Luận văn nghiên cứu bệnh đốm vàng lụi lúa (rice yellow stunt virus) ở miền bắc việt nam

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------  --------- LƯU THỊ THẢO NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (Rice yellow stunt virus) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số : 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI - 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan! Bản luận văn tốt nghiệp này được hoàn thành bằng sự nhận thức chính xác của bản thân. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa được sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lưu Thị Thảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Trân trọng cám ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình điều tra, tiến hành các thí nghiệm và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Trân trọng cám ơn cán bộ Lãnh đạo UBND và Trưởng ban khuyến nông, Trạm trưởng Trạm Bảo vệ thực vật huyện Ba Vì – Hà Nội, huyện Hiệp Hòa – Bắc Giang đã hỗ trợ theo dõi, phối hợp đánh giá tình hình diễn biến của bệnh vàng lụi trong quá trình thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 20 tháng 3 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Thảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục hình viii 1 ĐẶT VẤN ĐỀ i 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu 1 1.2 Mục đích – yêu cầu 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam 4 2.2 Triệu chứng gây hại 6 2.3 Phân loại, hình thái và đặc điểm bộ gen virus RYSV 7 2.4 Lan truyền của RYSV 10 2.5 Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA 11 2.5.1 Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng 11 2.5.2 Chế tạo kháng huyết thanh đa dòngđối với virus thực vật 12 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ kháng thể 12 2.5.4 Các kỹ thuật ELISA 13 2.6 Chẩn đoán virus RYSV bằng ELISA 14 3 ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nội dung nghiên cứu 15 3.2 Địa điểm nghiên cứu chính 15 3.3 Vật liệu liệu nghiên cứu chính 15 3.3.1 Vật liệu thu thập mẫu cây và rầy 15 3.3.2 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn đoán ELISA 15 3.3.3 Hóa chất, dung dịch đệm, môi trường 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iv 3.3.5 Các enzyme và kit thương mại 16 3.3.6 Các thiết bị chủ yếu 17 3.4 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1.Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng 17 3.4.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu 17 3.4.3 Phương pháp bảo quản mẫu 18 3.4.4 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô lá 18 3.4.5 Phản ứng RT – PCR 19 3.4.6 Điện di agarose 21 3.4.7 Dòng hóa và giải trình tự 21 3.4.8 Phân tích trình tự 22 3.4.9 Tinh chiết phân tử virus RYSV 22 3.4.10 Tạo kháng huyết thanh virus trên thỏ 23 3.4.11 Phương pháp ELISA 23 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 4.1 Điều tra bệnh vàng lụi năm 2011 25 4.1.1 Triệu chứng bệnh vàng lụi tại các điểm điều tra 25 4.1.2 Điều tra tình hình bệnh vụ xuân năm 2011 27 4.1.3 Điều tra bệnh vụ mùa 2011 29 4.1.4 Phát hiện virus RYSV bằng RT-PCR trên các mẫu thu thập ngoài đồng ruộng vụ xuân 2011 30 4.2 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh đặc hiệu virus RYSV 33 4.2.1 Giới thiệu 33 4.2.2 Chuẩn bị nguồn vật liệu 33 4.2.3 Tinh chiết phân tử virus 34 4.2.4 Gây miễn dịch trên thỏ 35 4.2.5 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể virus 35 4.2.6 Đánh giá chất lượng của 2 nguồn kháng huyết thanh (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu đông). 37 4.2.7 Kiểm tra nồng độ virus trong quá trình tinh chiết 40 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… v 4.2.8 Đánh giá độ hòa loãng của kháng huyết thanh 42 4.2.9 Đánh giá độ hòa loãng của mẫu cây bệnh 43 4.2.10 Kiểm tra nồng độ virus ở mẫu lá vàng và lá xanh trên cùng một cây bệnh. 44 4.2.11 Đánh giá về mẫu khô, mẫu tươi và mẫu nghiền, mẫu không nghiền 46 4.2.12 Kiểm tra nồng độ virus ở các bộ phận khác nhau của cây bệnh 47 4.2.13 Kiểm tra virus trong mẫu rầy xanh đuôi đen và một số loại cỏ tại Bắc Giang năm 2011 49 4.2.14.Ứng dụng ELISA kiểm tra virus RYYSV thu tại ở Hà Nội, Bắc Giang năm 2011 51 4.3 Xác định virus RYSV bằng giải trình tự 52 4.3.1 Nhân gen virus bằng RT-PCR 53 4.3.2 Dòng hóa sản phẩm RT-PCR 54 4.3.3 Kết quả giải trình tự 57 4.3.4 Kết quả tìm kiếm chuỗi tương đồng trên ngân hàng gien 58 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT RYSV : Rice yellow stunt virus Báo NNVN : Báo Nông nghiệp Việt Nam IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn TT BVTV : Trung tâm bảo vệ thực vật ĐHNNHN : Đại học Nông nghiệp Hà Nội HTX : Hợp tác xã UBND : Ủy ban nhân dân DAS - ELISA : Double antibody sandwich - ELISA NCBI : National Center for Biotechnology Information PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis PTA-ELISA : Plate Trapped Entigen – ELISA OD Optical density CCSV Cynodon chlorotic streak virus RT-PCR : Reverse Transcriptional – Polymerase Chain Reaction KHT : Kháng huyết thanh CNSH : Công nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vii DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 4.1 Bệnh vàng lá lúa vụ xuân năm 2011 tại một số tỉnh phía Bắc 27 4.2 Bệnh vàng lá lúa vụ mùa năm 2011 tại một số tỉnh phía Bắc 29 4.3 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân 2011 tại Hà- Nội. 31 4.4 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân năm 2011 tại Bắc Giang và Hòa Bình 32 4.5 Tóm tắt các bước tinh chiết phân tử virus RYSV từ mô lá lúa bệnh 35 4.6 ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh. 36 4.7 ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus RYYSV (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu đông) 38 4.8 Kiểm tra ELISA hàm lượng virus RYSV trong các sản phẩm thu được trong quá trình tinh chiết phân tử virus 40 4.9 Xác định độ hòa loãng của kháng huyết thanh. 42 4.10 Xác định độ hòa loãng của mẫu cây bệnh 43 4.11 Thử nghiệm ELISA về nồng độ virus trên mẫu lá xanh và lá vàng trên cùng cây bệnh 45 4.12 Đánh giá về mẫu nghiền và mẫu không nghiền; mẫu khô và mẫu tươi 46 4.13 Kiểm tra nồng độ virus ở các bộ phận khác nhau ở cây bệnh 48 4.14 Kết quả kiểm tra RYSV trên mẫu rầy năm 2011 49 4.15 Kiểm tra ELISA một số loại cỏ thu thập được trong quá trình điều tra bệnh vàng lụi 50 4.16 Kết quả kiểm tra RYSV trên mẫu lúa vụ mùa 2011 51 4.17 RT-PCR nhân dòng 3 sản phẩm gen RYSV 54 4.18 Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn biến nạp 56 4.19 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng enzyme cắt giới hạn 57 4.20 Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR 57 4.21 Kết quả tìm kiếm trên ngân hang gen bằng phần mềm Blast 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Phân bố dịch bệnh “vàng lụi” tại Việt Nam, 5 2.2. Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009) 8 2.3. Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata và Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985). 9 2.4. Sơ đồ tổ chức bộ gen của RYSV được xây dựng dựa trên mẫu AB011257 bằng phần mềm NTI (hãng Invitrogen) 10 2.5. Hìn thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV. Từ trái sang phải lần lượt là là N. nigropictus, N. cincticeps và N. virescens. 10 2.6. Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2000) 14 4.1. Một số triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh vàng lá do RYSV tại miền Bắc vụ xuân 2011. 27 4.2. Điều tra bệnh và thu thập rầy xanh đuôi đen tại xã Hòa Sơn – Hiệp Hòa – Bắc Giang vụ xuân 2011 28 4.3. Điều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh đuôi đen tại xã Phú Cường (Ba Vì – Hà Nội) vụ mùa năm 2011. 30 4.4. Điều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh đuôi đen tại xã Hòa Sơn – Hiệp Hòa – Bắc Giang vụ mùa năm 2011. 30 4.5. Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa Hà Nội vụ xuân 2011. 31 4.6. Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa Bắc Giang vụ xuân 2011. 33 4.7. Thu thập và bảo quản mẫu cây bệnh làm vật liệu tinh chiết virus RYSV 34 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ix 4.8. ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh. 37 4.9. ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus RYYSV (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu đông) 39 4.10 Kiểm tra ELISA đánh giá hàm lượng virus ở các sản phẩm của quá trình tinh chiết. 41 4.11 ELISA đánh giá độ hòa loãng của kháng huyết thanh 42 4.12. ELISA đánh giá độ hòa loãng của mẫu cây bệnh 44 4.12. Elisa đánh giá độ hòa loãng của mẫu cây bệnh và nồng độ virus trong mẫu lá xanh và lá vàng 45 4.13. Kiểm tra ELISA đánh giá mẫu tươi, mẫu khô; mẫu nghiền, không nghiền 47 4.14. Kiểm tra ELISA đánh giá nồng độ virus ở các bộ phận của cây bệnh. 48 4.15. Elisa kiểm tra RYSV trên mẫu lúa vụ mùa 2011 52 4.16. Sơ đồ bộ gen virus RYSV, vị trí các mồi và sản phẩm RT-PCR 53 4.17. RT-PCR dùng 2 tổ hợp mồi để nhân gen L và N của RYSV từ 2 mẫu lúa bệnh 1075 và 2011. M là thang DNA 1 kb (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb được chỉ bằng mũi tên. 54 4.18. Nuôi cấy các dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong môi trường LB lỏng chứa ampicillin 55 4.19 Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn biến nạp bằng cặp mồi Vector SeqFor và Vector SeqRev. M là thang DNA 100 bp (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb được chỉ bằng mũi tên. 56 4.20 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI. M là thang DNA 100 bp ( Fermentas) với 2 băng tham khảo được chỉ bẳng mũi tên 57 4.21 Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần đồ thị trình tự 58 . ---------  --------- LƯU THỊ THẢO NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (Rice yellow stunt virus) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành. hành đề tài: Nghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở miền Bắc Việt Nam Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông