BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) phân tích saccharide trong tỏi đen và hoạt tính chống oxi hóa của nó

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y BÁO CÁO MƠN DƯỢC PHÂN TÍCH Đề tài: PHÂN TÍCH SACCHARIDE TRONG TỎI ĐEN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA NÓ GVHD: SVTH: 1.TÓM TẮT Tỏi đen tạo cách giữ toàn tỏi thường phòng ều chỉnh nhiệt độ 700C-800C từ 10-15 ngày mà khơng có xử lí nhân tạo hay chất phụ gia Tỏi đen chiết xuất với 80% ethanol cô đ ặc đ ể thu dẫn xuất ethanol tỏi đen Các đường saccharide ch ất chiết xuất xác định theo phương pháp đo màu fenol sulfate, DNS sắc kí lỏng HPLC Các khả chống oxi hóa phịng thí nghiệm chất chiết xuất đánh giá cách đo hoạt động tìm ki ếm 1,1-difenyl-2-Picrylhydrazyl(DPPH) Ruồi giấm đen sử dụng để nghiên cứu tác dụng chất chiết xuất từ tỏi đen tuổi thọ số chống oxi hóa thể Các kết cho thấy hàm lượng đường chất chiết xuất từ tỏi đen 55,5% bao gồm monosaccharide, disaccharide polysaccharide, lượng đường kh 25,22% Các kết (thực hiên phịng thí nghiêm)từ nghiên c ứu chứng minh chiết xuất từ tỏi đen có khả chống oxi hóa mạnh ống nghiệm, tuổi thọ ruồi giấm xử líbằng chiết xuất từ tỏi đen kéo dài rõ ràng lượng MDA giảm cách c ải thiện SOD( bao gồm CuZn-SOD MnSOD) hoạt động CAT 2.GIỚI THIỆU Tỏi, thứ ăn thuộc họ hoa loa kèn, sử dụng không ch ỉ nh gia vị thành phần ăn mà thuốc cổ truy ền điều trị ngăn ngừa bệnh 4000 năm Một số tác dụng điều trị hoạt động sinh h ọc tỏi báo cáo, nhiên, tỏi nên tiêu th ụ l ượng thích hợp khả gây độc báo cáo liều cao(Kim et al., 2012) S ự bi ến động tính thấm allicin đẫn đến kích thích th ể h th có mùi Do đó, cần thiết phát triển loại tỏi mà không giới hạn người dùng Gần đây, tỏi đen tiểu thuyêt ẩm th ực lên Nh ật Bản Hàn Quốc, sản phẩm tỏi đầu cho thời đại Tỏi đen đ ược sản suất thông qua lên men tự nhiên tồn tỏi thơng thường nhiệt độ cao độ ẩm cao điều kiện vài ngày mà khơng có s ự x lí nhân tạo hay chất phụ gia(Wang et al.,2010) Trong thời gian diễn q trình lão hóa, tép tỏi bình thường thay đổi màu sắc t màu tr ắng sang màu nâu cuối trở thành màu đen, nguyên nhân phản ứng Maillard Tởi đen mềm, chua, giống trái cây, th ức ăn vi ệc bóc v ỏ khơng có mùi khó chịu (Wang et al., 2010) Theo báo cáo trước đó, so với tỏi tươi,tỏi đen tăng gấp lần hàm l ượng polyphenol (Sato et al., 2006), gia tăng hoạt đ ộng ch ống oxi hóa, hàm lượng acid amin tăng gấp 2,5 lần( Chao et al., 2012), hàm lượng carbohydrate tăng 28,7-40%, lượng SAC gấp lần(Sasaki et al., 2007) Màu đen tỏi thể hiên loạt hoạt động sinh học, ch ẳng hạn chất chống oxi hóa ( Kim et al., 2012), chống ung th (Seo et al., 2012), hạ đường huyết (Wang et al., 2012), hypolipidemic(Kim et al., 2011a), đ ặc tính chống oxi hóa( Lee et al., 2011), bảo vệ gan(Kim et al., 2011b) hoạt động miễn dịch( Purev et al.,2012) Hơn nữa, tỏi đen cho th ho ạt chất chống oxi hóa mạnh thể (Zhu et al., 2008) đ ặc tính tìm kiếm gốc tự cao thể so vỏi tỏi tươi (Kim et al., 2012) Ruồi giấm