Ph©n tö protein cã mét sè ph¶n øng hãa häc ®Æc trng nh ph¶n øng Biure, ph¶n øng Xanthoprotein, ph¶n øng Pauli, ph¶n øng Xacaguchi…Trong sè c¸c ph¶n øng kÓ trªn cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t [r]
(1)Bµi 1: thùc nghiƯm vỊ protein vµ amino acid I Các phản ứng màu
Phõn t protein có số phản ứng hóa học đặc trng nh phản ứng Biure, phản ứng Xanthoprotein, phản ứng Pauli, phản ứng Xacaguchi…Trong số phản ứng kể có phản ứng dùng để phát có mặt liên kết peptide, có phản ứng dùng để phát acid amin chứa nhân thơm phân tử protein…Chính nhờ phản ứng mà ngời ta định tính định lợng protein dung dịch
1 Phản ứng Biure a Nguyên lý
Trong môi trờng kiềm, chất có liên kết pepitide tác dụng với Cu2+ tạo thành phức
cht cú mu tím hồng Cờng độ màu phản ứng phụ thuộc vào lợng Cu2+ số lợng liên kết
peptide có phân tử protein Phản ứng giống nh phức hợp phân tử ure với ion Cu2+ nên
có tên phản ứng Biure Cơ chế phản ứng
b Tiến hành
+ ng 1: cho vào ống nghiệm khoảng 0,1g ure Đun lửa đèn cồn đến ure nóng chảy; để nguội đợc biure
+ èng 2: ml lòng trắng trứng + ống 3: ml dung dịch gelatin 1% + ống 4: khong ml sữa tơi
Cho thêm vào ống ml NaOH 10%, 1-2 giät CuSO4 1%
Lắc đều, quan sát, so sánh giải thớch kết c ứng dụng
- Ph¸t hiƯn protein vËt phÈm
- Trong môi trờng kiềm mạnh, phức hợp màu dới dạng anion Phản ứng tạo phức hợp có màu bền, ổn định, đợc dùng để định lợng protein
2 Phản ứng Xantoprotein a Nguyên lý
Cỏc protein cú chứa amino acid mạch vòng nh: phenylanaline, tyrosine, tryptophan, vv… dới tác dụng HNO3 đặc, nhân thơm amino acid bị gắn nitro tạo thành dẫn xuất nitro
có màu vàng Nếu gặp môi trờng kiềm mạnh dẫn xuất tạo thành muối có cấu tạo dạng quinoid có màu vàng da cam
Cơ chế phản ứng:
(2)Cho vào èng nghiÖm
- èng 1: ml dung dÞch lịng trắng trứng - èng 2: khoảng ml s a tữ ươi
- èng 3: ml dung dÞch gelatin 1%
Cho vào ống nghiệm, ống ml HNO3 đặc, đun lửa đèn cồn, đến xuất
hiện màu vàng Sau để nguội, cho từ từ giọt NaOH 20% (khoảng 1-2 ml) ống nghiệm xuất mu vng da cam
Nhận xét giải thích kết c ứng dụng
- Phát protein vËt phÈm - KiĨm tra chÊt lỵng protein II Các phản ứng sa lắng protein
Protein hòa tan nớc thành dung dịch keo a nớc Trong dung dịch tiểu phần protein loại tích điện dÊu, xung quanh tiĨu phÇn protein cã líp vá thđy hóa (phân tử l ỡng cực liên kết với nhóm ph©n cùc nh – OH, - COOH, - NH2, ) Nhờ hai yếu tố trên, protein tồn dới
