Nhiên cứu thu nhận glucoamylaza từ nấm mốc aspergillus kawasaki

-i- PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC KHOA QUẢN LÝ NGÀNH CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI TP HỒ CHÍ MINH VÀ TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP LẠC HỒNG TP BIÊN HÒA - ĐỒNG NAI Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG TS HOÀNG KIM ANH Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc só bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng 07 năm 2005 - ii - Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh CỘNG HÒA Xà CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc   NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: VÕ VIẾT PHI Phái: Nam Ngày sinh: 27 - 04 - 1978 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Khoa Học Và Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: - 11 - 00 I TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUCOAMYLAZA TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS KAWASAKI II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Nuôi cấy nấm mốc thu nhận glucoamylaza a Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình nuôi cấy nấm mốc bình tam giác b Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình nuôi cấy nấm mốc hệ thống khay ™ Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần muối khoáng lên khả sinh tổng hợp glucoamylaza phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box – Hunter ™ Tối ưu hóa yếu tố độ dày lớp môi trường, nồng độ mốc giống, hàm ẩm môi trường, thời điểm thu nhận sản phẩm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần Tinh enzym xác định tính chất chế phẩm thu a Trích ly, tủa, tinh glucoamylaza phương pháp sắc ký lọc gel b Xác định số tính chất khối lượng phân tử, nhiệt độ pH tối ưu c Khảo sát khả thủy phân tinh bột hồ hóa tinh bột sống chế phẩm enzym glucoamylaza thu - iii - III NGÀY GIAO NHIỆM VUÏ: IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V HOÏ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1: PGS TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG VI HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2: TS HOÀNG KIM ANH CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM NGÀNH BỘ MÔN QUẢN LÝ NGÀNH Nội dung đề cương luận văn thạc só Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua Ngày … tháng … năm 2005 - iv - Lời cảm ơn Đầu tiên, xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu, quý Thầy, Cô, Cán – Công nhân viên trường Đại Học Bách Khoa Tp HCM, Phòng Đào Tạo Sau Đại Học, Khoa Công Nghệ Hóa Học – Dầu Khí, Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, hết lòng phục vụ công tác đào tạo, truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm quý báu tạo nhiều thuận lợi cho chúng em có hội học tập, nâng cao trình độ, mở mang tầm nhận thức Xin cảm ơn Viện sinh học nhiệt đới, thầy Nguyễn Tiến Thắng, Vũ Văn Độ, cô Đỗ Thị Tuyến, Võ Thị Hạnh anh chị sở tạo điều kiện sở vật chất, máy móc thiết bị cho hoàn thành luận án Xin chân thành cảm ơn Thầy PGS TSKH Ngô Kế Sương, TS Hoàng Kim Anh người tận tình hướng dẫn chúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp Trường ĐHDL Lạc Hồng, động viên hỗ trợ hoàn thành luận án tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn Ba, Má, anh chị chăm chút cho sức khỏe, tinh thần, phương tiện lại nhiều nhiều … Biên Hòa, Ngày 29 tháng 06 năm 2005 Võ Viết Phi -v- MỞ ĐẦU Glucoamylaza enzym sử dụng phổ biến công nghiệp sản xuất sản phẩm lên men chứa cồn, siro glucoza, bánh kẹo, nước giải khát, dược phẩm, y học, Hàng năm giới tiêu thụ 40 triệu USD enzym GA Do sản xuất glucoamylaza ngành công nghiệp quan trọng góp phần tạo nhiều sản phẩm cho xã hội Mục tiêu luận văn nghiên cứu nuôi cấy nấm mốc Aspergillus kawasaki môi trường bán rắn (SSF), thu nhận glucoamylaza để sử dụng công nghệ chế biến thực phẩm Lên men môi trường mà chất trạng thái bán rắn (SSF) phương pháp sử dụng từ lâu để bảo quản thực phẩm, chế biến sản phẩm từ rau, củ, quả, thịt, cá …Điều đó, cho thấy mức độ phổ biến phương pháp từ quy mô thủ công, hộ gia đình quy mô công nghiệp SSF nhà khoa học toàn giới quan tâm cải tiến mạnh mẽ nhằm tăng khả công nghiệp hóa tự động hóa Khi lên men phương pháp này, môi trường nuôi cấy có nước dạng tự chúng kiểm soát thông qua hoạt độ nước, vô trùng tuyệt đối, đặc biệt thích hợp với chủng mốc A niger, A oryzae; A awamori, Rhizopus, Mucor, … Mặt khác, phương pháp thích hợp để sản xuất công nghiệp, tốn lượng, tiết kiệm nước, nước thải gây ảnh hưởng đến môi trường, thời gian thu nhận sản phẩm ngắn, tận dụng nguồn nguyên liệu phụ phế phẩm dồi dào, có sẵn, giá thành hạ, dễ kiếm bã mía, rơm rạ, cám, trấu, mạt cưa, … Lên men SSF dùng để sản xuất phân trộn (composting), loại enzym, sản phẩm trao đổi chất bậc bậc 2, kháng sinh, tăng cường dinh dưỡng cho thức ăn gia súc - vi - Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tiến hành thí nghiệm nuôi nấm mốc bình tam giác, khay nhôm nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng lên trình sinh tổng hợp glucoamylaza theo phương pháp tối ưu hóa cổ điển tối ưu hoá quy hoạch thực nghiệm Các yếu tố ảnh hưởng khảo sát gồm: nồng độ mốc giống, loại tỷ lệ chất thích hợp, ảnh hưởng muối đa lượng vi lượng, thời đểm thu nhận enzym, độ ẩm, pH độ dày lớp môi trường nuôi cấy Sau chiết tách, ly tâm, chế phẩm tinh phương pháp tủa, lọc gel Sephadex, xác định tính chất enzym pH, nhiệt độ thủy phân tối ưu, khả thủy phân dạng chất khác amyloza, amylopectin, tinh bột hồ hóa chưa hồ hóa (tinh bột sống) nghiên cứu Các hướng nghiên cứu tập trung tìm hiểu trình truyền nhiệt, truyền khối bổ sung nguồn dinh dưỡng chất kích thích tăng trưởng nhằm giúp vi sinh vật phát triển mạnh mẽ khắp bề mặt chất Cố định glucoamylaza khảo sát thời gian sử dụng glucoamylaza cố định nhằm tăng hiệu suất thủy phân, nâng cao hiệu phục vụ ngành công nghiệp thực phẩm ngành khác có liên quan.Với thời gian có hạn, chắn luận án nhiều hạn chế thiếu sót Chúng mong nhận góp ý quý báu Thầy cô, Anh Chị Bạn Xin chân thành cảm ơn - vii - MỤC LỤC PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang A TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Lịch sử hình thành trình lên men môi trường bán rắn .1 Những khía cạnh lên men môi trường bán rắn .2 Các kiểu lên men 4 Các loại vi sinh vật 5 Sinh trưởng nấm mốc chất rắn Các chất thường dùng lên men bán rắn .7 Các sản phẩm sản xuất lên men môi trường bán rắn .8 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men bán raén 11 So sánh với trình lên men môi trường lỏng 13 B TỔNG QUAN VỀ AMYLAZA Một số amylaza quan trọng 15 Ứng dụng amylaza vi sinh vật 20 Sản xuất amylaza .21 3.1 Giới thiệu chung sản xuất amylaza .21 3.