SEMINAR XÁC ĐỊNH dư LƯỢNG β AGONIST TRONG THỊT HEO (dược PHÂN TÍCH)

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β-AGONIST TRONG THỊT HEO GVHD: DANH SÁCH NHĨM TỞNG QUAN VỀ β-agonist Họ β-agonist hợp chất đưa vào chăn nuôi, đặc biệt chăn ni heo để kích thích heo tăng trưởng cho thịt siêu nạc Tuy nhiên loại dược liêu chất kích thích mạnh gây hại cho gia suc nêu ăn phai thịt vât nuôi nuôi băng thưc ăn co trôn cac loại dược li I ĐẶT VẤN ĐỀ Clenbuterol loại chất kích thích tuyến thượng thận, điều tiết sinh trưởng động vật, thúc đẩy trình phát triển cơ bắp, làm tăng lượng thịt nạc đẩy nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành thể, để lại lớp mỏng Clenbuterol trộn vào thức ăn gia súc nhằm tạo vật nuôi siêu nạc, mau lớn Đối với gia súc heo, ăn phải chất tồn nửa tháng phải giết mổ Tuy nghiên, dùng Clenbuterol liều trở thành chất độc Việc ăn phải thịt lợn chứa chất Clenbuterol lâu dài gây nguy hiểm sức khoẻ người, có nguy gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, bị ảnh hưởng xấu lên tim mạch, làm cho tim đập nhanh, tăng huyết áp, run cơ, gây biến chứng ung thư, ngộ độc cấp, rối loạn tiêu hóa, chống váng… dẫn đến tử vong I.1 Tình hình nhiễm clenbuterol giới Clenbuterol chất phổ biên nhom β-agonist, bị cấm sử dụng thưc ăn gia suc nhiều nước: Năm 1988 cac nước châu Âu năm 1991 Mỹ cấm đưa clenbuterol vào thưc ăn chăn nuôi Năm 1990, Tây Ban Nha co 135 bị ngộ độc clenbuterol sau ăn gan bò Ở Hồng Kông từ năm 1998 đên 2001, năm trung bình co 15 vụ ngộ độc thực phẩm xac nhận co liên quan đên thịt nhiễm độc clenbuterol Ngày 31 thang 12 năm 2001 clenbuterol bị cấm sử dụng thưc ăn gia suc I.2 Tình hình nhiễm clenbuterol Việt Nam - Ở Việt Nam, từ năm 2002, Bộ Nông nghiệp co Quyêt định số 54/QĐBNN cấm san xuất, nhập lưu thông số khang sinh, hoa chất sử dụng thưc ăn chăn nuôi, đo co clenbuterol - Năm 2005, Chi cục Thu y TP.HCM mở rộng kiểm tra phat số mẫu thịt lợn bày ban thị trương co chất Clenbuterol - Một năm sau, hội thao hormone tăng trưởng Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam Hiệp hội thưc ăn chăn nuôi tổ chưc, Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT) công bố kêt qua kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006), quan chưc phat 47/428 mẫu dương tính với Clenbuterol (chiêm gần 11%) - Năm 2011, số gần 500 mẫu thịt lợn bày ban cac chợ TP.HCM, co gần 30% mẫu dương tính với Clenbuterol Đang lo co kêt qua xét nghiệm tồn số thịt heo tiêu thụ hêt - Hiện nay, cac tỉnh miền Nam, tình trạng lợn nhiễm độc Clenbuterol lan tràn diện rộng, thị trường miền Bắc chưa phát thịt lợn nhiễm Clenbuterol II.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP II.1 Đối tượng -Thí nghiệm thực mẫu thịt heo gan heo lấy trực tiếp từ lò giết mổ II.2 Phương pháp -Sử dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Đây phương pháp tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, mẫu chất thu lại dễ dàng 2.1 Dấu hiệu nhận biết: -Tính chất lý hóa của Clenbuterol: • Dạng tinh thể khơng màu, mịn • Phân tử gam: 277,19 • Nhiệt độ nóng chảy: 174-175,5 oC • Nhiệt độ sôi: 404,9oC • Clenbuterol tan nhiều nước, aceton, methanon, ethanon, tan chloroform, khơng tan benzen -Thịt lợn có chứa clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, lớp mỡ mỏng, lỏng lẽo, thịt chạm vào có cảm giác bị ứ nước, da xuất đốm đỏ 2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất 2.2.1 Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Máy sắc ký lỏng cao áp gồm phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) phần điều khiển xử lý số liệu (data processor) 2.2.2 Thiết bị hóa chất - Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: • Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm hệ thống tiêm mẫu tự động • Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI APCI • Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) • Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị xử lý liệu sắc ký - Hóa chất dung dịch thử • Nước cất lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M • Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) H2O (0,1% HCOOH) (v/v) 2.2.3 Chất chuẩn nội chuẩn • Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl) • Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H9D9Cl2ON2) 2.3 Điều kiện quy trình thực 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký a Khao sat chọn bước song thích hợp: khao sat để lựa chọn bước song thích hợp cho viêc phat hiên Clenbuterol b Lựa chọn côt: c Lựa chọn đêm: lựa chọn đêm co pH để peak clenbuterol tach tốt, cân xưng không làm giam tuổi thọ côt d Lựa chọn pha đông: khao sat lựa chọn pha đông cho peak gọn, cân xưng số bất đối thấp e Lựa chọn tốc dịng: cho peak cân đối, thơi gian chạy săc ky phu hợp 2.3.2 Quy trinh thưc hiên - Lựa chọn điều kiện sắc ký - Xây dựng phương pháp định lượng: - Khảo sát sự thích hợp của hệ thống - Xây dựng phương pháp định lượng - Tính kết - Định lượng Clen p.pháp xây dựng - Đánh giá tuyến tính - Đánh giá p.pháp định lượng: - Đánh giá tính xác - Đánh giá tính 2.4 Tiến hành phân tích máy - Đánh giá tính đặc hiệu III TÍNH TOÁN VÀ KẾT QUẢ: Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng mẫu q trình phân tích: Nhận xét: Kết từ bảng cho thấy diện tích peak của ion dd chuẩn dung dịch chuẩn thêm vào mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều chứng tỏ khơng có hiệu ứng giai đoạn tạo ion đầu dò khối phổ Kết quả xây dựng đường chuẩn Clen thịt 70 Y = 0,663x-0084 Clen (Nền thịt) 60 R2= 50 40 30 20 10 Co (μg/L) 20 40 60 80 100 Đường chuẩn Clen thịt Kết quả xác định hiệu suất thu hồi Đường chuẩn để xác định hiệu suất thu hồi xây dựng dung dịch mẫu thịt, gan Hiệu suất thu hồi của Clen thịt heo xác định dựa đường chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn nội chuẩn theo nồng độ của Clen mẫu Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H PP ), với việc sử dụng nội chuẩn đồng vị phải đạt khoảng 100% Có thể ước tính hiệu suất thu hồi thực (H T ) tách chiết cách dựa đường chuẩn xây dựng từ dung dịch chuẩn Kết trình bày bảng 2: Bảng 2: Hiệu suất thu hồi Clen thịt: Nhận xét: Hiệu suất thu hồi của p.pháp đạt khoảng 100% dự đoán hiệu suất thu hồi thực mẫu khảo sát đạt kết sau: mẫu có nồng độ 0,05-50μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 68,5-86,78% Kết quả khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Bảng 3: Giá trị LOD LOQ Clen: Nền mẫu Cmẫu (μg/Kg) Co (μg/Kg) Thịt (2g) 0,0991 0,0495 LOD (RSD%) (μg/Kg) n=6 0,017 (14,14) LOQ (μg/Kg) (RSD %) 0,051 (14,14) Nhận xét: Kết cho thấy giá trị LOD, LOQ của Clen nhỏ đáp ứng tiêu chuẩn của Châu Âu, Codex phù hợp với quy định của VN Bảng 4: Kết quả điều tra hàm lượng Clenbuterol thịt heo: Loại mẫu Tổng số mẫu Nhiễm Clenbuterol Thịt 28 (1,36-6,12) IV KẾT LUẬN Các kết đề xuất phương pháp phân tích định lượng Clenbuterol phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực có sử dụng nội chuẩn đồng vị (Clenbuterol-d9) cho kết xác, độ tin cậy cao Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu của châu Âu, với giá trị đạt sau: - Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP %) khoảng 100% quy trình sử dụng để định lượng xác nồng độ của clenbuterol thịt gan heo - Hiệu suất thu hồi thực (HT %) từ tách chiết: Mẫu có nồng độ 0,05 – 50 (μg/Kg), HT%: 68,5 – 86,78% - Giới hạn phát (LOD) thấp cho clenbuterol: LODClen = 0,017 ( μg/Kg) Các trị số LODClen cho thịt (LOD 1/5 MRL) phù hợp với giá trị tối đa cho phép MRL theo tiêu chuẩn châu Âu Codex V TÀI LIỆU THAM KHẢO: Luận án Đánh giá hàm lượng chất β-agonist (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ của Nguyễn Thị Thu Thủy [http://luanvan.co/luan-van/luan-an-danh-gia-ham-luong-cac-chatagonist-clenbuterol-va-salbutamol-trong-thuc-an-gia-suc-va-duluong-trongthit-gia-53641/] Đồ án tốt nghiệp Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin băng phương phap HPLC [http://data.tailieuhoctap.vn/books/luan-van-de-tai/luan-van-de-tai-cddh/file_goc_770302.pdf] ...TỔNG QUAN VỀ β- agonist Họ β- agonist hợp chất đưa vào chăn nuôi, đặc biệt chăn ni heo để kích thích heo tăng trưởng cho thịt siêu nạc Tuy nhiên loại dư? ??c liêu chất kích thích mạnh... xác định hiệu suất thu hồi xây dư? ?ng dung dịch mẫu thịt, gan Hiệu suất thu hồi của Clen thịt heo xác định dư? ?a đường chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn nội chuẩn theo nồng độ của Clen mẫu Hiệu... giá trị tối đa cho phép MRL theo tiêu chuẩn châu Âu Codex V TÀI LIỆU THAM KHẢO: Luận án Đánh giá hàm lượng chất β- agonist (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật