BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) XÁC ĐỊNH dư LƯỢNG β AGONIST TRONG THỊT HEO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM – KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y MƠN DƯỢC PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β-AGONIST TRONG THỊT HEO GVHD: DANH SÁCH NHĨM TỞNG QUAN VỀ β-agonist Họ β-agonist hợp chất đưa vào chăn nuôi, đặc biệt chăn nuôi heo để kích thích heo tăng trưởng cho thịt siêu nạc Tuy nhiên loại dược liệu chất kích thích mạnh gây hại cho gia súc người nếu ăn phải thịt vật nuôi nuôi bằng thức ăn có trộn các loại dược liệu I ĐẶT VẤN ĐỀ Clenbuterol loại chất kích thích tuyến thượng thận, điều tiết sinh trưởng động vật, thúc đẩy quá trình phát triển bắp, làm tăng lượng thịt nạc đẩy nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành thể, để lại lớp mỏng Clenbuterol trộn vào thức ăn gia súc nhằm tạo vật nuôi siêu nạc, mau lớn Đối với gia súc heo, ăn phải chất có thể tồn quá nửa tháng phải giết mổ Tuy nghiên, nếu dùng Clenbuterol quá liều trở thành chất độc Việc ăn phải thịt lợn chứa chất Clenbuterol lâu dài có thể gây nguy hiểm sức khoẻ người, có nguy gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, bị ảnh hưởng xấu lên tim mạch, làm cho tim đập nhanh, tăng huyết áp, run cơ, gây biến chứng ung thư, ngộ độc cấp, rối loạn tiêu hóa, choáng váng… có thể dẫn đến tử vong I.1 Tình hình nhiễm clenbuterol giới Clenbuterol chất phổ biến nhóm β-agonist, bị cấm sử dụng thức ăn gia súc nhiều nước: Năm 1988 các nước châu Âu năm 1991 Mỹ cấm đưa clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi Năm 1990, Tây Ban Nha có 135 người bị ngộ độc clenbuterol sau ăn gan bò Ở Hồng Kông từ năm 1998 đến 2001, năm trung bình có 15 vụ ngộ độc thực phẩm xác nhận có liên quan đến thịt nhiễm độc clenbuterol Ngày 31 tháng 12 năm 2001 clenbuterol bị cấm dùng thức ăn gia súc I.2 Tình hình nhiễm clenbuterol Việt Nam - Ở Việt Nam, từ năm 2002, Bộ Nông nghiệp có Quyết định số 54/QĐ-BNN cấm sản xuất, nhập lưu thông số kháng sinh, hóa chất sử dụng thức ăn chăn nuôi, đó có clenbuterol - Năm 2005, Chi cục Thú y TP.HCM mở rộng kiểm tra phát số mẫu thịt lợn bày bán thị trường có chất Clenbuterol - Một năm sau, hội thảo hormone tăng trưởng Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT) công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006), quan chức phát 47/428 mẫu dương tính với Clenbuterol (chiếm gần 11%) - Năm 2011, số gần 500 mẫu thịt lợn bày bán các chợ TP.HCM, có gần 30% mẫu dương tính với Clenbuterol Đáng lo có kết quả xét nghiệm tồn số thịt heo tiêu thụ hết - Hiện nay, các tỉnh miền Nam, tình trạng lợn nhiễm độc Clenbuterol lan tràn diện rộng, thị trường miền Bắc chưa phát thịt lợn nhiễm Clenbuterol II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP II.1 Đối tượng - Thí nghiệm thực mẫu thịt heo gan heo lấy trực tiếp từ các lò giết mổ II.2 Phương pháp - Sử dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Đây phương pháp tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, mẫu chất thu lại dễ dàng 2.1 Dấu hiệu nhận biết: -Tính chất lý hóa của Clenbuterol: ▪ Dạng tinh thể không màu, mịn ▪ Phân tử gam: 277,19 ▪ Nhiệt độ nóng chảy: 174-175,5 oC ▪ Nhiệt độ sôi: 404,9oC ▪ Clenbuterol tan nhiều nước, aceton, methanon, ethanon, tan chloroform, không tan benzen -Thịt lợn có chứa clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, lớp mỡ mỏng, lỏng lẽo, thịt chạm vào có cảm giác bị ứ nước, da xuất đốm đỏ 2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất 2.2.1 Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Máy sắc ký lỏng cao áp gồm các phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) phần điều khiển xử lý số liệu (data processor) 2.2.2 Thiết bị hóa chất - Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: • Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm hệ thống tiêm mẫu tự động • Đầu dị khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI APCI • Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) • Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị xử lý liệu sắc ký - Hóa chất dung dịch thử • Nước cất lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M • Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) H 