đen loài động vật mẫu tuyệt vời để kiểm tra hiệu chống lão hóa hợp chất có tuổi thọ ngắn gen hoàn ch ỉnh h ơn chế độ ăn uống đơn giản(Boyd et el.,2011) Những chuột thí nghi ệm dòng tế bào sử dụng hệ thống mơ hình để điều tra nghiên cứu hoạt động chống oxi hóa, chống ung thư miễn dịch chất chiết xuất từ tỏi đen phổ biến( Sasaki et al.,2007 Seo et al., 2009 Zhu et al., 2008) hoạt tính chống oxi hóa chất chiết xuất từ t ỏi đen Ruồi giấm đen chưa tìm thấy báo cáo Hơn nữa, có vài báo cáo hàm lượng phân bố carbohydrate tỏi đen hoạt tính chống oxi hóa tỏi đen cần nghiên c ứu s dụng rộng rãi để chống lại rối loạn khác Vì vậy, m ục đích hi ện nghiên cứu kiểm tra thành phần hóa học chiết xuất ethanol tỏi đenvà đánh giá hoạt tính chống oxi hóa phịng thí nghi ệm Và chúng tơi thiết kế nghiên cứu để tìm hiểu tác động chất chiết xuất từ tỏi đen tuổi thọ ruồi giấm đen để xác nh ận tính ch ống oxi hóa màu đen chiết xuất từ tỏi 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1.Vật liệu Tỏi, bột ngô, bột nấm men mua từ thị trường nội địa Thiên Tân, Trung Quốc Tỏi đen thực phịng thí nghiệm c theo sáng chế ZL 201110154928.1 Ethanol,phenol, glucosum anhydricum thạch loại phân tích thu từ Jiangtian cơng ty thuốc thử hóa học Thiên Tân, Trung Quốc 1,1-Diphenyl-2-Picrilhydrazyl (DPPH), ascorbic acid (Vc) T-series tiêu chuẩn dextran mua từ công ty Thuốc thử Sigma (St Lous, MO, U.S.A.) Superoxide Dismutase (SOD) kh ảo nghiệm, khảo nghiệm Catalase(CAT), khảo nghiệm Malondialdehyde (MDA) Commassie xanh nhuộm KIT mua từJiancheing Bioengineering viện Nam Kinh, Trung Quốc Tất hóa chất thuốc thử phân tích mua địa phương 3.2.Chuẩn bị chiết xuất tỏi đen: 100g tỏi đen bóc vỏ( độ ẩm 52%) cắt nhỏ nghiền nát tr ộn với lần vật chất khô ethanol 80% Các mẫu chiết ethanol 24h nhiệt độ phòng lần Các dung dịch gạn chiết xuất thu th ập b ằng cách ly tâm, lọc dung môi loại bỏ cách bốc h để có chiết xuất ethanol từ tỏi đen Mơi trường động vật thí nghiệm tồn ruồi giấm đen: ruồi gi ấm đen hoang dã nhuộm Orengon K cung cấp từ phịng thí nghiệm c chúng tôi, tất ruồi ăn lượng thức ăn t ự mà cần trì mức trung bình với độ ẩm tương đối (55±5)%trong lị ấp sinh hóa (25±0,5)0C với chu kì chiếu sáng 12h trước sử dụng Bữa ăn ruồi chứa 72g ngô, 72g glucosum anhydricum, 6g thạch 750ml nước, 40ml ethyl p-hydroxybenzoate 1% ethanol 75% sau đung sôi hỗn hợp, bổ sung thêm 10g bột n ấm men, cu ối để giữ cho nấm men sống Sau đó, ống nghiệm cho khoảng 8ml h ỗn hợp Chất chiết xuất từ tỏi đen thêm môi tr ường n ồng độ 18,5; 37,5 75mg/ml tương ứng với nhóm liều 3.3.Xác định tổng hàm lượng đường Tổng lượng đường xác định theo phương pháp đo màu phenol sulphate(Masukoa et al., 2005) với sửa đổi nhỏ Lấy 1ml chất chi ết xuất(1mg/ml) vào pitpette thêm 1ml nước, sau 1ml phenol 6% thêm nhanh 5ml H2SO4 đậm đặc , hấp thu hỗn hợp đo 490nm sau lắc nhẹ để yên 20 phút nhiệt độ phịng Chỗ tr ống th ế nước cấtcó thể tích giống dung dịch chiết xuất Các tổng hàm l ượng đường xác định cách tham khảo đường cong chuẩn c fructose (y = 0.080x - 0.063, R = 0.999), đ ược vẽ t s ự t ập h ợp dung dịch đường khác phương pháp tương tự giải pháp chiết xuất làm 3.4.Xác đinh hàm lượng đường khử Hàm lượng đường khử xác định theo phương pháp DNS (Zhao et al., 2008) vơi sửa đổi nhỏ cách sử dụng fructose làm đ ường chuẩn Thuốc thử DNS bổ sung vào huyết có dung dịch fructose Lắc hỗn hợp làm nóng phút sau làm lành nhanh dỏng nước chảy qua có đường cong chuẩn y = 2.877x - 0.046, R = 0.999 Hoàn thành sau hấp thu 540nm ghi nh ận kết Các chiết xu ất ethanol nước cất thực tương tự 3.5 Phép đo phân phối trọng lượng phân tử carbohydrate Các mẫu riêng lẻ hòa tan nước cất (10mg/ml) Phân phối tr ọng lượng phân tử carbohydrate đo phương pháp GPC( phép ghi s ắc kí thấm gel) LC-20AT hệ thống HPCL (Shimadzu, Kyoto, Japan) với máy dị tìm số khúc xạ 10A Các liệu phân tích đánh giá b ởi h ệ thống xử lí Shimadzu LC solution 1.26 SP1 A Shodex OHpak SB-802.5 HQ (300×8 mm, μm, Showa Denko, New York, U.S.A.) Cột gel sử dụng trường hợp sau đây: pha động( nước cất), nhiệt độ cột (30 0C), áp lực cột( 3.0 MPa), tốc độ dòng chảy( 0.8ml/phút), kh ối l ượng tiêm( 20ml) Kiểm tra đường kính cột sử dụng tiêu chuẩn T dextra điều kiện Xác định trọng lượng phân tử sử dụng đường cong hiệu chuẩn đ ược đưa phương trình sau: Y = -0.0723 X3 + 2.0859 X2 - 20.225 X + 68.868 (r = 0.9996) 3.6.Phép đo DPPH Các hoạt động chống oxi hóa tỏi đen đánh giá cách đo hoạt động tìm kiếm gốc tự doDPPH dựa phương pháp Blois (Yen and Hsieh, 1995) với sửa đổi nhỏ Các chiết xuất đ ược hòa tan 0,1ml nước cất vào loạt nồng độ dung dịch mẫu khác trộn với 1,0ml dung dịch ethanol DPPH để yên 370 60 phút Độ hấp thu hỗn hợp 517nm Kiểm soát ổn định chỗ trống chuẩn bị tương tự trừ Vc thay cho nước cất Hoạt động tìm kiếm gốc tự DPPH tính tốn cách s dụng phương trình sau: [DPPH·] hoạt động tìm kiếm(%) = (Achỗ trống – Amẫu) /Achỗ trống×100 3.7 Khảo sát tuổi thọ Ruồi đực ngày tuổi chia thành nhóm ngẫu nhiên, bao gồm nhóm đối chứng nhóm thực nghiệm Mỗi ống chưa 20 ruồi, 10 ống thành nhóm Số lượng ruồi chết đếm lượng ruồi sống sót chuy ển đến môi trường ánh sáng gây mê ni tơ công nghiệp ngày l ần tất ruồi chết Số lượng ruồi ch ết bất th ường khơng tính vào lượng gây mê dính đến mơi trường Gía trị trung bình, số liệu tuổi thọ tối đa thời gian chết m ội n ữa c m ỗi nhóm ghi nhận 3.8.Xác định CAT, hoạt động SOD lượng MDA ruồi gi ấm Ruồi đực ngày tuổi chia thành nhóm đối chứng nhóm th ực nghiệm Mỗi ống chứa 25 ruồi, 10 ống thành nhóm Tất nh ững ruồi nhóm khác ni môi trường khác 30 ngày Sau đó, loại bỏ mơi trường chúng đói 2h ghi l ại cân nặng chúng trạng thái mê man Nh ững ruồi đ ược đ ồng nước muối sinh lí vơ trùng lạnh pha loãng 2% loại bỏ phần nổi, ly tâm 3500 rpm 10 phút 40C Việc xác định CAT, hoạt động SOD lượng MDA ruồi giấm nên so sánh v ới mẫu đ ối ch ứng Phân tích thống kê Bài kiểm tra người nghiên cứu(SPSS) sử dụng để phân tích s ự khác biệt nhóm đối chứng nhóm thực nghiệm ý nghĩa th ống kê xem xét p