dạng dung dịch keo bền vững Protein kết tủa làm hai yếu tố hòa tan nh sau :
- Làm điện tích tiểu phần protein cách :
+ a pH ca dung dịch protein pH đẳng điện (pHi) protein đó, pH dung dịch với pHi protein, đa số protein dạng lỡng cực, không mang in tớch
+ Thêm chất điện giải NaCl, (NH4)2SO4các ion trung hòa điện tích tiểu phần
protein
- Làm lớp thủy hãa b»ng c¸ch :
+ Gây biến tính protein, cấu trúc protein bị đảo lộn cách đun sôi, thêm muối kim loại nặng, thêm acid, base mạnh tác nhân lý học
+ Thêm chất hút nớc nh rợu etylic, tanin… Những biến đổi đợc phân làm loại:
+ Biến đổi thuận nghịch: tức dung dịch keo trở lại trạng thái ban đầu sau khử tác nhân Thuộc loại biến đổi gồm có phản ứng: phản ứng diêm tích, tác dụng nhẹ cồn, axeton nhiệt độ thấp
+ Biến đổi khơng thuận nghịch: protein bị biến đổi hồn tồn, bị hủy hoại, mà rõ tính hòa tan nớc Thuộc loại biến đổi gồm: phản ứng gây sa lắng muối kim loại nặng, phản ứng alkaloit, acid kiềm mạnh, un sụi
1 Phản ứng diêm tích (phơng pháp dùng muối) a Nguyên lý
Diờm tớch l phơng pháp dùng muối nh: NaCl, (NH4)2SO4 để kết tủa protein Nguyên nhân
kết tủa tiểu phần protein bị trung hịa điện tích Các protein khác tủa nồng độ muối khác Vì tách riêng protein khỏi hỗn hợp Ví dụ globulin có lợng phân tử lớn albumin, nớc globulin tích điện (-) albumin, globulin bị kết tủa nồng độ amoni sulfat bán b o hòa, albumin kết tủa nồng độ b o hòa Sự kết tủa thuận nghịch, giảm nồng độã ã muối cách pha lo ng với nã ớc hay thẩm tích globuline albumine hịa tan trở lại
b TiÕn hµnh
- ống 1: lấy ml lòng trắng trứng, ml dung dịch (NH4)2SO4 b o hòa lắc ta đã ợc dung dịch bán
b o hòa, nồng độ globulin bị sa lắng, để phút, lọc sang ống nghiệm 2.ã
- ống 2: Cho vào ống bột (NH4)2SO4, vừa cho vừa lắc, đến b o hòa ã Ở nồng độ sulfate
amon bão hòa, albumin sa l¾ng Để phút Lọc sang èng nghiƯm - èng 3: thu mang thử ph¶n øng biure
c øng dông
- Kết tủa cách protein khơng bị biến tính nghĩa tính chất lý hóa, sinh vật học khơng bị thay đổi Ngời ta thờng dùng phơng pháp để chiết suất protein hoạt tính
2 Sa l¾ng b»ng cån a Nguyªn lý
(3)Kết tủa cồn kết tủa thuận nghịch tiến hành nhiệt độ thấp (O0 đến – 150C)
và tủa đợc tách khỏi cồn cách nhanh chóng b Tiến hành
- èng : ml cån 96o
- èng 2: ml cồn 96o, thêm vào 1-2 giọt NaCl b o hòaÃ
Cho vào ống nghiệm ml dung dịch lòng trắng trứng - ống 3: 1ml cồn 96o, 1ml dung dịch gelatin 1%.
Nhận xét giải thích kÕt qu¶ c øng dơng
- Dùng cồn sát trùng tiêm phẫu thuật - Dùng để tách chiết enzyme
3 Sa lắng nhiệt độ cao a Nguyên lý
Protein đun nóng bị xáo trộn mặt phân tử, lớp vỏ thủy hóa nên tính hịa tan bị đơng vón Hiện tợng xảy mạnh điểm đẳng điện Nếu biến tính xảy pH khác (trong môi trờng kiềm mạnh, acid mạnh), phân tử protein trạng thái tích điện nên khơng bị đơng vón mà dạng dung dịch
b TiÕn hµnh
- LÊy èng nghiƯm, cho vào ống ml dung dịch lòng trắng trứng + ống 1: đun sôi theo dõi kết tđa dÇn dÇn protein
+ ống 2: thêm giọt acetic acid 1% để tạo điểm đẳng điện, đun sôi + ống 3: thêm 0,5 ml acetic acid 10%, đun sơi
+ èng 4: thªm 0,5 ml NaOH 10%, đun sôi
+ ống 5: thêm 0,5 ml acetic acid 10%, 3-4 giọt NaCl b o hòa, đun sôi.Ã Nhận xét giải thích kết
c øng dông
- Dùng nhiệt độ để hấp, sấy tiệt trùng…các dụng cụ
Bµi 2: thùc nghiƯm vỊ enzyme 1 Thủ ph©n tinh bét bëi amylase
a Nguyên lý
(4)b Tiến hành
- Súc miệng nớc cất Ngậm nớc cất khoảng 1-3 phút, khẽ cử động lỡi để trộn nớc bọt với nớc cất, cho qua phễu lọc vào ống nghiệm đư c dd ch a amylase.ợ ứ
- Nhá lªn phiÕn sø hai d y dung dÞch lugol 1% : m· ộ dãy TN ĐC.t - LÊy hai èng nghiÖm
+ èng A: cho ml tinh bét 1%, ml dung dịch amylase (èng TN) + èng B: cho ml tinh bét 1%, ml níc cÊt (èng ĐC)
Lắc hai ng, ố nhỏ vài gi t t ng TN vọ ố l dóy TN, vỗ ài gi t t ng ọ ố ĐC vào l dóy ỗ ĐC Sau kho ng phỳt l i nh vả ỏ l ti p theo ỗ ế Quan sát đổi màu nhận xét
- Phần lại ống thử phản ứng Tromer Nhận xột kết 2 ảnh hởng nhiệt độ
a Nguyªn lý
Phần lớn enzyme có hoạt lực mạnh thân nhiệt Nếu nhiệt độ thấp enzym hoạt động yếu, ngựơc lại nhiệt độ cao enzyme bị tê liệt bị huỷ hoại
b TiÕn hµnh
LÊy èng nghiÖm
+ ống 1: cho ml dung dịch amylase, ngâm vào chậu nớc đá 15 phút + ống 2: cho ml dung dịch amylase, đun sôi , để nguội
+ èng 3: cho ml dung dÞch amylase
Sau cho ống ml dung dịch tinh bột 1% lắc đều, để yên -10 phút thử phản ứng Tromer dd lugol 1% Quan sát màu ống giải thích kết
3 Tác dụng đặc hiệu a Nguyên lý
Amylase vµ sucrase lµ hai enzyme thủy phân liên kết glycoside, nh ng amylase thủy phân liên kết , 1-4 glycoside tinh bột, sucrase thủy phân liên kết , 1-2 glycoside cđa sucrose
b TiÕn hµnh LÊy èng nghiƯm
+ èng 1: cho ml dung dÞch tinh bét 1%, ml dung dÞch amylase + èng 2: cho ml dung dÞch sucrose 1%, ml dung dÞch amylase + èng 3: cho ml dung dÞch sucrose 1%, ml dung dÞch sucrase + èng 4: cho ml dung dÞch tinh bét 1%, ml dung dịch sucrase
(5)4 ảnh hëng cđa pH a Nguyªn lý
Vì có chất protein, nên enzyme mẫn cảm với pH mơi trờng Mỗi loại enzyme có pH tối u hoạt động mỡnh, ví dụ pepsin có hoạt lực mạnh pH 1,5-2,5 pH môi trờng gần pH tối u, tốc độ phản ứng cao, nghĩa enzyme hoạt động mạnh Do thay đổi pH dù nhỏ ảnh hởng đến hoạt độ enzyme, ảnh hởng đến trạng thái ion húa ca enzyme
b Cách tiến hành
Ly thật xác vào ống nghiệm đánh số từ 1- theo dẫn dới đây: Số ống
pH (ml)
5,4
5,8
6,2
6,6
6,8
7,2
7,6
8
Tinh bét 1% ml 1ml ml ml ml ml ml ml Amylase 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml