Khảo sát genotype hbv ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính xơ gan và ung thư gan do hbv tại bệnh viện đa khoa trung ƣơng cần thơ

Hiện tại nhờ vào sự phát triển của kỹ thuật Sinh học phân tử bước đầu đãcho thấy rằng có mối liên hệ giữa genotype với tiên lượng nặng của bệnh viêm gan B mạn tính.. Ngoài raSumi H và cộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TRẦN THỊ NHƢ LÊ

KHẢO SÁT GENOTYPE HBV

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

XƠ GAN VÀ UNG THƢ GAN DO HBV

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƢƠNG CẦN THƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH

-TRẦN THỊ NHƢ LÊ

KHẢO SÁT GENOTYPE HBV

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

XƠ GAN VÀ UNG THƢ GAN DO HBV

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƢƠNG CẦN THƠ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài “Khảo sát genotype HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư gan do HBV tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Cần Thơ”, chúng tôi xin bày tỏ lòng cám ơn đến:

- Bộ môn Vi Sinh trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh vàtrường Đại Học Y Dược Cần Thơ

- Ban Giám Hiệu, Phòng Nghiên cứu khoa học - hợp tác quốc tế Trường ĐạiHọc Y Dược Cần Thơ

- Ban Giám Đốc bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Cần Thơ

- Khoa Nhiễm, khoa Khám, khoa Tiêu hóa và khoa Xét nghiệm bệnh viện ĐaKhoa Trung Ương Cần Thơ

- Cùng sự giúp đỡ tận tình của TS.BS Lục Thị Vân Bích, người đã hướngdẫn tôi tận tình trong thời gian qua

Cuối cùng tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô và đồng nghiệp đãtạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài này

Xin chân thành cám ơn!!!

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả đƣợc trình bày trong đề tài là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất

kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả đề tài

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm vi sinh vật của virus viêm gan B 4

1.1.1 Cấu trúc 4

1.1.2 Chu trình sống của HBV 6

1.1.3 Genotype của HBV 7

1.2 Kỹ thuật phát hiện genotype HBV 11

1.2.1 Giải trình tự 11

1.2.2 Realtime – PCR: 12

1.2.3 PCR RFLP 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 18

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.1.3 Cỡ mẫu nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21

2.2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu 21

2.2.3 Phương tiện nghiên cứu 22

2.2.4 Phương pháp thu thập mẫu 22

2.2.5 Kỹ thuật Realtime PCR 23

2.3 Xử lý số liệu 25

2.4 Đạo đức nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.2 Tỉ lệ các loại genotype HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ

gan và ung thư gan 27

3.3 Mối liên hệ giữa các genotype với các tình trạng bệnh lý 29

3.4 Mối liên hệ giữa các genotype với HbeAg, men gan ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thư gan 31

3.4.1 Phân bố genotype HBV theo HbeAg 31

3.4.2 Phân bố genotype HBV theo men gan 33

3.5 Mối liên hệ giữa các genotype với độ tuổi, giới tính ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thư gan 35

3.5.1 Phân bố genotype HBV theo giới tính 35

3.5.2 Phân bố genotype HBV theo độ tuổi 36

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39

4.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 39

4.2 Tỉ lệ các loại genotype HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư gan 40

4.3 Mối liên hệ giữa các genotype với các tình trạng bệnh lý 41

4.4 Mối liên hệ giữa các genotype với HbeAg, men gan ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thư gan 43

4.4.1 Phân bố genotype HBV theo HbeAg 43

4.4.2 Phân bố genotype HBV theo men gan 44

4.5 Mối liên hệ giữa các genotype với độ tuổi, giới tính ở các bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thư gan 45

4.5.1 Phân bố genotype HBV theo giới tính 45

4.5.2 Phân bố genotype HBV theo độ tuổi 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

KẾT LUẬN 48

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 55

Phụ lục 1: Phiếu thu thập số liệu 55

Phụ lục 2: Bản đồng thuận tham gia nghiên cứu của bệnh nhân 57

Phụ lục 3: Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu 58

Phụ lục 4: Bộ kit REALTIME PCR định genotype HBV 61

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Phân phối toàn cầu của genotype HBV và subgenotypes (genotype phụ): 8

Bảng 2 Mồi và mẫu dò trên gene S của HBV 24

Bảng 3.1: So sánh genotype HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan 30

Bảng 3.2: So sánh genotype HBV ở bệnh nhân xơ gan và ung thƣ gan 30

Bảng 3.3: So sánh genotype HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính với ung thƣ gan 31 Bảng 3.4: Phân bố genotype HBV theo HbeAg ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 32

Bảng 3.5: Phân bố genotype HBV theo HbeAg ở bệnh nhân xơ gan 32

Bảng 3.6: Phân bố genotype HBV theo HbeAg ở ung thƣ gan 32

Bảng 3.7: Phân bố genotype HBV theo men gan ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 33

Bảng 3.8: Phân bố genotype HBV theo men gan ở bệnh nhân xơ gan 34

Bảng 3.9: Phân bố genotype HBV theo men gan ở bệnh nhân ung thƣ gan 34

Bảng 3.10: Phân bố genotype HBV theo giới tính ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 35

Bảng 3.11: Phân bố genotype HBV theo giới tính ở bệnh nhân xơ gan 36

Bảng 3.12: Phân bố genotype HBV theo giới tính ở bệnh nhân ung thƣ gan 36

Bảng 3.13: Phân bố genotype HBV theo tuổi ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 37

Bảng 3.14: Phân bố genotype HBV theo tuổi ở bệnh nhân xơ gan 37

Bảng 3.15: Phân bố genotype HBV theo tuổi ở bệnh nhân ung thƣ gan 38

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính trong mẫu nghiên cứu 26

Biểu đồ 3.2: Phân bố tình trạng bệnh trong mẫu nghiên cứu 26

Biểu đồ 3.3: Phân bố nhóm tuổi trong mẫu nghiên cứu 27

Biểu đồ 3.4: Phân bố genotype HBV trong mẫu nghiên cứu 27

Biểu đồ 3.5: Phân bố Genotype HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính 28

Biểu đồ 3.6: Phân bố genotype HBV ở bệnh nhân xơ gan 28

Biểu đồ 3.7: Phân bố genotype HBV ở bệnh nhân ung thƣ gan 29

Biểu đồ 3.8: Phân bố genotype HBV theo các bệnh lý 29

Biểu đồ 3.9: Phân bố genotype HBV theo HbeAg trong mẫu nghiên cứu 31

Biểu đồ 3.10: Phân bố genotype HBV theo men gan trong mẫu nghiên cứu 33

Biểu đồ 3.11: Phân bố genotype HBV theo giới tính trong mẫu nghiên 35

Biểu đồ 3.12: Phân bố genotype HBV theo tuổi trong mẫu nghiên cứu 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc HBV 4

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc gen của HBV 5

Hình 1.3: Chu trình sống của HBV 6

Hình 2: Phân tích kết quả Realtime-PCR 25

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

anti-Hbe Antibody to Hepatitis B e antigen

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới có ít nhất 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B vàtrong số đó có khoảng 400 triệu người đang bị viêm gan B mạn tính, trong đó 20-25% sẽ bị xơ gan hay ung thư gan (WHO, 2002)(50)

Dựa theo thống kê thống kê của tổ chức y tế thế giới Việt Nam là một trongnhững nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao nhất thế giới (thống kê mới nhấtthì tỷ lệ người mang HbsAg (+) khoảng 10-20%)(50) Mặc dù trong những năm vừaqua Việt Nam đã đẩy mạnh việc chủng ngừa virus viêm gan B trên diện rộng nhưngcon số bệnh nhân bị bệnh viêm gan B chỉ thuyên giảm một cách chậm chạp Cókhoảng 3,5 triệu người đang sống tại Việt Nam sẽ tử vong vì những biến chứng củabệnh này, đây là một con số rất đáng lo ngại cho một nước xấp xỉ 100 triệu dân.Vấn đề đặt ra cho chúng ta là làm sao ngăn chặn được những biến chứng do virusviêm gan B gây nên ở những bệnh nhân đã bị nhiễm và ngăn ngừa được tình trạngnhiễm virus viêm gan B dựa vào chương trình tiêm chủng mở rộng Giải pháp củachúng ta là cần đẩy mạnh hơn nữa chương trình chủng ngừa virus viêm gan B ởnhững đối tượng chưa bị nhiễm, thứ hai là cần phải tìm ra được những yếu tố nguy

cơ thúc đẩy diễn tiến nặng của bệnh ở những bệnh nhân đã nhiễm virus viêm gan B

để có biện pháp ngăn ngừa

Hiện tại nhờ vào sự phát triển của kỹ thuật Sinh học phân tử bước đầu đãcho thấy rằng có mối liên hệ giữa genotype với tiên lượng nặng của bệnh viêm gan

B mạn tính Cụ thể ở Châu Âu theo ghi nhận của công trình nghiên cứu của Mayerat

và cộng sự thì genotype A có liên quan đến tình trạng viêm gan mạn hơn làgenotype D Ở Châu Á genotype C hơn genotype B (Ogawa và cộng sự) Ngoài raSumi H và cộng sự(23)nghiên cứu trên 585 bệnh nhân viêm gan B mạn tính ghi nhậngenotype C liên quan đến tình trạng xơ gan và ung thư gan cao hơn genotype B.Nghiên cứu tại Hồng Kông(16) ghi nhận nhóm bệnh nhân có genotype C có tỉ lệ xơhóa tiến triển cao hơn nhóm bệnh nhân có genotype B (25% so với 19%; p= 0,015).Nghiên cứu tại Đài Loan(38)

ghi nhận genotype C là phổ biến ở những bệnh nhân xơ

gan và ung thư gan trên 50 tuổi so với các genotype khác, khác biệt có ý nghĩathống kê (82% so với 52%, p=0,03) Nghiên cứu tại Nhật Bản(34)

cũng ghi nhậngenotype C liên quan đến tình trạng xơ gan và ung thư gan một cách có ý nghĩathống kê (p < 0,05) Tại Việt Nam có nghiên cứu của tác giả Phạm Hoàng Phiệt,Bùi Hữu Hoàng và cộng sự (2000-2003)(5)

ghi nhận bệnh nhân xơ gan và HCC cógenotype C trội hơn (chiếm 56,5%) Nguy cơ xơ gan ở người mang HBV cógenotype C cao gấp 4,67 lần so với người có mang genotype B Tương tự bệnhnhân bị HCC do HBV genotype C cũng cao gấp 3,59 lần nhiễm HBV genotype B

Từ những số liệu này cho thấy rằng genotype của virus viêm gan B có liênquan mật thiết với tình trạng nặng của bệnh Tuy nhiên sự phân bố genotype củavirus viêm gan lại tùy thuộc vào địa lý và thành phần chủng tộc do đó chúng takhông thể dựa vào số liệu nghiên cứu của các nước để áp dụng cho việc theo dõi vàđiều trị của bệnh nhân người Việt Nam Và hiện tại Thành Phố Cần Thơ chưa có đềtài nào khảo sát về genotype HBV nên chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Khảosát genotype HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư gan tạiBệnh viện Đa Khoa Trung Ương Cần Thơ”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát:

Khảo sát genotype HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan và ungthƣ gan do HBV

Mục tiêu chuyên biệt:

- Xác định các loại genotype HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơgan và ung thƣ gan bằng kỹ thuật Realtime PCR

- Khảo sát mối liên hệ giữa các genotype với các tình trạng bệnh lý

- Khảo sát mối liên hệ giữa các genotype với HbeAg, men gan ở các bệnhnhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thƣ gan

- Khảo sát mối liên hệ giữa các genotype với độ tuổi, giới tính ở các bệnhnhân viêm gan B mạn tính, xơ gan, ung thƣ gan

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm vi sinh vật của virus viêm gan B

1.1.1 Cấu trúcHBV thuộc họ Hepadnaviridae(2), là một loại virus có ái tính đối với tế bàogan Cấu trúc cơ bản gồm:

Hình 1.1: Cấu trúc HBVNhân DNA: Có dạng vòng với khoảng 3200nucletid (3,2kb), đây là mộtchuỗi xoắn kép không hoàn toàn gồm 2 chuỗi đơn có chiều dài khác nhau:

+ Chuỗi dài nằm ngoài có điện tích âm tạo nên một vòng tròn liên tục vớichiều dài cố định là 3,2kb Chuỗi gen này mã hóa cho tất cả các thông tin di truyềncủa virus

+ Chuỗi ngắn nằm trong có điện tích dương với chiều dài thay đổi từ 100% chiều dài bộ gen

50-2002 James A perkins

lồng vào nhau hoặc gối chồng lên nhau Do đó với 1 chiều dài giới hạn bộ gen củaHBV vẫn có thể mã hóa cho nhiều loại protein khác nhau.

Quá trình đọc mã được được bắt đầu từ bộ ba Nucletid AUG (8), được gọi làvùng khởi đầu mã hóa và chấm dứt bằng bộ ba TAG, được gọi là vùng kết thúc mãhóa

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc gen của HBV

- Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa sự tổng hợp khángnguyên HBsAg Đoạn gen S tổng hợp nên Protein S (Small)

- Gen C: mã hóa cho sự tổng hợp protein của nucleocapsid Gen C có 2đoạn là đoạn trước nhân và đoạn nhân Đoạn trước nhân tổng hợp HbeAg, đoạnnhân tổng hợp HBcAg

- Gen X: mã hóa cho sự tổng hợp protein HBx Chức năng đầy đủ củaprotein HBx chưa được biết rõ Protein HBx có vai trò chuyển hoạt hóa trong quátrình sao chép của siêu vi Vì vậy, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chếsinh ung thư ở các tế bào gan bị nhiễm

- Gen P: là gen lớn nhất chiếm 80% chiều dài bộ gen mã hóa cho polymerase Vùng gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có mộtchức năng riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAse H Trong đó,vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu trách nhiệm cho việc

DNA-tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNA-dependent DNA được chia ra thành 7vùng đặt tên từ A – G.

+ Những vi cầu có đường kính 20-22nm và những loại ống có đường kính20-22nm, dài 40-400nm Hai dạng này là những virion không hoàn chỉnh (chỉ cómàng ngoài không có nhân DNA do đó chúng không có tính lây nhiễm)

1.1.2 Chu trình sống của HBV(3)

Hình 1.3: Chu trình sống của HBV(1) Phần vỏ của HBV bám vào màng tế bào gan nhờ sự nhận biết của thụthể trên màng tế bào gan, sau đó siêu vi hòa nhập với protein màng của tế bào gan

và xâm nhập vào tế bào gan

(2) Sau khi vào tế bào chất, chỉ có phần lõi chứa DNA và men DNA

(3) Tại nhân tế bào gan, DNA được sửa chữa để tạo thành DNA vòng khépkín (covalently-close circular DNA = cccDNA).

(4) cccDNA được xem là khuôn để sao chép RNA của siêu vi

(5) mRNA được giải mã tạo thành các protein của siêu vi (protein lõi,polymerase, protein X, protein bề mặt siêu vi) trong tế bào chất

(6) Protein lõi (core protein) bao bọc RNA tiền genome (RNA pregenome)

và men polymerase tạo thành capsid (7)

(8,9) RNA tiền genome sẽ sao chép ngược thành DNA

(10) Capsid chứa DNA mới được tổng hợp này có thể phóng thích DNA vàonhân tế bào gan để tạo thành cccDNA hay (11) sẽ được ghép thêm phần vỏ bọctrong mạng lưới nội bào (endoplasmic reticulum = ER) và thể Golgi sau đó phóngthích ra khỏi tế bào gan dưới dạng virion hoàn chỉnh

1.1.3 Genotype của HBV

 Sự phân bố các genotype HBVNgười ta ước tính tần suất biến đổi các nucleotide trong bộ gen của HBV là1,4-3,2 x 10-5 vị trí năm Chính những biến đổi đã định hình và đủ lớn đã cho phépngười ta chia HBV thành 4 nhóm huyết thanh chính và 9 nhóm huyết thanh phụ dựatrên các quyết định kháng nguyên của HbsAg Mặt khác, HBV gây bệnh ở ngườicòn chia thành 8 kiểu gen khác nhau(8) (genotype) được gọi tên theo các chữ cái từ

A đến I Việc phân loại kiểu gen của HBV dựa trên sự khác biệt của từ 8% trình tựnucleotide trở lên Từ các kiểu gen chính này, dựa trên sự khác biệt tối thiểu 4%trình tự các nucleotide, người ta còn chia chúng ra thành những kiểu gen phụ(subgenotype) khác nhau(8) Và sự phân bố của các genotype này có mối liên hệ mậtthiết về mặt địa lý cũng như thành phần chủng tộc:

Bảng 1: Phân phối toàn cầu của genotype HBV và subgenotypes (genotype phụ):(40), (41), (27)

Genotype Sự phân bố (genotype phụ) Subgenotype Sự phân bố

A Mỹ(19), Tây Bắc Âu Aa/A1 Châu Á và Châu Phi

Ae/A2 Châu Âu và Mỹ

D4 Quần đảo Solomon, Châu Đại

+ Nghiên cứu của Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga và cộng sự(1) 2004) về genotype của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mạn tính cho thấygenotype C chiếm 17,4%, genotype B 63,9% và genotype A chiếm 0,8%.

(2003-+ Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Đỗ Quyên, Bùi Hữu Hoàng(7) ghi nhận tỉ lệbệnh nhân đồng nhiễm genotype B+ C là 0,8%

+ Nghiên cứu của Bùi Xuân Trường, Nguyễn Công Long và cộng sự(2006)(10) trên nhóm bệnh nhân được thực hiện ở Osaka (Nhật) cho thấy genotype B

và C chiếm đa số ở người Việt Nam Trong đó genotype B chiếm 70,3%, genotype

C chiếm 29,7% Các tác giả cũng đã phát hiện nhiều trường hợp có đột biến T1653

ở bệnh nhân có genotype C 71,6% và genotype B 4,9%

+ Thuy Le TT và cộng sự (2005)(43) thực hiện ở Hà Nội cho thấy chỉ có 2genotype B và C ở những bệnh nhân Việt Nam nhiễm HBV mạn tính Trong đógenotype B chiếm 82% và genotype C chiếm 18%

+ Năm 2009 tác giả Nguyen LH và cộng sự(26) đã công bố kết quả nghiêncứu được thực hiện ở những bệnh nhân người Việt Nam, người Trung Quốc định cưtại Mỹ Kết quả cho thấy người bệnh nhân người Việt Nam có tỉ lệ nhiễm genotype

B cao hơn những bệnh nhân người Trung Quốc (74% so với 55%) Tuy nhiên,genotype C thì lại thấp hơn (25% so với 43%, p=0,001)

Kết quả của các nghiên cứu này hết sức quan trọng vì những thông số nàycho thấy dù người Việt Nam sống ở bất cứ nước nào thì genotype HBV vẫn khôngthay đổi

 Ý nghĩa lâm sàng của các genotype HBVTrong nhiều nghiên cứu ghi nhận genotype như là một dấu hiệu chỉ điểm vềdiễn tiến nặng của bệnh khi nhiễm phải HBV Tỷ lệ mắc HCC có liên quan mậtthiết với genotype , giới tính, tuổi tác, tiền lõi A1896 đột biến, và promoter lõi cơbản T1762 A1764 của HBV Cụ thể kết quả nghiên cứu của các tác giả ghi nhận:

+ Nghiên cứu của tác giả Chu et al(2002)(18)

(n=167) thì tỉ lệ 38,9% bệnhnhân nhiễm genotype B và 61,1% bệnh nhân nhiễm genotype C có xét nghiệmHbeAg dương tính Tỷ lệ tích lũy của việc mất kháng nguyên HBeAg là 8%, 30%,

và 50% trong genotype bệnh nhân B Tỷ lệ tích lũy mất kháng nguyên HbeAg ởbệnh nhân nhiễm genotype C là: 0%, 23%, và 38% trong thời gian nghiên cứu là 1,

3, và 5 năm (p <0,05) Genotype B liên quan với sự mất kháng nguyên HBeAg caohơn 2,3 lần so với bệnh nhân nhiễm genotype C của HBV

+ Nghiên cứu của tác giả Yu et al(2005)(32)

(n=432) ghi nhận genotype Cgặp ở bệnh nhân HCC cao gấp 5,11 lần so với bệnh nhân nhiễm các genotype khácmột cách có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng genotype C có liên quan đến tình trạngung thư ở những bệnh nhân trẻ tuổi Báo cáo ghi nhận độ tuổi trung bình củagenotype B và C bệnh nhân bị HCC là 70,1 ± 9,2 năm và 55,2 ± 9,7 năm, tương ứng(p <0,01)

+ Fujie H (2001)(22) Khảo sát genotype ở bệnh nhân ung thư gan tại NhậtBản ghi nhận, genotype C ở bệnh nhân trên 50 tuổi chiếm tỉ lệ cao hơn nhiễmgenotype B (80% so với 52%, p<0,05)

+ Orito et al(35) (Ba: 13; Bj: 22; C: 256) báo cáo rằng genotype Bj liên quanđến tình trạng HCC ở người cao tuổi, trong khi genotype C lại liên quan đến HCC ởnhững người trong độ tuổi trẻ hơn (p <0,01), tuổi trung bình cho bệnh nhân HCCcũng cao hơn đáng kể trong các trường hợp nhiễm Bj hơn so với các trường hợp bịnhiễm Ba-(p <0,01)

Ngược lại, các nghiên cứu khác đã kết luận rằng genotype B có liên quanđến phát triển HCC ở những người trẻ và genotype C thường gặp ở những người có

độ tuổi lớn hơn Tác giả Ni et al(34)

báo cáo rằng trong số 26 trẻ em bị HCC do HBV

có 74% đã bị nhiễm bệnh với genotype B Tương tự như vậy, Yuan et al(47) (N = 34HCC bệnh nhân; B: 21; C1: 9; C2: 4; ELISA và RFLP) báo cáo rằng tất cả các bệnhnhân HCC tuổi ≤ 35 năm bị nhiễm với Ba subgenotype, trong khi tất cả cácsubgenotype C2 HCC bệnh nhân trên 50 tuổi

+ Henry L.Chan (2007)(16) với 426 bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính đangsinh sống tại Hồng Kông thì có 25 bệnh nhân tiến triển đến HCC Trong đó

genotype C chiếm cao gấp 2,84 lần và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p=0,04).

+ Một nghiên cứu của Phạm Hoàng Phiệt, Bùi Hữu Hoàng và cộng sự(2000-2003)(5) ghi nhận genotype B chiếm 45,5%, C chiếm 34,1% và A chiếm 5%.Trong số này bệnh nhân xơ gan và HCC có genotype C trội hơn (chiếm 56,5%).Nguy cơ xơ gan ở người mang HBV có genotype C cao gấp 4,67 lần so với người

có mang genotype B Tương tự bệnh nhân bị HCC do HBV genotype C cũng caogấp 3,59 lần nhiễm HBV genotype B

+ Nghiên cứu của Đỗ Thị Thu Hương, Trần Ngọc Thanh, Phạm Hùng Vân

và cộng sự (2009)(6) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Đà Nẵng ghi nhận 87,3%nhiễm genotype B và 12,7% bệnh nhân nhiễm genotype C

Tóm lại, genotype C có liên quan mật thiết với tiến triển nhanh đến xơ gan,ung thư gan HBeAg dương tính cao hơn Chúng ta cần có nhiều công trình nghiêncứu hơn nữa để khẳng định điều này

1.2 Kỹ thuật phát hiện genotype HBV

Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác địnhgenotype HBV(37) như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphism) và Realtime -PCR Mỗi phương pháp có những ưu và nhượcđiểm khác nhau:

1.2.1 Giải trình tự

Để thực hiện được kỹ thuật giải trình tự chuỗi, chúng ta phải thực hiện 3bước chính sau(4): (1) Thực hiện PCR; (2) Thực hiện phản ứng cắt; (3) Điện di vàphân tích kết quả

 Thực hiện PCR (12)

Kỹ thuật này gồm có 4 bước chủ yếu sau đây:

- Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu

- Ly trích và tinh sạch DNA của HBV: Hấp thụ DNA lên các hạt silica, rửabằng Ethenol 70%

- Khuếch đại DNA vi rút bằng phản ứng PCR trong máy luân nhiệt

 Thực hiện phản ứng cắt (CLIP)

Về nguyên tắc của phản ứng này giống hệt phản ứng PCR (Cũng gồm có 3bước: Biến tính, bắt cặp và kéo dài) Tuy nhiên có một điểm khác biệt cực kỳ cănbản là thành phần các Nu trong Clip buffer để khuếch đại ngoài A, T, G, C còn cóthêm dd Nucleotides Như vậy trong ống nghiệm của phản ứng clip sẽ có các thànhphần sau(21)

DNA đích cần cho phản ứng clip

2 cặp mồi chuyên biệt

A, C, G, T Deoxynucleotides Triphosphate

A, C, G, T DiDeoxynucleotides TriphosphateDNA Polymerase

Trong giai đoạn kéo dài của phản ứng clip các Nu dưới tác động của menPolymerase gắn vào cặp mồi sẽ có sự gắn ngẫu nhiên của các dd Nucleotides, khi

đó thì sự kéo dài sẽ lập tức ngừng lại Như vậy sau phản ứng Clip ta sẽ có các phân

tử dài ngắn khác nhau Khi điện di trong gel có độ ly giải cao (Có thể phân biệt sựdài ngắn khác nhau chỉ 1 Nu) ta sẽ có các trình tự của Nu, dựa vào phần mềm củamáy sẽ cho ra được trình tự chuỗi của DNA HBV So sánh trên thư viện gen củamáy tính sẽ cho ta biết genotype của vi rút này là genotype nào

 Hệ thống giải trình tự chuỗi TRUGENE

Giải trình tự được xem là chuẩn vàng(8) để xác định genotype của HBVnhờ vào việc phát hiện thứ tự nhất định của bốn loại Nucletid khác nhau của mạchđơn DNA Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi phải có máy móc, trang thiết bị hiện đại,giá thành của một xét nghiệm giải trình tự cao cho nên phổ ứng dụng không quálớn, kỹ thuật này cũng không phát hiện được những đối tượng đồng nhiễm và cũngkhông thể thực hiện một loạt các xét nghiệm này trong quá trình thực hiện đề tài

1.2.2 Realtime – PCR:

Có 3 loại(8)+ Realtime – PCR dùng đoạn dò Taqman

+ Realtime – PCR sử dụng probe lai (hybridization probe)Realtime – PCR được thực hiện dự trên những nguyên tắc cơ bản sau:

 Realtime – PCR dùng đoạn dò Taqman(11): PCR mix dùng đoạn dò(1) Taqman đoạn dò có đầu 5’ gắn chất huỳnh quang gọi là đầu báo cáo(reporter) còn đầu 3’ thì có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) hấp thụ ánhsáng huỳnh quang phát từ reporter

(2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease có khả năngthủy giải cắt bỏ probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzymekéo dài mồi tổng hợp bổ sung

Nguyên lý thực hiện: Khi chưa có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNAđích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy huỳnh quang phát ra được từreporter đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp thu ống nghiệm không phátđược huỳnh quang khi nhận dược nguồn sáng kích thích Khi xuất hiện sản phẩmđặc hiệu khuếch đại thì Taqman probe bắt cặp với sợi khuôn của sản phẩm này ởnhiệt độ bắt cặp và enzyme taqman polymerase sẽ cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợpthành sợi bổ sung nên reporter và quencher sẽ tách ra xa nhau và phát được huỳnhquang khi được nguồn sáng kích thích

 Realtime – PCR sử dụng đoạn dò Beacon molecular(8)(11)Đoạn dò có trình tự dài khoảng 25-40 base có đầu 5’ gắn với reporter vàđầu 3’ gắn với quencher Prober khác có trình tự 15-39 base ở giữa là bổ sung vớimột trình tự đặc hiệu trên một sợi DNA đích, còn 2 đầu của prober mỗi đầu có mộttrình tự 5-6 base bổ sung cho nhau làm cho prober có cấu trúc hình kẹp tóc do trình

tự hai đầu bắt cặp nhau

Hoạt động Beacon probe như sau:

Giai đoạn nhiệt độ biến tính cấu trúc kẹp tóc không còn reporter xaquencher nên khi nhận nguồn sang kích thích sẽ phát huỳnh quang

Giai đoạn nhiệt độ bắt cặp: khi có sản phẩm khuếch đại đặt hiệu Beaconprobe sẽ bắt cặp trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm khuếch đại nhờ vậy

reporter và quencher xa nhau nên khi có nguồn sang kích thích reporter sẽ phát sángđược huỳnh quang.

Giai đoạn nhiệt độ kéo dài: enzyme Taq polymerase không thủy giảiBeacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung đượctổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp Cuối giai đoạn kéo dài Beaconprobe tách khỏi sợi đích và trở lại cấu trúc kẹp tóc không cho reporter phát quangkhị nhận được nguồn sáng kích thích

Beacon probe ưu việt vì phát hiện chỉ một nucleotid khác nhau (SNP) nên

có thể thực hiện nhiều tác nhân đích (multiplex test)

 Real-time PCR sử dụng probe lai tạo(8)(11)Dùng 2 probe

- Probe lai 1 có đầu 3’ gắn chất phát huỳnh quang D (Donnor)

- Probe lai 2 có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang A (Acceptor)

Để tránh không cho probe lai 2 này có thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợikhuôn thì đầu 3’ của probe lai 2 gắn thêm một gốc phosphate

Cơ chế hoạt động tóm tắt như sau:

Giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì

D của probe lai phát huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích thích nhưng thiết

bị Real-time không ghi nhận được sóng huỳnh quang vì bước sóng phát ra từ Dkhông qua được kính lọc để đến với CCD camera hay cảm quang được

Nếu có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu hiện diện thì probe lai 1 và 2 bắt cặpvào được sợi khuôn, do vậy mà huỳnh quang phát ra từ D sẽ là nguồn sáng kíchthích A phát huỳnh quang và thiết bị Real-time nhận được sáng này nếu lượng sảnphẩm khuếch đại đạt ngưỡng để qua được kích lọc đến được CCD camera hay cảmquang của thiết bị Real-time Vì vậy gọi là kỹ thuật Fret Real-time (FluorescenceResonance Tranfer)

Ưu việt của probe lai là phân biệt được SNP của tác nhân đích vềgenotyope thậm chí chỉ khác một nucleotide (SNC)

+ Cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trìnhphản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang.

+ Cho phép định lượng số copy ban đầu của khuôn mẫu với độ chính xác

và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn

+ Số liệu của phản ứng Realtime PCR có thể đánh giá mà không cần điện

Nguyên tắc kỹ thuật PCR-RFLP

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): (12)

Là phản ứng khuyết đại một lượng lớn bản sao của một trình tự xác địnhnhờ sự hoat động của DNA polymerase nối dài với mồi bắt cặp bổ xung với DNAmạch khuôn để hình thành mạch mới

Gồm 4 bước chính:

+ Lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật

+ Ly trích DNA+ Thực hiện phản ứng PCR+ Phát hiện sản phẩm đích

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms): là kỹ

thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắtcác enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Khi ủ DNA với enzyme giới hạn ởdung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạnDNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sửdụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giớihạn (restriction enzyme-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen Sựkhác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

RE (Restriction Enzyme): Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả

năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định Có

3 loại enzyme cắt giới hạn:

+ Loại I: Khi enzyme nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA

cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nucleotide

+ Loại II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.

+Loại III: enzyme nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20

nucleotide

Kỹ thuật RFLP: Gồm các bước tinh sạch DNA, cắt mẫu DNA cần phân

tích bằng Enzym giới hạn (RE), điện di trên gel agarose

Tinh sạch DNA: DNA sau khi thực hiện PCR, hỗn hợp này có thể có

những đoạn DNA không đặc hiệu hay lẫn protein Vì vậy ta phải tinh sạch DNAtrước khi cắt bằng enzyme giới hạn

Cắt DNA bằng Enzyme giới hạn (RE): Một số nguyên tắc khi thực hiện

phản ứng cắt bằng RE: Nồng độ NaCl của dung dịch đệm, nếu phải sử dụng nhiều

RE có nồng độ NaCl của dung dịch đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độNaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao hơn

RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -200C, nên thêmvào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốt

Thể tích phản ứng càng nhỏ càng có hiệu quả vì RE và DNA tiếp xúc vớinhau càng tốt, tuy nhiên phải bảo đảm thể tích RE không quá 1 10 thể tích phản ứng

vì glycerol nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của RE

Điện di trên gel agarose và phân tích kết quả

Ưu nhược điểm của RFLP: (36)+ Cho phép phát hiện được các genotype phối hợp

+ Kỹ thuật bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ+ Quy trình thực hiện phúc tạp và ảnh hưởng đến sức khỏe của người thựchiện kỹ thuật vì có ethidium bromide.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả bệnh nhân là người Việt Nam đã được chẩn đoán viêm gan B mạntính, xơ gan và ung thư gan do virus viêm gan B Bệnh nhân đến khám và điều trịtại bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Cần Thơ trong thời gian tiến hành nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọnNhững bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B được chẩn đoán xác định viêmgan B mạn tính, xơ gan và ung thư gan do HBV

 Viêm gan B mạn tính: (2)(3)

- HbsAg (+) >6 tháng

- HbeAg (+), HBV DNA >105copies/ml

- HbeAg (-), HBV DNA >104 -105copies/ml

- ALT AST tăng cao liên tục và kéo dài

- Sinh thiết gan cho thấy mức độ viêm gan vừa hoặc nặng

 Người lành mang virus (3)

- Hội chứng suy tế bào gan:

+ Giai đoạn còn bù: Rối loạn tiêu hóa, rối loạn giấc ngủ, suy giảm khảnăng tình dục

+ Giai đoạn mất bù: Vàng da, vàng mắt, phù, sao mạch, bàn tay son,xuất huyết

- Xét nghiệm:

+ Hồng cầu, tiểu cầu giảm, SGOT, SGPT, bilirubin tăng

+ Tỷ lệ prothrombin giảm, Cholesterol giảm Protide máu giảm, đặcbiệt là Albumin, Globulin tăng, tỷ lệ A G đảo ngược

+ Rối loạn điện giải: K+ giảm, Na+ tăng…

+ Siêu âm bụng: Gan to hay teo, bờ gồ ghề, có nốt tân sinh, lách to, tĩnhmạch cửa giãn, phát hiện dịch báng

+ Sinh thiết gan: Là xét nghiệm quyết định chẩn đoán

+ Giải phẫu bệnh là tiêu chuẩn quyết định trong chẩn đoán xơ gan, đồngthời nó cũng góp phần vào chẩn đoán giai đoạn và nguyên nhân xơ gan

 Ung thư gan (8)

- Những triệu chứng bao gồm đau bụng , yếu sức và chán ăn Dấu hiệucủa suy gan và tăng áp lực tĩnh mạch cửa là phổ biến

- Ở vùng dịch tễ , bệnh thường biểu hiện ở đau và sưng vỡ khối u

- Gan to xảy ra 50% trường hợp, báng bụng hiện diện hoặc thông quasuy gan hay di căn phúc mạc

- Sốt không thể giải thích được xảy ra trên 10% trường hợp, và hiệntượng cận ung thu cũng được nhận thấy

- Xét nghiệm

+ HCC tiết ra trong huyết thanh alpha- fetopeotein (AFP) 80% trườnghợp, và do đó nó được dùng để truy tìm, chẩn đoán và theo dõi điều trị HCC

+ AFP: Có giá trị lâm sàng của AFP là trong chẩn đoán ung thư tế bào

gan nguyên phát và ung thư tế bào mầm ở nhóm có nguy cơ cao

Độ nhạy và độ đặc hiệu của AFP thay đổi theo các đối tượng nguyên cứu

và giá trị ngưỡng của chỉ số bình thường: 52-80% và 90-98%

Theo Dr Terence CW Poon, độ nhạy và độ đặc hiệu của AFP trong chẩnđoán HCC ở bệnh nhân viêm gan mạn với các giá trị ngưỡng khác nhau thay đổinhư sau:

Giá trị AFP Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%)

% trường hợp HCC Cholangiocarcinoma thì AFP không tăng

Bệnh nhân xơ gan thì AFP tăng nhẹ và hằng định hoặc tăng thoáng qua :10-62 % có tăng AFP : 17% tăng từ 15-100 ng/ml ; 20% tăng < 500 ng ml và chỉ cókhoãng 1% > 500 ng/ml

Ngưỡng để nghĩ HCC : 400 (500) ng/ml

+AFP-L3

AFP-L3 là một đồng đẳng (Isoform) của AFP (L1, L2, L3 : Dựa vào phảnứng gắn vào Lectin Lens culinaris agglutinin: LCA) Kết quả của AFP-L3% như là

tỉ lệ phần trăm của AFP gắn kết với LCA và toàn bộ AFP

Nhiều nguyên cứu cho thấy khi AFP-L3 tăng hơn 10% là có thể chỉ ra tìnhmột trạng sớm của HCC, đôi khi sớm hơn phát hiện HCC bằng các kỹ thuật chẩnđoán hình ảnh (có khi từ 3-21 tháng trước khi có thể phát hiện HCC bằng kỹ thuậtchẩn đoán hình ảnh); tăng gấp 7 lần nguy cơ thành HCC trong vòng 21 tháng.Giới hạn: AFP và AFP-L3 có thể tăng trong: Viêm gan cấp hoặc tối cấp, thai kỳ, trẻ

em dưới 18 tháng tuổi

Độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán thay đổi từ 36-66% và 77-95%

Do AFP-L3 được tạo ra từ các tế bào ác tính nên việc đo AFP-L3 có thể giúp phânbiệt được bệnh gan không có hay có ác tính

Tế bào gan ác tính có tạo ra AFP-L3 hay có khuynh hướng phát triển

Chỉ số bình thường AFP-L3 : 0,5 – 9,9 %Siêu âm độ ly giải cao dùng để truy tìm khối u nhỏ (<3cm) không triệuchứng Nhiều trung tâm đã có chương trình truy tìm HCC ở bệnh nhân có nguy cơcao.

Giải phẫu bệnh là chuẩn vàng dùng để chẩn đoán ung thư ganSinh hóa: ALT (nam > 30IU ml và nữ >19 IU ml)(50), AST tăng, albumingiảm, prothrombin giảm, GGT tăng hoặc bình thường

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừBệnh nhân có quốc tịch nước ngoài bị nhiễm virus viêm gan BBênh nhân không tự nguyện tham gia nghiên cứu

Bệnh nhân thuộc diện đối tượng người lành mang trùngBệnh nhân có số lượng copies ml < 1000copies ml2.1.3 Cỡ mẫu nghiên cứu

Lấy mẫu không ngẫu nhiên, tất cả bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan vàung thư gan do HBV đã đến khám và điều trị tại bệnh viện Đa Khoa Trung ƯơngCần Thơ trong thời gian từ 11 2011 đến 11 2012 phù hợp theo tiêu chuẩn chọnbệnh

Trong thời gian 12 tháng chúng tôi đã tiến hành thu thập được 87 mẫu phùhợp với tiêu chuẩn chọn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứuNghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích

2.2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu

 Thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 11 2011-11/2012

 Địa điểm: Mẫu được lấy từ các bệnh nhân đến khám và điều trị tạibệnh viện Đa Khoa Trung Ương Cần Thơ và được làm các xét nghiệm HbeAg vàmen gan tại phòng xét nghiệm sinh hóa của bệnh viện Đa Khoa Trung Ương CầnThơ

Mẫu nghiên cứu được xử lý tại phòng xét nghiệm Y Sinh học phân tửTrường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

2.2.3 Phương tiện nghiên cứuPipet, đầu côn, ống ly tâm 1,5mL, máy vortex

Tủ an toàn sinh học cấp 2Máy Realtime – PCR (stratagene)Pipet, đầu côn, ống ly tâm 1,5mL, máy vortex

Máy vi tínhGiấy và viết2.2.4 Phương pháp thu thập mẫuBước 1: Liên hệ phòng Hành Chánh Tổng Hợp bệnh viện Đa Khoa TrungƯơng đến các khoa: Nhiễm, Tiêu hóa, Xét nghiệm tiến hành thu thập mẫu

Bước 2: Lựa chọn từ những người bệnh đến khám hoặc đang điều trị bệnhviêm gan B mãn tính, xơ gan và ung thư gan do HBV tại các khoa bệnh viện ĐaKhoa Trung Ương Cần Thơ theo đúng tiêu chuẩn nhận mẫu

Bước 3: Gặp từng bệnh nhân trao đổi về việc thực hiện đề tài và thu thậpcác thông tin cần thiết trong phiếu thu thập mẫu Trình bày lợi ích của việc tham gianghiên cứu, giải đáp thắc mắc và mời đối tượng tham gia nghiên cứu

Bước 4: Liên hệ phòng xét nghiệm lấy mẫu huyết thanh (200µl) của bệnhnhân tham gia nghiên cứu tiến hành xét nghiệm Realtime-PCR

Bước 5: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -200CBước 6: Vận chuyển mẫu lên phòng xét nghiệm Y Sinh học phân tử - Đạihọc Y Dược Tp Hồ Chí Minh để thực hiện xét nghiệm Realtime-PCR

Bước 7: Xử lý mẫu tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử của bệnh việnTrường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

 Quy trình cụ thể từng giai đoạn

 Tách chiết acid nucleic(12): DNA từ mẫu huyết thanh bệnh nhân được

ly trích bằng phương pháp sử dụng phenol chloroform

+ Phá vỡ màng tế bào và màng nhân giải phóng DNA ra môi trườngđồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

+ Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (chủ yếu làcác protein) bằng cách trộn đều mẫu với dung dịch phenol và chloroform (dung dịchphenol chloroform có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hòa tan nucleicacid) Do đó protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước cóchứa nucleic acid

+ Tiến hành quay li tâm để toàn bộ protein biến tính tủa lại thành mộtlớp nằm giữa pha nước và pha phenol chloroform

+ Tách pha nước có chứa nucleic acid ra khỏi hỗn hợp trên+ Tủa nucleic acid: Tủa trong isopropanol thể tích mẫu là 1 1 và chấttrợ tủa là glucoblue Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa do đó cóthể loại chúng ra khỏi hỗn hợp để thu lại nucleic acid

+ Thu lại nucleic acid bằng phương pháp quay ly tâm Toàn bộ cặnđược rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ isopropanol còn dính lại trên mẫu

Thành phần của phản ứng (9)

+ 200 l huyết thanh được thêm vào 900 l Trizol, pH8+ Acid nucleic được tủa bằng Isopropanol với chất trợ tủa GlycoBlue

+ Acid nucleic thu được sau tủa được giữ trong dung dịch TE 1X EDTA) và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.

(Tris- Realtime-PCR:

Mẫu bệnh phẩm

200µl huyết thanh huyết tương của bệnh nhân được xử lý mẫu tại phòngxét nghiệm Sinh học phân tử của bệnh viện Trường Đại học Y Dược Thành Phố HồChí Minh

Mồi, mẫu dò

Bảng 2 Mồi và mẫu dò trên gene S của HBV(9)

(bp)

Kích thước sảnphẩm PCR (bp)Primer

HBV-F Mồi xuôi 5’-CTGGTGGC TC AGT

PrimerHBV-R Mồi ngược

GGCGCAGGGTCCCCAA

5’-T- 3’

17

ProbeA Mẫu dò

5’-FAMACATCTCGTCAATCTCCGCGAG– BHQ1-3’

22

ProbeB Mẫu dò

5’-HEXTCCATATCGTCAATCTTATCGAAGA– BHQ1-3’

25

ProbeC Mẫu dò

5’-Cy5CCCATATCGTCAATCTTCTCGAG– BHQ2-3’

23

Phản ứng được thực hiện trên máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) vớichương trình nhiệt bao gồm

+ 950C- 5’ (1 chu kỳ)

+ 600C- 1’ cho Realtime PCRThể tích hỗn hợp phản ứng PCR realtime là 50 µl bao gồm: 1× dung dịchđệm PCR, 100 nmol L mồi và mẫu dò, 400 μmol L mỗi loại dATP, dGTP, dCTP vàdTTP, 1.5 units hot-start Taq DNA polymerase, 3 mmol/L MgCl2 Ba kiểu gien củaHBV được xác định trong cùng một phản ứng chứa đầy đủ các mồi và mẫu dò đặchiệu cho mỗi kiểu gien A, B và C

 Phân tích kết quả:

Hình 2: Phân tích kết quả Realtime-PCR

2.3 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0

2.4 Đạo đức nghiên cứu

- Bệnh phẩm trong quá trình nghiên cứu là 200µl huyết thanh hoặc huyếttương 1 mẫu được lấy từ mẫu máu của bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm

Do vậy hoàn toàn không ảnh hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân và quy trình làmviệc của bệnh viện

- Đối tượng tham gia nghiên cứu được giải thích rõ về nội dung nghiên cứu

- Kết quả nghiên cứu đảm bảo sử dụng đúng mục đích, không lạm dụng để

vụ lợi cho cá nhân hay làm phương hại (kể cả phân biệt đối xử hay kỳ thị) đến đốitượng nghiên cứu

Genotype B

Genotype C

Genotype A

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu

Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính trong mẫu nghiên cứuNhận xét: Đa số bệnh nhân tham gia nghiên cứu là bệnh nhân nam chiếm60,9%, còn lại bệnh nhân nữ chiếm 39,1%

Biểu đồ 3.2: Phân bố tình trạng bệnh trong mẫu nghiên cứuNhận xét: Trong các mẫu nghiên cứu thu thập được có 55,2% bệnh nhân bịbệnh viêm gan B mạn tính, 39,1% bệnh nhân bị xơ gan và 5,7% bệnh nhân bị ung

Biểu đồ 3.3: Phân bố nhóm tuổi trong mẫu nghiên cứuNhận xét: Nghiên cứu 87 bệnh nhân ghi nhận đa số bệnh nhân tham gianghiên cứu tập trung ở độ tuổi từ 36 tuổi tới 60 tuổi chiếm 54% , tiếp theo đó là từ

35 tuổi trở xuống chiếm 32,2% và thấp nhất là nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi chiếm13,8%

3.2 Tỉ lệ các loại genotype HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính,

xơ gan và ung thƣ gan

Biểu đồ 3.4: Phân bố genotype HBV trong mẫu nghiên cứuNhận xét: Nghiên cứu HBV genotype B chiếm ƣu thế hơn so với HBVgenotype C (66,7% so với 32,2%) Vẫn có 1,1% bệnh nhân đồng nhiễm gentypeB+C, không có genotype A