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp amylaza 22 3.3 Sinh trưởng sinh tổng hợp amylaza vi sinh vật .24 3.4 Môi trường nuôi cấy để sinh tổng hợp enzym amylaza 25 3.4.1 Quá trình dinh dưỡng tế bào vi sinh vật 25 3.4.2 Thành phần môi trường nuôi cấy sản xuất amylaza 27 Tinh saïch amylaza 30 4.1 Sơ đồ chung trình thu chế phẩm enzym từ nấm mốc lên men phương pháp bề mặt 30 - viii - 4.2 Một số giai đoạn trình thu enzym từ canh trường bề mặt .31 PHẦN NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu .36 Phương pháp nghiên cứu 37 2.1 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc 37 2.2 Phương pháp tinh enzym .40 2.3 Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận enzym 41 2.4 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 42 2.5 Phương pháp xác định tính chất enzym .44 2.6 Caùc phương pháp phân tích hoá sinh 45 PHẦN KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN A NUÔI CẤY NẤM MỐC ĐỂ THU NHẬN ENZYM GLUCOAMYLAZA Kết nuôi cấy bình tam giác 46 1.1 Lựa chọn chất thích hợp để nuôi cấy nấm mốc 46 1.2 Khảo sát tỷ lệ phối trộn tối ưu bã sắn cám gạo .48 1.3 Ảnh hưởng nồng độ mốc giống lên sinh tổng hợp glucoamylaza .49 1.4 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy lên sinh tổng hợp glucoamylaza .51 1.5 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường nuôi cấy 52 1.6 Khảo sát thời điểm thu nhận enzym (thời gian nuôi cấy) 53 1.7 Khảo sát ảnh hưởng khoáng chất lên sinh tổng hợp glucoamylaza 56 1.7.1 Khảo sát ảnh hưởng K2HPO4 lên sinh tổng hợp glucoamylaza .57 1.7.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ magiê lên sinh tổng hợp glucoamylaza 58 1.7.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitơ lên sinh tổng hợp glucoamylaza 59 1.7.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ sắt lên sinh tổng hợp glucoamylaza 61 1.7.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối đồng lên sinh tổng hợp glucoamylaza .62 - ix - 1.7.6 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối đồng lên sinh tổng hợp glucoamylaza .63 Kết trình nuôi cấy khay nhôm 64 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng khoáng lên sinh tổng hợp glucoamylaza phương pháp quy hoạch thực nghiệm quay bậc 2, yếu tố Box-Hunter 64 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nồng độ mốc giống, thời điểm thu nhận, độ dày lớp môi trường, độ ẩm môi trường lên khả sinh tổng hợp enzym nấm mốc 74 2.3 Kết nuôi cấy nấm mốc môi trường tối ưu hoá 76 B TINH SẠCH ENZYM GA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG Quá trình trích ly, tủa, tinh enzym glucoamylaza Sephadex .77 Nghiên cứu số tính chất enzym glucoamylaza thu từ A kawasaki 79 2.1 Xác định pH tối ưu 79 2.2 Nhiệt độ tối ưu 80 2.3 Khối lượng phân tử cuûa enzym 2.4 Khả thủy phân enzym 81 PHẦN KẾT LUẬN 84 PHẦN ĐỀ NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 85 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC 81 -x- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các sản phẩm lên men bán rắn 11 Bảng 1.2 So sánh thuận lợi hạn chế lên men chất rắn với lên men dung dịch 13 Baûng 1.3 Glucoamylaza từ loài nấm mốc khác 16 Bảng1.4 Một số tính chất glucoamylaza 18 Baûng 1.5 Một số thông số trình thủy phân sử dụng glucoamylaza hoà tan không hoà tan 19 Bảng 2.1 Các mức biến thiên yếu tố quay bậc hai Box – Hunter 42 Bảng 2.2 Các mức yếu tố quy hoach toàn phần 43 Bảng 3.1 Hoạt tính GA từ A kawasaki môi trường khác 46 Bảng 3.2 Hoạt tính GA thu môi trường có tỷ lệ bã sắn: cám gạo khác 48 Baûng 3.3 Tỷ lệ mốc giống cấy vào 50g chất rắn hoạt tính enzym glucoamylaza 50 Bảng 3.4 Hoạt tính enzym glucoamylaza thu môi trường có pH khác Bảng 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường lên hoạt tính enzym .52 Bảng 3.6 Các thời điểm thu nhận glucoamylaza 54 Bảng 3.7 Ảnh hưởng lượng muối phốtpho lên hoạt tính glucoamylaza 57 Bảng 3.8 Ảnh hưởng Mg lên sinh tổng hợp glucoamylaza 58 Bảng 3.9 Ảnh hưởng muối nitơ vô lên sinh tổng hợp glucoamylaza 60 Bảng 3.10 Tỷ lệ muối sắt môi trường hoạt tính glucoamylaza 61 Bảng 3.11 Ảnh hưởng muối đồng môi trường lên hoạt tính glucoamylaza 62 Bảng 3.12 Ảnh hưởng muối kẽm môi trường lên hoạt tính 51 - XXXIII - - XXXIV - Phụ lục 5.7: Số liệu qua khảo sát nhiệt độ thủy phân tối ưu - XXXV - - XXXVI - Phụ lục 5.8: Số liệu khảo sát độ ổn định GA theo thời gian - XXXVII - Phụ lục 5.9: Khảo sát tốc độ thủy phân tinh bột hồ hóa tinh bột sống - XXXVIII - - XXXIX - - XL - - XLI - Phụ lục 5.10: Xác định số bào tử nấm mốc 1ml huyền phù Số bào tử đếm buồng đếm hồng cầu Haemacytometer hãng Hirschmann, kết sau: Lần 41 57 48 73 70 Laàn 35 60 29 79 51 Laàn 53 59 33 43 44 Trung bình lần đếm tổng số bào tử ô lớn: (289 + 254 + 232)/3 = 258.33 Khi đó, số lượng tế bào 1ml mẫu nghiên cứu tính công thức sau: ax 400 x10 x10 n 258 ,33 x 400 x10 x10 N = = = 129 ,16 10 /1ml bx ,1 80 x ,1 Phụ lục 5.11:Chỉ số DE (dextrose equivalent) Là đại lượng khả khử so với chuẩn 100% đường glucose (dextrose) hay số gam tương đương D-glucose 100g chất khô sản phẩm Chỉ số đượ c xác định phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitro salicilic acid) hay phương pháp sắc ký (Bernetti 1992) - XLII - Phụ lục 5.12: Các hình ảnh trình thí nghiệm Hình 1: GA từ Asp kawasaki Hình 2: GA Novo Đan Mạch - XLIII - Phụ lục 6: Thông tin dinh dưỡng cám gạo: lượng, cacbohydrat, protein, chất béo Dinh dưỡng 100 g cup (118g) Năng lượng 316.0 372.9 Chất béo tổng số 20.9 g 24.6 g Chất béo bão hòa 4.2 g 4.9 g Chất béo không no (cao phân tử) 7.5 g 8.8 g Chất béo không no đơn phân tử 7.5 g 8.9 g Cholesterol 0.0 mg 0.0 mg Natri 5.0 mg 5.9 mg Carbohydrate tổng số 49.7 g 58.6 g Dietary Fiber 21.0 g 24.8 g Đường tổng số 0.9 g 1.1 g Protein 13.4 g 15.8 g Năng lượng từ chất béo 174.5 kcal 205.9 kcal Năng lượng từ carbohydrates 116.8 kcal 137.8 kcal Năng lượng từ protein 24.3 kcal 28.7 kcal 6.1 g 7.2 g 1322.0 kj 1560.0 kj Chaát tro 10.0 g 11.8 g Sucrose 0.5 g 0.6 g Glucose (dextrose) 0.2 g 0.2 g Fructose 0.2 g 0.2 g Calcium, Ca 57.0 mg 67.3 mg Iron, Fe 18.5 mg 21.9 mg Nước Năng lượng Các khoáng chất - XLIV - Dinh dưỡng 100 g cup (118g) Magnesium, Mg 781.0 mg 921.6 mg Phosphorus, P 1677.0 mg 1978.9 mg Potassium, K 1485.0 mg 1752.3 mg Zinc, Zn 6.0 mg 7.1 mg Copper, Cu 0.7 mg 0.9 mg Manganese, Mn 14.2 mg 16.8 