2O (0,1% HCOOH) (v/v) 2.2.3 Chất chuẩn nội chuẩn • Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl) • Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H9D9Cl2ON2) 2.3 Điều kiện quy trình thực 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký a.Khảo sát chọn bước sóng thích hợp: khảo sát để lựa chọn bước sóng thích hợp cho việc phát Clenbuterol b.Lựa chọn cột: c.Lựa chọn đệm: lựa chọn đệm có pH để peak clenbuterol tách tốt, cân xứng không làm giảm tuổi thọ cột d.Lựa chọn pha động: khảo sát lựa chọn pha động cho peak gọn, cân xứng hệ số bất đối thấp e.Lựa chọn tốc độ dòng: cho peak cân đối, thời gian chạy sắc ký phù hợp 2.3.2 Quy trình thực 2.4 Tiến hành phân tích máy III TÍNH TOÁN VÀ KẾT QUẢ: Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng mẫu trình phân tích: Nhận xét: Kết quả từ bảng cho thấy các diện tích peak của ion dd chuẩn dung dịch chuẩn thêm vào mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều chứng tỏ không có hiệu ứng giai đoạn tạo ion đầu dò khối phổ Kết quả xây dựng đường chuẩn Clen thịt 70 Y = 0,663x-0084 60 R =1 Clen (Nền thịt) 50 40 30 20 Co (μg/L) 10 20 40 60 80 100 Đường chuẩn Clen thịt Kết quả xác định hiệu suất thu hồi Đường chuẩn để xác định hiệu suất thu hồi xây dựng dung dịch các mẫu thịt, gan Hiệu suất thu hồi của Clen thịt heo xác định dựa đường chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn nội chuẩn theo nồng độ của Clen các mẫu Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H pp ), với việc sử dụng nội chuẩn đồng vị phải đạt khoảng 100% Có thể ước tính hiệu suất thu hồi thực (H t ) tách chiết bằng cách dựa đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch chuẩn Kết quả trình bày bảng 2: Bảng 2: Hiệu suất thu hồi Clen thịt: Nhận xét: Hiệu suất thu hồi của p.pháp đạt khoảng 100% dự đoán hiệu suất tu hồi thực các mẫu khảo sát đạt các kết quả sau: mẫu có nồng độ 0,0550μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 68,5-86,78% Kết quả khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Bảng 3: Giá trị LOD LOQ Clen: LOD (RSD%) Nền mẫu Cmẫu Co (μg/Kg) (μg/Kg) (μg/Kg) LOQ (μg/Kg) (RSD%) n=6 Thịt (2g) 0,0991 0,0495 0,017 (14,14) 0,051 (14,14) Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị LOD,LOQ của Clen nhỏ đáp ứng tiêu chuẩn của Châu Âu, Codex phù hợp với quy định của VN Bảng 4: Kết quả điều tra hàm lượng Clenbuterol thịt heo: Loại mẫu Tổng số mẫu Nhiễm Clenbuterol Thịt 28 (1,36-6,12) IV KẾT LUẬN Các kết quả đề xuất phương pháp phân tích định lượng Clenbuterol bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực có sử dụng nội chuẩn đồng vị (Clenbuterol-d9) cho kết quả xác, độ tin cậy cao Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu của châu Âu, với các giá trị đạt sau: - Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP %) khoảng 100% quy trình sử dụng để định lượng xác nồng độ của clenbuterol thịt gan heo - Hiệu suất thu hồi thực (HT %) từ tách chiết: Mẫu có nồng độ 0,05 – 50 (μg/Kg), HT%: 68,5 – 86,78% - Giới hạn phát (LOD) khá thấp cho clenbuterol: LODClen = 0,017 ( μg/Kg) Các trị số LODClen cho thịt (LOD 1/5 MRL) phù hợp với giá trị tối đa cho phép MRL theo cả tiêu chuẩn châu Âu Codex V TÀI LIỆU THAM KHẢO: Luận án Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ của Nguyễn Thị Thu Thủy [http://luanvan.co/luan-van/luan-an-danh-gia-ham-luong-cac-chat-agonistclenbuterol-va-salbutamol-trong-thuc-an-gia-suc-va-duluong-trong-thit-gia-53641/] Đồ án tốt nghiệp Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC [http://data.tailieuhoctap.vn/books/luan-van-de-tai/luan-van-de-tai-cddh/file_goc_770302.pdf] ...TỔNG QUAN VỀ β- agonist Họ β- agonist hợp chất đưa vào chăn nuôi, đặc biệt chăn ni heo để kích thích heo tăng trưởng cho thịt siêu nạc Tuy nhiên loại dư? ??c liệu chất kích thích mạnh... suất thu hồi xây dựng dung dịch các mẫu thịt, gan Hiệu suất thu hồi của Clen thịt heo xác định dựa đường chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn nội chuẩn theo nồng độ của Clen các mẫu Hiệu suất... PHƯƠNG PHÁP II.1 Đối tượng - Thí nghiệm thực mẫu thịt heo gan heo lấy trực tiếp từ các lò giết mổ II.2 Phương pháp - Sử dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Đây phương pháp