DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ) EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường loại bỏ P sinh học) GAOs: glycogen accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy glycogen) N: Nitơ P: Phospho PAOs: Polyphosphate accumulating organisms (vi khuẩn tích lũy poly-P) PHAs: Polyhydroxyalkanoates Poly-P: Polyphosphate SEM: Scanning electron microscopy (Kính hiển vi điện tử quét) TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét) VFAs: Volatile fatty acids (acid béo dễ bay hơi) AGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh An Giang AGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra tỉnh An Giang BLH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Bạc Liêu BTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Bến Tre BTT: ký hiệu dịng vi khuẩn phân lập từ nước ao ni cá tra tỉnh Bến Tre CMH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Cà Mau CTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Cần Thơ CTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra tỉnh Cần Thơ DTH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Đồng Tháp DTT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp HGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Hậu Giang HGT: ký hiệu dịng vi khuẩn phân lập từ nước ao ni cá tra tỉnh Hậu Giang KGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Kiên Giang KGT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra tỉnh Kiên Giang LAH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Long An STH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn ni heo tỉnh Sóc Trăng STT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao ni cá tra tỉnh Sóc Trăng TGH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Tiền Giang TGT: ký hiệu dịng vi khuẩn phân lập từ nước ao ni cá tra tỉnh Tiền Giang TVH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Trà Vinh TVT: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra tỉnh Trà Vinh VLH: ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo tỉnh Vĩnh Long vi Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học vii Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Bảng 8: Các dòng vi khuẩn tích lũy Polyphosphate phân lập từ nước ao ni cá tra Dịng Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc Gram Hàm lượng poly-P (mg/l) + 31.1 + 25.8 + 39.1 + + 76.1 53.1 - 87.1 AGT004L Que, chuyển động AGT005L Que, chuyển động BTT003L Que, chuyển động BTT006L CTT002L Que, chuyển động Que, chuyển động Trắng nhạt, rìa trắng trong, bìa khơng Trịn, trắng đục, nhẵn, ẩm ướt Tròn, lồi thấp, trắng nhạt, nhầy Tròn, lồi thấp, trắng nhạt Trịn, sáng đục, bìa ngun CTT004L Que ngắn, chuyển động chậm Trịn, nhỏ, lóng lánh, nhẵn, bìa nguyên DTT001L Que, chuyển động + 36.5 DTT021L Que, chuyển động + 38.6 DTT025L Que, chuyển động Tròn, trắng mờ, bìa nguyên Trắng sữa, nhẵn, nhầy, bìa nguyên Lồi, nhầy, trắng nhạt, lóng lánh, bìa ngun - 24.9 Trịn, lồi, vàng sáng + 34.4 Lồi, nhẵn, rìa sáng hồng cam + 39.1 Tròn, nhỏ, kem sữa + 32.4 Tròn, trắng xám, lồi, gồ ghề - 73.4 + 32.4 + 28.9 - 148.1 Tròn lồi, cam sáng + 25.5 Lồi nhẵn, sáng mờ, bìa khơng - 144.2 HGT005L HGT018L KGT004L KGT005L Que cong, chuyển động chậm Que đơn dính cặp Que ngắn, chuyển động chậm Que thẳng cong STT011L Que, chuyển động STT009L Que, chuyển động Que ngắn, chuyển động chậm Que thẳng cong, không chuyển động Que thẳng cong, chuyển động TGT013L TGT018L TVT003L Trịn nhẵn, trắng nhạt, rìa trắng trong, ẩm ướt Trịn, trắng sữa, bìa ngun Trịn nhẵn, nhỏ, lóng lánh, bìa ngun TVT005L Que, chuyển động Trịn, trắng nhạt, rìa trắng trong, bìa khơng + 19.6 VLT002L Que ngắn, chuyển động Trắng nhạt, ẩm ướt, nhầy + 92.3 VLT003L Que, chuyển động Tròn nhẵn, trắng nhạt, rìa trắng trong, ẩm ướt + 28.5 35 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hình 9: Cây phát sinh loài dạng Maximum Likehood xây dựng trình tự 16S rRNA 21 dịng vi khuẩn phân lập từ mẫu ao nuôi cá tra Bacill i Actinobacteria GammaProteobacteria Beta-proteobacteria 36 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Bảng 9: Mối quan hệ phát sinh lồi dịng vi khuẩn phân lập dựa trình tự tương đồng 16S rRNA Phân loại nhóm dịng Lồi có quan hệ gần Tương Length/gap đồng (%) (bp) Bacilli Bacillaceae DTT021L Bacillus megaterium (JQ229803) 99 1249/1 DTT001L Bacillus megaterium (JQ229803) 99 1227/4 BTT003L Bacillus megaterium (DQ365564) 97 923/6 AGT005L Bacillus megaterium (FJ976535) 99 1274/5 STT009L Bacillus megaterium (FJ976535) 98 1304/8 VLT003L Bacillus aryabhattai (HQ908708) 98 1344/12 STT011L Bacillus aryabhattai (JN084155) 99 1248/5 BTT006L Bacillus aryabhattai (HQ242767) 98 1352/7 AGT004L Bacillus sp (HQ024491) 99 1202/4 CTT002L Bacillus sp (DQ275185) 98 1345/15 TVT005L Bacillus ginsengihumi (FJ357590) 98 1275/8 HGT005L Arthrobacter sp (AB638330) 98 1150/6 KGT004L Arthrobacter sp (EU571174) 99 1226/3 VLT002L Arthrobacter protophormiae (AB210984) 98 1366/8 Mycobacterium phocaicum (EF551407) 98 1053/5 Gordonia polyisoprenivorans (DQ154925) 98 1155/7 TGT013L Acinetobacter radioresistens (GU145275) 99 1277/7 CTT004L Acinetobacter sp (AJ633641) 98 1268/7 Stenotrophomonas maltophilia (AJ295671) 99 784/0 Actinobacteria Micrococcaceae Mycobacteriaceae TGT018L Gordoniaceae HGT018L Gammaproteobacteria Moraxellaceae Xanthomonadaceae KGT005L Betaproteobacteria Burkholderiaceae TVT003L Burkholderia vietnamiensis (JF922108) 98 1182/12 DTT025L Cupriavidus sp (AB266608) 99 1148/2 37 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Thảo luận Những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng để mô tả cấu trúc quần thể vi khuẩn phân loại PAOs dựa mối quan hệ phát sinh loài Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy có đa dạng quần thể vi khuẩn bao gồm lớp Proteobacteria, Actinobactera nhóm vi khuẩn Gram dương với hàm lượng G+C cao, Firmicutes thuộc Gram dương với hàm lượng G+C thấp, Bacteroidetes, Planctomycetes (Bond et al., 1999; Tamaki et al., 2005; Ahn et al., 2007; Gloess et al., 2008) Trong nghiên cứu này, trình tự 16S rRNA sử dụng để mơ tả thành phần phát sinh loài quần thể vi khuẩn nước ao ni cá tra Kết trình tự 16S rRNA từ 21 dòng phân lập, so sánh tương đồng với trình tự thu lấy từ ngân hàng GenBank Trên sở xây dựng phát sinh loài, nhóm chiếm tỉ lệ phần trăm sau: Gram dương với hàm lượng G+C thấp thuộc lớp Bacilii (52.4%), Gram dương với hàm lượng G+C cao (23.8%) thuộc lớp Actinobacteria, Gamma-proteobacteria (14.3%) Betaproteobacteria (9.5%) Giống Bacillus chiếm tỉ lệ cao số lượng (hình 11) Hình 10: Tỉ lệ lớp dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao ni cá tra Mặc dù có khác cao hàm lượng poly-P nội bào dòng vi khuẩn phân lập (Bảng 9) Các nghiên cứu trước cho giống có khả tích lũy lượng lớn poly-P nội bào Acinetobacter (Ohtake et al., 1985; Bark et al., 1992; Sidat et al., 1999; Carr et al., 2001; Boswell et al., 2001), Stenotrophomonas Burkholderia (Ivanov et al., 2005) Kết kiểm tra hàm lượng poly-P cho thấy, vi khuẩn có khả tích lũy phosphate cao đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram (-) Acinetobacter Burkholderia Gamma-proteobacteria cho lớp vi khuẩn gram (-) có thành phần 38 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học trội bùn hoạt tính xử lý phosphate Tuy nhiên, phương pháp xác định mẫu dị phân tử lai chổ, khơng qua việc phân lập nuôi cấy (Hiraishi et al., 1989; Wagner et al., 1994) cho Acinetobacter spp chiếm thành phần nhỏ (khoảng – 6%) bùn hoạt tính Bên cạnh đó, Wagner et al (1994) sử dụng mẫu dị chuyên biệt 16S rRNA để xác định thành phần Acinetobacter spp cho thấy chúng chiếm khoảng to 10% thành phần vi khuẩn bùn hoạt tính có khả tích lũy poly-P cao Từ kết nghiên cứu cho thấy Acinetobacter sp chiếm khoảng 9.5% dòng vi khuẩn phân lập được, kết cho thấy có tương quan với nghiên cứu trước Tuy nhiên đối tượng nghiên cứu nước ao nuôi cá tra, nghiên cứu trước chủ yếu bùn hoạt tính hệ thống xử lý nước thải Bên cạnh Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp., Burkholderia sp., Cupriavidus sp., vi khuẩn Gram (-) chiếm 4.76% cho loại Bảng cho thấy tất dịng lớp Gamma-proteobacteria có tiềm hấp thu phosphate khả tích poly-P cao Acinetobacter radioresistens TGT013L (148.1 mg/l), Acinetobacter sp CTT004L (87.1 mg/l) Stenotrophonas maltrophia KGT005L (73.4 mg/l) Các vi khuẩn Gram (-) cịn lại thuộc lớp Beta-proteobaceria, Burkholderia vietnamiensis TVT003L có khả tích lũy poly-P cao (144.2 mg/l), Cupriavidus sp DTT025L (24.9 mg/l) (Bảng 9) Bond et al., (1999) sử dụng FISH để xác định cấu trúc quần thể vi khuẩn bùn hoạt tính có chứa hàm lượng poly-P cao cho vi khuẩn Gram (+) với hàm lượng G+C cao chiếm tới 35%, Liu et al., (2001) áp dụng kỹ thuật cho chúng chiếm 17.9% tổng số vi khuẩn Bux Kasan (1994) nghiên cứu thành phần vi khuẩn hệ thống xử lý cho vi khuẩn Gram (+) với hàm lượng G+C thấp chiếm ưu bao gồm giống Bacillus Szabó et al., (2011) nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn kỹ thuật phân lập giải trình tự 16S rDNA Nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P phương pháp nhuộm Neisser staining cho Firmicutes, Actinobacteria, Alpha-proteobacteria Aeromonas có khả tích lũy lượng lớn poly-P nội bào Kết bảng cho thấy vi khuẩn Gram (+) chiếm tỉ lệ cao 76.2% tổng số vi khuẩn phân lập Hình 11 cho thấy vi khuẩn Gram (+) Bacillus sp chiếm 52.4%; Arthrobacter sp (14.3%), Mycobacterium phocaicum TGT018L (4.6%) Gordonia polyisoprenivorans HGT018L (4.6%) Trong 11 dòng Bacillus sp., Bacillus aryabhattai BTT006L Bacillus sp CTT002L cho thấy có khả 39 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học tích lũy poly-P cao dòng lại với hàm lượng tương ứng 76.1 53.1 mg/l dòng bao gồm Bacillus megaterium (BTT003L, DTT021L, DTT001L, AGT005L, STT009L) B aryabhattai (STT011L, VLT002L) Bacillus sp AGT004L có khả tích lũy từ 25.8 – 39.1 mg/l poly-P Dịng B ginsengihumi tích lũy thấp 19.6 mg/l poly-P Điều cho thấy rằng, Bacillus spp Chiếm thành cao mẫu phân lập, hàm lượng poly-P có khác biệt đáng kể dòng Trong lớp Actinobacteria, Arthrobacter sp mơ tả PAOs có lực cao hấp thu phosphate (Shoda et al., 1980) Kết cho thấy dịng A protophormiae VLT002L hấp thu tồn trữ poly-P tương đối cao (92.3 mg/l), Arthrobacter sp HGT005L (34.4 mg/l) Arthrobacter sp KGT004L (32.4 mg/l) Bên cạnh đó, Mycobacterium Gordonia xem PAOs (McMahon et al., 2002; Beer et al., 2006), thí nghiệm cho thấy M phocaicum TGT018L G polyisoprenivorans HGT018L tích lũy poly-P tương ứng 25.5 39.1 mg/l (Bảng 9) 40 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Phương pháp phân lập nhận diện vi khuẩn nghiên cứu phù hợp để định danh khảo sát đa dạng PAOs nước Kết có 439 dòng phân lập từ 196 mẫu chất thải từ ao cá tra trại chăn ni heo Trong có 191 dịng phân lập từ 70 mẫu nước ao ni cá tra 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải trại chăn nuôi heo Kết hợp kiểm tra hàm lượng polyphosphate nội bào dòng phân lập cho thấy hàm lượng polyphosphate dao động từ mg/l đến 148,1 mg/l sau ngày nuôi vi khuẩn mơi trường Khả tích lũy polyphosphate dao động lớn tùy thuộc vào dịng vi khuẩn Có 398/439 dịng vi khuẩn phân lập có khả tích lũy polyphosphate với hàm lượng từ – 19,5 mg/l Chỉ có 45/439 dịng vi khuẩn phân lập có hàm lượng polyphosphate tích lũy nội bào từ 19.6 – 148,1 mg/l Các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập thể phong phú đa dạng cao Sự kết hợp chụp TEM cho thấy phosphate tích lũy tế bào dạng hạt poly-P Tuy nhiên, ảnh chụp TEM chưa thể tương phản cao tế bào cấu trúc hạt poly-P bên nên cần phải xử lý mẫu để đạt kết tốt Mặc dù, Acinetobacter sp Burkholderia sp chiếm tỉ lệ thấp, có tiềm tích lũy cao số dòng vi khuẩn phân lập Hơn nữa, kết cho thấy vai trò quan trọng Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria Gamma-proteobacteria trình loại bỏ phosphate hịa tan nước ao ni cá tra Trên sở kết nghiên cứu, dòng vi khuẩn phân lập xem đại diện PAOs ao nuôi cá tra tỉnh ĐBSCL Mặc dù lớp Bacilli khơng phải nhóm vi khuẩn có khả tích lũy poly-P cao chúng thành phần vi khuẩn trội nước ao nuôi cá tra (chiếm 50% tổng số vi khuẩn phân lập được), điều cho thấy vai trò chúng q trình điều hịa nguồn P hịa tan ao - hồ nuôi cá Đề nghị Áp dụng phương pháp đưa nghiên cứu việc phân lập, nhận diện phân tích đa dạng di truyền quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P 41 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học nước Phân tích đa dạng quần thể vi khuẩn chất thải trại chăn ni heo so sánh tính đa dạng với dòng vi khuẩn phân lập nước ao nuôi cá tra Tiếp tục gia công xử lý lại mẫu để chụp TEM Kiểm tra hiệu suất hấp thu phosphate dòng vi khuẩn phân lập với hàm lượng phosphate hịa tan cịn lại mơi trường thấp, kết hợp với kiểm tra khả loại bỏ N chúng sở việc tuyển chọn số dòng để ứng dụng vào việc xử lý P N hịa tan nước ao ni cá tra 42 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Huỳnh Trường Giang, Vũ Ngọc Út Nguyễn Thanh Phương 2008 Biến động yếu tố môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh An Giang Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, (1),pp.1-9 Lê Anh Tuấn 2008 Nước cho nuôi trồng thủy sản chiến lược quy hoạch thủy lợi đa mục tiêu Đồng Bằng Sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 2, pp 205-209 Lê Bảo Ngọc 2004 Đánh giá chất lượng môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh xã Tân Lộc, huyện Thốt Nốt, Thành Phố Cần Thơ Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng, Luận văn cao học, Đại học Cần Thơ Tiếng Anh Ahn J., S Schroeder, M Beer, S Mcllroy, R C Bayly, J W May, G Vasiliadis and R J Seviour 2007 Ecology of the Microbial Community removing Phosphate from Wastewater under Continuously Aerobic Conditions in a Sequencing Batch Reactor Applied and Environmental Microbiology, 73, pp.2257 - 2270 Ahn J., T Daidou, S Tsuneda, A Hirate 2001 Metabolic behavior of denitrifying phosphate accumulating organisms under nitrate and nitrite electron acceptor conditions J Biosci Bioeng., 92(5), pp 442-446 Auling G., F Pilz, H-J Busse, S Karrash, M Streichan and G Schon 1991 Analysis of the poly-P accumulating microflora in Prus eliminating, anaerobic-aerobic activated sludge systems by using Diaminopropane as a biomarker for rapid estimation of Acinetobacter spp Applied and Environmental Microbiology, pp 3585-3592 Barker P S., P C Dold 1996 Denitrification behavior in biological excess phosphorus removal activated sludge system Water res, 30, pp 769-780 Barnard J L 1974 Cut P and N without chemicals Water Wastes Eng., 11(7), pp 33-36 Barnard J L., K Abraham 2006 Key features pf successful BNR operatoin, Water Sci Technol., 53 (12), pp 1-9 Beer M., H M Stratton, P C Griffiths and R J Seviour 2006 Which are the polyphosphate accumulating organisms in full scale activated sludge enhanced biological phosphate removal system in Austalia? Applied of Microbiology, 100, pp 233-243 Bond P L., P Hugenholtz, J Keller And L L Blackall 1995 Bacterial community structure of phosphate removing and non-phosphate removing activated sludges from sequencing batch reactor Applied and Environmental Microbiology, 61(5), pp 1910-1916 Bond P L., R Erhart, M Wagner, J Keller, L L Blackall 1999 Identification of some of the the major groups of bacteria in efficient anf non-efficient biolical phosphorus removal activated sludge systems Appl Environ Microbiol., 65(9), pp 4077-4088 Boswell C D., R E Dick, H Eccles and L E Macaskie 2001 Phosphate uptake and release by Acinetobacter johnsonii in continuous culture and coupling of phosphate 43 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học release to heavy metal accumulation, Journal of industrial Microbiology & Biochechnology, 26, pp.33-340 Bowman M F., P.A Chambers, D W Schindler 2007 Constraints on benthic algal response to nutrient addition in oligotrophic muontain rivers River research and application, 23(8), pp 858-876 Bux F and H C Kasan 1994 A microbiological survey of ten activated sludge plants Water SA, 20(1) Buzoleva L S., A M Krivosheeva, A S Isachenko, L M Somova and G P Somov 2005 Effect of temperature on synthesis of poly-P in Yersinia pseudotuberculosis and Listeria monocytogenes under starvation conditions Biochemistry (Moscow), 71(4), pp 473-440 Carr E H Eason, S Feng, A Hoogenraad, R Croome, J Soddell, K Lindrea and R Seviour 2001 RAPD-PCR typing of Acinetobacter isolates from activated sludge systems designed to remove phosphorus microbiologically Journal of Applied microbiology, 90, pp 309-319 Crocetti G R., P Hugenholtz, P L Bond, A Schuler, J Keller, D Jenkings, and L L Blackall 2000 Identification of Poly-P-Accumulating Organisms and Design of 16S rRNA-Directed Probes for Their Detection and Quantitation Applied and environmental microbiology, 66(3), pp.1175-1182 Davelaar D 1993 Ecological significance of bacterial polyphosphate metabolism in sediment Hydrobiologia, 253, pp.179–192 Dawes, E A., and Senior, P J 1973 Energy reserve polymers in microorganisms Adv Microb Physiol 10, pp 178–203 De Silva S S., B A Ingram, Phuong T Nguyen, Tam M Bui, Geoff J Gooley, Giovanni M Turchini 2010 Estimation of Nitrogen and Phosphorus in Effluent from the Striped Catfish Farming Sector in the Mekong Delta, Vietnam Royal Swedish Academy of Sciences(www.kva.se/en) Eixler S., U Selig and U Karsten 2005 Extraction and detection methods for polyphosphate strorage in autotrophic planktonic organisms Hydrobiologia, 533 pp 135-143 Filipe C D M, G T Daigger, C P Leslie Grady Jr 2001 Stoichiometry and kinetics of acetate uptake under anaerobic conditions by an enrichment culture of phosphorus accumulating organisms at different pHs Biotechnology and bioengineering, 76(1), pp 32-43 Fuhs G W and M Chen 1975 Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for treatment of wastewater Microbial Ecol, 2(2), pp.119138 Gächter R and J S Meyer 1993 The role of microorganisms in mobilization and fixation of Prus in sediments Hydrobiologia, 253, pp 103-121 Gächter, R., J S Meyer & A Mares 1988 Contribution of bacteria to release and fixation of phosphorus in lake sediments Limnology and Oceanography, 33, pp.1542–1558 Garcia Martin, H., N Ivanova, V Kunin, F Warnecke, K.W Barry., A.C McHardy 2006 Metagenomic analysis of two enhanced biological phosphorus removal (EBPR) sludge communities Nat Biotechnol, 24, pp 1263–1269 44 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Gimenez, R., Nunez, M.F., Badia, J., Aguilar, J., and Baldoma, L 2003 The gene yjcG, cotranscribed with the gene acs, encodes an acetate permease in Escherichia coli J Bacteriol 185, pp 6448–6455 Gloess S., H-P Grossart, M Allgaier, S Ratering and M Hupfer 2008 Use of Laser microdissection for phylogenetic characterization of polyphosphate accumulating bacteria Applied and Environmental Microbiology, 74(13), pp 4231-4235 He Shaomei, Daniel L Gall, and Katherine D McMahon 2007 “Candidatus Accumulibacter” Population Structure in Enhanced Biological Photphorus Removal Sludges as Revealed by Poly-P Kinase Genes Applied and Environmental Microbiology, 73, pp.5865 - 5874 He, S., and McMahon, K.D 2011 ‘Candidatus Accumulibacter’ gene expression in response to dynamic EBPR conditions ISME J, 5, pp 329–340 Hesselmann R P W., C Werlen, D Hahn, J R van der Meer, A J B Zehnder 1999 Enrichment, phylogenetic analysis and detection of a bacterium that performs enhanced biological phosphrus removal im activated sludge Sust Appli Microbial., 22(3), pp 454-465 Hesselmann R P X., R von Rummell, S M Resnick, R Hany, and A J B Zehnder 2000 Anaerobic metabolism of bacteria performing enhanced biological phosphate removal Water Res, 34,p 3487–3494 Hiraishi A , K Masamune and H Kitamura 1989 Characterization of the Bacterial Population Structure in an Anaerobic-Aerobic Activated Sludge System on the Basis of Respiratory Quinone Profiles Applied and Environmental microbiology, 55(4), pp 897-901 Holt J G., N R Krieg, P H A Sneath, J T Staley and S T Williams 1994 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed William and Wilkins Publishers, Baltimore Hupfer M., S Glöss and H.-P Grossart 2007 Poly-P accumulating microorganisms in the aquatic sediments Aquatic Microbial Ecology., 47, pp, 299-311 Ivanov V., V Stabnikov, W Q Zhuang, J H Tay and S T L Tay 2005 Phosphate removal from the retunred liquor of munucipal wastewater treatment plant using iron recucing bacteria Journal of Applied Microbiology, 98, pp 1152-1161 Jorgensen S J., S L P Pauli 1995 Polyphosphate accumulation among denitrifying in activated sludge Anaerobe, 1, pp 161-168 Kampfer P., R Erhart, C Beimfohr, J Bohringer, M Wagner and R Amann 1996 Characterization of bacterial communities from activated sludge: culture-dependent numerical identification versus in situ identification using group-and genus-specifc rRNA-targeted oligonucleotide probes Microbial Ecol., 32, pp.101-121 Kerrn-Jespersen J P, M Henze 1993 Biological phosphorus uptake under anoxic and aerobic conditions Water res., 27, pp 617-624 Khoshmanesh A., B T Hart, A Duncan, R Beckett 1999 Biotic uptake and release of phosphorus in a wetland sediment Environ Technol., 20, pp.85–91 Kong Y., J L nielsen and P H Nielsen 2005 Identify ecophysiology of uncultured Actinobacterial poly-P accumulating organisms in full scale enhanced biological 45 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Prus removal plants Applied and Environmental Microbiology, 71(7), pp 40764085 Kortstee, G J J., Appeldoorn, K J., Bonting, C F C., Vanniel, E W J., and van Veen, H W 1994 Biology of poly-P-accumulating bacteria involved in enhanced biological Prus removal FEMS Microbiol Rev., 15,pp.137–153 Kuba T., A Wachtmeister, M C M Van Loosdrecht, J J Heijnen 1994 Effect of nitrate on phosphorus release in biological phosphorus removal systems Water sci Technol., 30(6), pp 263-269 Kulaev, I & T Kulakovskaya, 2000 Polyphosphate and phosphate pump Annual Review of Microbiology, 54, p 709–734 Lane, D J 1991 16S/23S rRNA sequencing In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics ed Stackebrandt, E and Goodfellow, M pp 115–175 Chichester: John Wiley and Sons Liu W T 1995 Function, dynamics, and diversity of microbial population in anaerobic aerobic activated sludge processes for biological phosphate removal Ph.D thesis, University of Tokyo Liu W., A T Nielsen, J Wu, C Tsai, Y Matsuo, S Moloin 2001 In situ identification of polyhydroxyalkanoate accumulating traits for microbial populations in a biological phosphorus removal process Environ Microbiol., 3(2), pp 110-122 Liu W., T Mino, T Matsuo, K Nakamura 1996 Biological Prus removal process – Effect of pH on anaerobic substrate metabolism Water Sci Technol., 34, pp 25 Liu W.-T, K Nakamura, T Matsuo, T Mino 1997 Internal energy based competition between polyphosphate and glycogen accumulating bacteria in biological phosphorus removal reactors : Effect of P/C feeding ratio Water Res., 31, pp 14301438 McMahon K D., M A Dojka, N R Pace, D Jenkins and J D Keasling 2002 Polyphosphate kinase genes from activated sludge carrying out enhanced biological phosphorus removal Appl Environ Microbiol, 68, pp 4971-4978 Merzouki M, J K Delgenus, N Bernet, R Moletta, M Benlemlih 1999 Polyphosphate accumulating and denitrifying bacteria isolated from anaerobic/aerobic sequencing batch reactor Curr Microbiol., 38, pp 9-17 Mino, T., Van Loosdrecht, M.C.M., and Heijnen, J.J .1998 Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process Water Res 32, pp 3193–3207 Nakamura K., Hiraishi A., Yoshimi Y., Kawarasaki M.,Masuda K and Kamagata Y.1995 Microlunatus phos-phovorus gen.nov., sp nov., a new Gram-positive polyphosphate accumulating bacterium isolated from activated sludge Int J Syst Bacteriol, 45, pp.17-22 Nakamura K., K Masuda., and E Mikami 1991 Isolation of a new type of poly-P accumulating bacteria and its phosphate removal characristics Journal of fermentation and bioengineering, 71, pp 258-263 Nealson K H., 1997 Sediment bacteria: who’s ther, what are they doing, and what’s new? Annual Review of Earth and Planetary Sciences, 25, pp: 403-434 46 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Neethling, J., Bakke, B., Benisch, M., Gu, A., and Stephens, H 2005 Factors influencing the reliability of enhanced biological Prus removal Report 01CTS3 Water Environment Research Foundation, Alexandria, VA Neidhardt F C., J L Ingraham, M Schaechter 1990 Physiology of the bacteira cell: A Molecular approach Sinauer Associates, Inc.: Sunderland Massachsetts, pp 156 Nguyen H T T., L V Quy, A A Hansen, J L Nielsen and H Nielsen 2011 High diversity and abundence of putative poly-P accumulating Tetrasphaera related in activated sludge systems Microbiol Ecol., 76, pp 256-267 Oehmen A., P C Lemos, G Carvalho, Z Yuan, J Keller, L L Backall, M A M Reis 2007 Advances in enhanced biological Prus removal: from micro to macro scale Water Research, 41, pp 2272-2300 Ohtake H, K Takahashi, Y Tsuzuki and K Toda 1985 Uptake and release of phosphate by a pure culture of Acinetobacter calcoaceticus Water res., 19(12), pp 1587-1594 Painting S J., M J Devlin, S J Malcolm, E R Parker, D K Mills, C Mills, P.l Tett, A Wither, J Burt, R Jones, K Winpenny 2007 Assessing the impact of nutrient enrichment in estuaries: susceptibility to eutrophication Mar Pollut Bull, 55, pp 74–90 Panswad T., N Tongkhammak, J Anotai 2007 Estimation of intracellar phosphorus content of phosphorus accumulating organisms at different P:COD feeding ratios Journal of Environmental Management, 84, pp 141-145 Peng J F., B Z Wang, Y H Song, P Yuan, Z H Liu 2007 Adsorption and release of phosphorus in the surface sediment of a wastewater stabilization pond Ecol Eng, 31, pp 92–97 Phan Lam T., Tam M Bui, Thuy T T Nguyen, Geoff J Gooley, Brett A Ingram, Hao V Nguyen, Phuong T Nguyen, Sena S De Silva 2009 Current status of farming practices of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam Aquaculture, 296, pp 227-236 Pick, U., Bental, M., Chitlaru, E., and Weiss, M 1990 Poly-P-hydrolysis - a protective mechanism against alkaline stress FEBS 274, 15–18 Qin B Q 2002 Approaches to mechanisms and control of eutrophication of shallow lakes in the middle and lower reaches of the Yangtze River J Lake Sci., 14, pp.193–202 (in Chinese) Randall C W., J L Barnard, H D Stensel 1992 Design and retrofit of wastewater treatment plants for biological nutrient removal, technomic publishing company: Lancater, Pennsylvania, 119 Robarts R D and T Zohary.1987 Temperature effects on photosynthetic capacity, respiration, and growth rates of bloom-forming cyanobacteria NZ J Mar Freshwater Res., 21, pp 391–399 Shoda M., T Ohsumi and S Udaka 1980 Screening for high phosphate accumulating bacteria Agric Biol Chem., 44(2), pp 319-324 Schuler A J and D Jenkins 2003 Enhanced biological phosphorus removal from wastewater by biomass with different phosphorus contents, part I: Experimental results and comparison with metabolic models Water environ Res., 75, pp 483498 47 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Sidat M., F Bux and H.C Kasan 1999 Poly-P accumulation by bacteria isolated from activated sludge Water SA., 25(2) Smolders G J F., J van der Meij, M C M Loosdrcht, J J Heijnen 1995 A structure metabolic model for anaerobic and aerobic stoichiometry and kinetics of the biological phosphorus removal process Biotechnol Bioeng., 47,pp 277-287 Smolders G J F., J van der Meij, M C M van Loosdrecht and J J Heijnen 1994 Stoichiometric model ofthe aerobic metabolism of the biological Prusremoval process Biotech Bioeng, 44, pp 837-848 Soejima K., S Matsumoto, S Ohgushi, K Naraki, A Terada, S Tsuneda, A Hirata 2008 Modeling and experimental study on the anaerobic/aerobic/anoxic process for simultaneous nitrogen and phosphorus removal: The effect of acetate addition Process biochemistry, 43, pp 605-614 Stephenson T 1987 Acinetobacter: Its role in biological phosphorus removal In advances in water pollution control: Biological phosphae removal from wastewater, Ramadori R (Ed.): Pergamon Press: Oxford United Kingdom, pp 313-316 Swale E M F 1964 A study of the phytoplankton of a calcareous river J Ecol., 52, pp 433–446 Szabó G., B Khayer, A Rusznyák, I Tátrai, G Dévai, K Márialigeti and A K Borsodi 2011 Seasonal and spatial variability of sediment bacterial communities inhabiting the large shallow Lake Balaton Hydrobiologia, 663, pp 217-232 Tamaki H., Y Sekiguchi, S Hanada, K Nakamura, N Nomura, M Matsumura and Y Kamagata 2005 Comparative analysis of bacterial diversity in freshwater dediment of a shallow eutrophic lake by molecular and improved cultivation based techniques Applied and environmental microbiology, 71(4), pp 2162-2169 Tamura K., D Peterson, N Peterson, G Stecher, M Nei and S Kumar 2011 MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods Mol Biol, 28(10), pp 2731–2739 Tandoi V., M Majone, J May and R Ramadori 1998 The behaviour of polyphosphate accumulating Acinetobacter isolates in an anaerobic-aerobic chemostat Wat Res., 32(10), pp 2903-2912 Ubukata Y and S Takii.1994 Induction ability of excess phosphate accumulation for phosphate removing bacteria Water Res., 28, pp 247-249 Vadari Y., B P Mason, K C Doerner 2006 Isolation from poultry and litter and charicterization in high phosphate conditions of Staphylococcus spp capable of grouwth Letters in Applied Microbiology, 43, pp 64-70 Van Veen H W., T Abee, G J J Korstee, H Pereira, W N Konings, A J B Zehnder 1994 Generation of a proton motive force by the excretion of metal phosphate in the poly-P accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A J Biol Chem., 269 (3) Waara T., M Jansson and K Pettersson 1993 Prus composition and release in sediment bacteria of the genus Pseudomonas during aerobic and anaerobic conditions Hydrobiologia 253, pp: 131-140 48 Chuyên đề nghiên cứu sinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Wagner M., R Erhart, W Manz, R Amann, H Lemmer, D Wedi and K H Schleifer 1994 Development of an rRNA-targeted oligonucleotide probe specific for the genus Acinetobacter and its application for in situ monitoring in activated sludge Appl.Environ Microbiol, 60(3), pp 792-800 Wang S R., X C Jin, Y Pang, H C Zhao, X N Zhou 2005 The study of the effect of pH on phosphate sorption by different trophic lake sediments J Colloid Interface Sci, 285, pp 448–457 Wentzel M C., P L Dold, G A Ekama, G V R Marais 1989 Enhanced polyphosphate organisms culture in activated sludge sysrem Part III: Kinetic model Water SA, 15 (2), pp 89-102 Wiame, J M 1947 The metachromatic reaction of hexametaphosphate J Am Chem Soc 69, pp 3146–3147 Wong M T., T Mino, R J Seviour, M Onuki, W T Liu 2005 In situ identification and characterization of the microbial community structure of full-scale enhanced biological Prus removal plants in Japan Water Res., 39(13), pp 2901-2914 Wu Q., P L Bishop and T C Keener 2006 Biological phosphate uptake and release: Effect of pH and magnesium ions Water environment research, 78 (2), pp 196-201 You B S., J C Zhong, C X Fan, T C Wang, L Zhang, S M Ding 2007 Effects of hydrodynamics processes on phosphorus fluxes from sediment in large, shallow Taihu Lake J Environ Sci., 19, pp 1055–1060 You S J., Y J Shen, C F Ouyang, C L Hsu 2004 The effect of residual chemical oxygen demand on anoxic and aerobic phosphate uptake and release with various intracellular polymer levels Water environment Research, 76(2),pp 149-154 Zhou A M., H X Tang, D S Wang 2005 Phosphorus adsorption on natural sediments: modeling and effects of pH and sediment composition Water Res., 39, pp.1245– 1254 49