Tạo kháng huyết thanh đặc hiệu với virus gây bệnh đốm vàng lùn trên lúa tại miền Bắc Việt Nam

Thử nghiệm tạo khỏng huyết thanh ủặc hiệu virus RYSV 1. Giới thiệu

Qui trỡnh tinh chiết virus RYSV ủược chỳng tụi thực hiện theo phương phỏp chiết một nucleorhabdovirus là Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) từ cây cỏ Bermuda (Lockhart et al.,1985). Sau lần tiờm thứ 2 và trước khi tiờm lần 3, khoảng 0.5 mL mỏu thỏ ủược lấy từ ven tai và ly tõm ủể lấy khỏng huyết thanh nhằm kiểm tra sự cú mặt của kháng thể virus RYSV bằng ELISA. Giỏ trị OD khỏ thấp của cỏc mẫu cõy khỏe cũng chứng tỏ rằng protein của cõy ủó ủược loại bỏ khỏ nhiều trong quỏ trỡnh tinh chiết virus dẫn tới hàm lượng khỏng thể khụng ủặc hiệu trong khỏng huyết thanh ớt.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 38 lãng phí, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của kháng thể virus RYSV trong 2 nguồn kháng huyết thanh này bằng ELISA theo qui trình chuẩn với các mẫu lúa bị bệnh ủiển hỡnh và mẫu lỳa khỏe ủối chứng. Kết quả ELISA ở lần thử thứ nhất ủược thực hiện vào ngày 29/07/2011 cho thấy giỏ trị OD mẫu ủối chứng dương của 2 nguồn khỏng huyết thanh ủều cao gần như nhau: OD của dịch sau ly tõm mỏu ủụng bằng 0.460 và của huyết tương 0.452 chứng tỏ lượng khỏng thể ủặc hiệu virus cú ở 2 mẫu khỏng huyết thanh này là tương ủương. Do vậy, ủể cú một khỏng huyết thanh ủặc hiệu virus phục vụ trong chuẩn đốn thì ngay từ những khâu đầu tiên như vật liệu tinh chiết, sản phẩm tinh chiết ủều phải chứa hàm lượng virus ủủ lớn và sạch ủể kớch thích hiệu quả hệ miễn dịch của thỏ hình thành kháng thể.

Chỳng tụi ủó thực hiện thử nghiệm ELISA dựng khỏng huyết thanh là huyết tương vừa thu ủược ủể kiểm tra sự cú mặt của virus trong 3 sản phẩm ủược thực hiện ở bước siêu li tâm là dịch trước siêu li tâm, dịch trên tủa sau siêu li tâm và cặn virus. Khả năng này cú thể do 2 lý do là (i) lực ly tõm (g) chưa ủủ mạnh hoặc thời gian li tõm chưa ủủ lõu ủể kết tủa triệt ủể virus, hoặc (ii) một số phõn tử virus ủó liờn kết với cỏc cấu tử tế bào lớn dẫn tới khụng thể kết tủa hiệu quả trong ủiều kiện siờu li tõm ủó ủược thực hiện trong nghiờn cứu này. Kết quả kiểm tra ELISA cũng cho thấy các giá trị OD trung bình của mẫu cặn virus ủược hũa trong ủệm phosphat cú ủường là 0.260 và trong ủờm phosphat khụng cú ủường là 0.268.

Kết quả kiểm tra ELISA cho thấy ở mức hòa loãng KHT tới 1/100 thì giá trị OD của cả 4 mẫu bệnh vẫn lớn hơn của mẫu cây khỏe (> giá trị trung bình cây khỏe + 2 ủộ lệch chuẩn SD) chứng tỏ ở ủộ hũa loóng này, KHT vẫn cú thể phỏt hiện ủược virus. Kết quả này chứng tỏ rằng ở ủộ hũa loóng 1/5 thỡ lượng virus bỏm vào giếng nhiều hơn dẫn ủến tăng ủộ nhạy của phản ứng và lượng protein của cõy khỏe cũng nhiều hơn nờn chỳng sẽ liờn kết và khúa triệt ủể cỏc vị trớ trống trờn thành giếng dẫn tới làm giảm cỏc liờn kết khụng ủặc hiệu vào thành giếng. Virus RYSV thuộc nhúm gõy bệnh hệ thống, tuy nhiờn ủể xỏc ủịnh ủược nồng ủộ virus cú phõn bố như nhau khụng giữa lỏ vàng và lỏ xanh chỳng tụi tiến hành kiểm tra Elisa trên mẫu lá và lá xanh trên cùng cây bệnh.

Qua bảng 4.11 chỳng tụi nhận thấy, luụn phõn biệt ủược sự khỏc nhau giữa lỏ khỏe và lỏ bệnh, tuy nhiờn nồng ủộ virus ở mẫu lỏ vàng luụn cao hơn nồng ủộ virus ở mẫu lá xanh với giá trị OD trung bình ở các mẫu lá vàng là 0.235 và ở mẫu. Trong chẩn đốn ELISA virus vàng lụi, việc cố định mẫu thơng thường mất rất nhiều thời gian như phải chuẩn bị chày, cối sứ; cõn mẫu , nghiền mẫu, ủặc biệt là khi phải kiểm tra số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Với kết quả so sánh giữa mẫu khơng nghiền và mẫu nghiền trong chẩn đốn virus RYSV thỡ mẫu khụng nghiền hoàn toàn cú thể phõn biệt ủược giữa cõy bệnh và cây khỏe với giá trị OD cao nhất ở mẫu nghiền, mẫu bệnh không nghiền và mẫu khỏe tương ứng là 0.315; 0.377 và 0.167.

Kết quả ủọc sau khi ủể qua ủờm cho thấy giỏ trị OD ở cỏc bộ phận tất cả cỏc mẫu cõy bệnh ủều cao hơn ủỏng kể so với ủối chứng mụ khỏe tương ứng chứng tỏ virus cú mặt ở mọi vị trớ trong cây mặc dù mẫu lóng thân bệnh có giá trị OD cao hơn cả (trung bình 0.305), cao gần gấp 2 lần mẫu khỏe (trung bình 0.174). Trong quỏ trỡnh ủiều tra, chỳng tụi nhận thấy, ở những ủiểm xuất hiện triệu chứng lựn cõy, vàng lựn ủều cú rầy xanh ủuụi ủen với mật ủộ khỏc nhau, dao ủộng từ 20 – 50 con/m2.

Xỏc ủịnh virus RYSV bằng giải trỡnh tự

Sơ ủồ bộ gen virus RYSV, vị trớ cỏc mồi và sản phẩm RT-PCR. RNA tổng số của 2 mẫu này và một mẫu ủối chứng ủược chiết bằng kit TriPure (Roche). Do kớch thước sản phẩm rất lớn ~ 11 kb (Hỡnh 4.16) nờn phản ứng RT-PCR ủó ủược thực hiện theo 2 bước với các kít thương mại chuyên áp dụng cho tổng hợp sản phẩm lớn.

Bước 1 (tổng hợp sợi cDNA) ủược thực hiện với kit RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas) và bằng mồi RY-L-R2. Bước 2 (phản ứng PCR) ủược thực hiện với kit Expand Long Template PCR System (hóng Roche) và bằng cặp mồi RY-N-F1 /RY-L-R2 và khuôn cDNA ở bước 1. Tuy nhiờn, phản ứng PCR ủó khụng tạo băng sản phẩm, cú lẽ do kớch thước quỏ lớn của chúng (Bảng 4.17).

Tiếp theo, sử dụng khuụn cDNA tổng hợp từ bước 1 ở trờn, chỳng tụi ủó dựng PCR với kit DreamTaq (hóng Fermentas) ủể nhõn 2 sản phẩm nhỏ (với kớch. Dựa trên kết quả này, chúng tôi chọn sản phẩm RT-PCR của mẫu 1075 cho các nghiên cứu tiếp theo.