mg Selenium, Se 15.6 mcg 18.4 mcg Vitamin C, total ascorbic acid 0.0 mg 0.0 mg Thiamin 2.8 mg 3.2 mg Riboflavin 0.3 mg 0.3 mg Niacin 34.0 mg 40.1 mg Pantothenic acid 7.4 mg 8.7 mg Vitamin B-6 4.1 mg 4.8 mg Folate, total 63.0 mcg 74.3 mcg Folic acid 0.0 mcg 0.0 mcg Folate, food 63.0 mcg 74.3 mcg Folate, DFE 63.0 mcg_DFE 74.3 mcg_DFE Vitamin B-12 0.0 mcg 0.0 mcg Vitamin A, IU 0.0 IU 0.0 IU 0.0 mcg_RAE 0.0 mcg_RAE Retinol 0.0 mcg 0.0 mcg Vitamin E (alpha-tocopherol) 4.9 mg 5.8 mg Vitamin K (phylloquinone) 1.9 mcg 2.2 mcg Fatty acids, total saturated 4.2 g 4.9 g 4:0 0.0 g 0.0 g 6:0 0.0 g 0.0 g Vitamins Vitamin A, RAE Lipids (Fat) - XLV - Dinh dưỡng 100 g cup (118g) 8:0 0.0 g 0.0 g 10:0 0.0 g 0.0 g 12:0 0.0 g 0.0 g 14:0 0.1 g 0.1 g 16:0 3.6 g 4.2 g 18:0 0.4 g 0.4 g Fatty acids, total monounsaturated 7.5 g 8.9 g 16:1 undifferentiated 0.1 g 0.1 g 18:1 undifferentiated 7.5 g 8.8 g 20:1 0.0 g 0.0 g 22:1 undifferentiated 0.0 g 0.0 g Fatty acids, total polyunsaturated 7.5 g 8.8 g 18:2 undifferentiated 7.1 g 8.4 g 18:3 undifferentiated 0.3 g 0.4 g 18:4 0.0 g 0.0 g 20:4 undifferentiated 0.0 g 0.0 g 20:5 n-3 0.0 g 0.0 g 22:5 n-3 0.0 g 0.0 g 22:6 n-3 0.0 g 0.0 g Tryptophan 0.1 g 0.1 g Threonine 0.6 g 0.7 g Isoleucine 0.6 g 0.7 g Leucine 1.0 g 1.2 g Lysine 0.7 g 0.8 g Methionine 0.3 g 0.4 g Cystine 0.3 g 0.4 g Phenylalanine 0.6 g 0.7 g Amino acids - XLVI - Dinh dưỡng 100 g cup (118g) Tyrosine 0.4 g 0.5 g Valine 0.9 g 1.0 g Arginine 1.1 g 1.2 g Histidine 0.4 g 0.4 g Alanine 1.0 g 1.1 g Aspartic acid 1.3 g 1.5 g Glutamic acid 1.9 g 2.2 g Glycine 0.9 g 1.0 g Proline 0.7 g 0.8 g Serine 0.7 g 0.8 g 0.0 g 0.0 g Caffeine 0.0 mg 0.0 mg Theobromine 0.0 mg 0.0 mg Carotene, beta 0.0 mcg 0.0 mcg Carotene, alpha 0.0 mcg 0.0 mcg Cryptoxanthin, beta 0.0 mcg 0.0 mcg Lycopene 0.0 mcg 0.0 mcg 220.0 mcg 259.6 mcg Other Alcohol, ethyl Lutein + zeaxanthin Nguồn http://www.food-data.com/ TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ****** ™ HỌ VÀ TÊN: VÕ VIẾT PHI ™ NĂM SINH: 27-04-1978 ™ NƠI SINH: BIÊN HÒA – ĐỒNG NAI ™ ĐỊA CHỈ LIÊN LẠC: 6/1 KHU PHỐ QUỐC LỘ 15 PHƯỜNG TAM HÒA BIÊN HÒA – ĐỒNG NAI ĐIỆN THOẠI: 061 811201 ™ QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO - NĂM 1996 ĐẾN NĂM 2001: HỌC ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - NĂM 2001 ĐẾN 2004 HỌC CAO HỌC TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ™ QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC - NĂM 2001 ĐẾN 2005: GIẢNG DẠY TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG - ĐỒNG NAI ... TÀI NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUCOAMYLAZA TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS KAWASAKI II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Nuôi cấy nấm mốc thu nhận glucoamylaza a Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình nuôi cấy nấm mốc bình... điện glucoamylaza từ nguồn khác không đồng nhất: glucoamylaza từ A niger 6,5; glucoamylaza từ A awamori 7,5; glucoamylaza từ Rh delemar 7,4 Đa số chế phẩm glucoamylaza vi sinh vật (vi khuẩn, nấm. .. tài nghiên cứu sinh tổng hợp glucoamylaza từ nấm mốc Aspergillus kawasaki số thành viên hệ amylaza hệ enzym quan trọng có ý nghóa to lớn công nghệ chế biến thực phẩm Mặc dù thu nhận từ nhiều nguồn