BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) nghiên cứu và khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả bằng HPLC

NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Chương Giới thiệu 1.1 Lý chọn lựa đề tài 1.2 Mục tiêu, đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài Chương 2.Tổng quan lý thuyết 2.1 Tổng quan nitrat 2.1.1 Giới thiệu nitrate 2.1.2 Nguồn gốc nitrate Vì nitrate có nhiều đất ? 2.1.3 Ảnh hưởng nitrat sức khoẻ người 2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate số loại rau củ 2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 2.2 Tổng quan HPLC 2.2.1 Giới thiệu HPLC 2.2.2 Khái niệm HPLC 2.2.3 Phân loại sắc ký 2.2.4 Nguyên tắc trình sắc ký cột 2.2.5 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 2.3 Hệ thống HPLC 2.3.1 Bình đựng dung mơi 2.3.2 Bộ phận khử khí (Degasse) 2.3.3 Hệ thống bơm 2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu 2.3.5 Cột sắc ký 2.3.6 Detector 2.3.7 Bộ phận xử lý ghi tín hiệu 2.4 Chọn điều kiện sắc ký 2.4.1 Lựa chọn pha tĩnh 2.4.2 Lựa chọn pha động 2.4.3 Chuẩn bị dụng cụ máy móc 2.4.4 Chuẩn bị dung mơi pha động 2.4.5 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 2.4.6 Cách sử dụng máy HPLC Chương Phương pháp nghiên cứu 3.1 Quy trình thử nghiệm 3.1.1 Thuốc thử 3.1.2 Thiết bị - dụng cụ 3.1.3 Cách tiến hành 3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm 3.2.1 Độ 3.2.2 Độ xác 3.2.3 Tính đặc hiệu 3.2.4 Giới hạn phát 3.2.5 Giới hạn định lượng 3.2.6 Tính tuyến tính Chương Kết nghiên cứu 4.1 Kết thẩm định 4.1.1 Kiểm tra độ sai lệch phương pháp xử lý mẫu 4.1.2 Độ lặp lại 4.1.3 Tính tuyến tính 4.1.4 Độ 4.1.5 Giới hạn phát 4.1.6 Tính đặc hiệu 4.2 Kết khảo sát hàm lượng nitrate số loại rau củ phương pháp 4.3 Một số hình ảnh sắc kí đồ mẫu phân tích Chương Kết luận kiến nghị Chương Giới thiệu 1.1 Lý chọn đề tài Hiện nay, an toàn vệ sinh lương thực thực phẩm vấn đề cấp bách nhiều người quan tâm Số người phải cấp cứa vào bệnh viên ăn phải thức ăn bị nhiễm độc ngày tăng năm gần Do chạy theo suất, phận nông dân sử dụng liều lượng loại phân bón thuốc bảo vệ thực vật làm nhiễm độc cho loại rau dẫn đến gây độc chí nguy hiểm đến tính mạng người Rau sản phẩm nông nghiệp quan trọng việc cung cấp vitamin, khoáng chất bổ dưỡng khác liên quan đến sức khoẻ người Nhiều loại rau người sử dụng dạng tươi sống tác nhân hoá học sử dụng cho rau dễ bị haaos thụ chuyển trực tiếp vào thể người Nitrate ion đọc có rau quả, hàm lượng liên quan chặt chẽ đến liều lượng phân đạm sử dụng Sự có măt nitrate với hàm lượng lớn gây hại tác động xấu đến sức khoẻ Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng độc tố (trong có nitrate) có rau thị trường đồng thời giúp quan chức việc kiểm tra giám sát chất lượng lương thực, thực phẩm nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dung 1.2 Mục tiêu đối tượng nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu tính chất vật lí, hố lí, tác hại nitrate có rau củ  Đưa phương pháp xác định hàm lượng nitrate rau củ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC  Khảo sát hàm lượng nitrate có số loại rau củ có mặt thị thường Đối tượng nghiên cứu: số loại rau củ phổ biến bữa ăn hang ngày Phạm vi nghiên cứu: rau củ mua từ số chợ đia bàn thành phố Hồ Chí Minh Chương Tổng quan lý thuyết 2.1 Tổng quan nitrate 2.1.1 Giới thiệu nitrate Nitrate muối acid nitrite Trong muối nitrate, ion NO3- có cấu tạo hình tam giác với góc ONO 1200 độ dài liên kết N-O 1,218 A0 Ion NO3- khơng có màu nên muối nitrate cation khơng màu khơng có màu Hầu hết muối nitrate dễ tan nước Muối nitrate kim loại hoá trị hai hoá trị ba thường dạng hydrat Muối nitrate khan kim loại kiềm bền với nhiệt ( chúng thăng hoa chân khơng 3800 – 5000 ) Còn nitrate kim loại khác dễ phân huỷ đun nóng Độ bền nhiệt muối nitrate phụ thuộc vào chất cation kim loại 2.1.2 Nguồn gốc nitrat Vì nitrat có nhiều đất? Nitrat tạo thành tự nhiên từ nito lòng đất Nito tồn thiên chủ yếu dạng phân tử hai nguyên tử N2 nguyên tố phổ biến thiên nhiên, chiếm 78,03% thể tích khơng khí Một cách gần coi thể tích khơng khí gồn có phần N2 phần 02 Trong phân tử N2, nito liên kết với ba liên kết hoá trị Để phá vỡ liên kết cần lượng lớn khoảng 942kJ/mol Điều giải thích tính trơ phân tử N2 giải thích đa số hợp chất đơn giản N2, có liên kết bền, hợp chất thu nhiệt Cũng mà phần lớn sinh vật sống sử dụng trực tiếp Nito có sinh vật dạng hợp chất hữu phức tạp protein, acid nucleic, số sinh tố kích thích tố, chất màu máu, clorophin… Nito nguyên tố dinh dưỡng thực vật Bởi nông nghiệp, lượng lớn hợp chất nito thường xuyên cung cấp cho đất dạng phân tử đạm để nuôi trồng Nito tồn nhiều trạng thái ox khác NO3-, NO2 NH4 Trong dạng tồn nito NO3- NO2- quan tâm chúng ion có khả gây độc cho người Ngồi trạng thái nito cịn tồn trạng thái khí N2, NO, N2O Trong dạng tồn nito NO3- dạng bến tìm thấy nhiều nước ngầm khu vực đất trồng trọt Quá trình hình thành nitrate giai đoạn khơng thể thiếu vịng tuần hồn nito tự nhiên Chu trình nito chủ yếu liên quan đến phản ứng sinh học.Tất phản ứng chuỗi: N2 -> NH3 - > NO2 - >NO3 > NH4+ - > Protein  Các hợp chất nitơ xuất nước NH4+, NO2-, NO3là sản phẩm q trình phân huỷ vi sinh yếm khí (NH4+), hiếu khí (NO2-, NO3-) chất hữu chứa nitơ từ xác sinh vật, chất thải hữu giai đoạn đầu chất đạm tác dụng cuả vi khuẩn yếm khí phân huỷ thành NH3: (NH2)2CO H2O -> NH3 CO2 Ion amoni (NH4+) nước sau thời gian tương đối dài chuyển dần thành NO3• Các nguồn thải từ số ngành cơng nghiệp hố chất, cơng nghiệp thực phẩm chứa acid nitrite ( hoà tan nước mưa tạo HNO3) đưa vào nước lượng lớn NO3 - Thành phần nitơ đất chủ yếu dạng hữu cơ, kết trình phân huỷ thực vật động vật chết, phân, nước tiểu chuyển hố thành NH3, NH4+ sau bị oxi hố vi khuẩn tạo thành NO2- NO3- thực vật sử dụng NO3- làm chất dinh dưỡng Tuy nhiên, nồng độ tự nhiên nitrate đất không cao lắm, chưa đủ để đảm bảo cho trồng có suất cao Vì vậy, người nơng dân phải bổ sung vào đất loại phân đạm urê (NH2)2CO , NH4NO3, (NH4)2SO4 đặn để cấp thêm nitơ cho đất, sau thu hoạch đất bị bạc màu Khi vi khuẩn chuyển hố NH4+ thành NO3- hấp thụ Ngày sử dụng phân đạm sản suất nông nghiệp nhiều chưa quy định nguyên nhân chủ yếu gây ô nhiễm NO3- nước Tuy nhiên, nitrate amoni phần chủ yếu cối hấp thụ, phần giải phóng ngồi khí dạng N2, NH3 phần cịn lại tích tụ đất tan nước ngầm Từ cho thấy luợng đạm đưa vào đất nhiều lượng NO3dư thừa tăng Thực phẩm đồ uống có chứa hàm lượng nitrate thấp khơng có hại cho sức khỏe Cây cối hấp thụ nitrate đất để lấy dưỡng chất tạo dư lượng nhỏ Do tính động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nước ngầm Nếu người súc vật uống phải nước có nhiều nitrate dễ bị mắc chứng bệnh máu, đặc biệt trẻ nhỏ Nitrate hình thành vi sinh vật chuyển hóa phân bón, phân hủy xác động thực vật Nếu cối không kịp hấp thụ hết lượng nitrate nước mưa nước tưới làm cho ngấm vào lịng đất, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm Rất tiếc người lại thủ phạm tạo nguồn nhiễm nitrate lớn thông qua hoạt động nông nghiệp: • Sử dụng phân bón hóa học hữu • Chăn ni • Thải nước rác khơng qua xử lý • Hệ thống bể phốt 2.1.3 Ảnh hưởng nitrate sức khỏe người Nitrate chất dinh dưỡng cho cỏ (phân bón) để chúng sanh trưởng Khi thiếu ánh nắng, vào buổi sáng tinh mơ, mùa xuân mùa thu mùa đông lượng phân nitrate cao cỏ dự trữ lại tế bào Tự thân nitrate khơng có độc tố, thể người nitrate tạo nitrite điều kiện định Một người trưởng thành khỏe mạnh chịu lượng nitrate tương đối lớn mà không bị ảnh hưởng đến sức khỏe Trên thực tế, phần lớn lượng nitrate xâm nhập thể qua thực phẩm, cụ thể loại rau củ Tuy nhiên, lượng nitrate bị thải theo nước tiểu Thế nhưng, liên tục phải hấp thụ nitrate dẫn đến mắc phải số bệnh hình thành Nitrosamines (chất gây ung thư) làm rối loạn sức khỏe thay đổi hàm lượng vitamin, rối loạn việc tạo thyroxin tuyến giáp, thay đổi máu, ảnh hưởng xấu đến việc tái sản xuất…Hầu hết tất thực phẩm có chứa nitrate nitrate có mặt tự nhiên đất, nước khơng khí Sự ảnh hưởng xấu nitrate đến sức khỏe người chuyển đổi chúng thành nitrite enzyme Enzyme có tuyến nước bọt, dày đâu thể người có pH thấp Nitrosamine hộp chất có cấu trúc hóa-học R1N (-R2)N=O, có carcinogenic, tác nhân kích thích phát triển bệnh ung thư hay bệnh ác tính Hình 2.2: Cơng thức Nitrosamine Tại có Nitrosamine? Trong thức ăn, Nitrosamine hai yếu tố tạo nên nitrites amines Ta thấy hợp thành thường xảy proteins Với điều kiện thích hợp, chẳng hạn điều kiện acid, bao tử chúng ta, hay nơi có chiên xào với nhiệt độ cao, Nitrosamine dễ hợp thành Như ta biết nitrite hợp thành nitrous acid (HNO2), ta tách chúng làm đơi ta có hai phần: nơi cực dương ta có nitrosonium cation N = O+ cịn nơi cực âm ta có hydroxide anion OH- Rồi nơi phía cực dương cation nitrosonium tác dụng với amine cho ta chất gọi Nitrosamine Ngồi ra, Nitrosamine cịn có hoá chất dùng ngày kỹ nghệ hấp khô (dry cleaning industry) gây độc chất cho người Thêm nữa, hai nhà khoa học người Anh kể Magee Barnes nghiên cứu thêm tính chất khác có Nitrosamine hợp chất N-Nitroso (N-Nitroso compounds) Trên 300 hợp chất Nitroso thí nghiệm thấy khỏang 90% có thấy chất carcinogenic tạo bướu ác tính nhiều loại thú thí nghiệm Tất Nitrosamines là tác nhân gây đột biến (mutagens) bên tác dụng vào tế bào cơ-thể số tạo thành carcinogens, cho phần lớn quan đặc biệt thể Ví như: chất dimethylNitrosamine tạo ung thư gan (liver cancer) cho động vật thí nghiệm, Nitrosamine từ khói thuốc tạo ung thư phổi (lung cancer) Nitrosamine có mặt : Hiện diện thức ăn Ngồi Nitrosamine cịn thấy diện nhiều thực phẩm chế biến như: beer, cá, cá chế biến, sản phẩm thịt cheese thường dùng muối nitrite để bảo quản tạo màu đỏ thịt Vì nguy hiểm Nitrosamine, nên phủ Mỹ cho hàm lượng giới hạn dùng nitrite thịt để giảm thiểu gia tăng ung thư cộng đồng Mỹ Quốc Nitrosamines thực phẩm giới hạn: HbFe3 OH- No3- O2 Methemoglobine ? Đó sản phẩm Hemoglobine bị oxy hóa, Fe++ hóa trị hemoglobine chuyển thành Fe3+ hóa trị Hemoglobine có khả chuyên chở oxy đến mô thể nên làm da niêm có màu hồng methemoglobine khơng có khả vận chuyển oxy nên làm da niêm tím tái Bình thường hồng cầu hình thành methemoglobine (80% Giới hạn phát Hình 4.4: Đường mẫu blank Hình 4.5: Đường chuẩn nitrate nồng độ 0.01ppm Hình 4.6: Chồng phổ chất chuẩn nitrate blank Chồng phổ chất (màu đỏ: chất chuẩn nitrate 0.01ppm, màu xanh: blank) Nhận xét: Tỉ lệ S/N (tín hiệu so với nhiễu ) 3/1 Như giới hạn phát phương pháp 0.01ppm Tính đặc hiệu Hình 4.7: Phổ nitrate (bên phải) Hình 4.8: Phổ nitrate (bên trái) Hình 4.9: Phổ nitrite Nhận xét: Nitrate Nitrite hai chất có cấu trúc gần giống hình dạng phổ đạo hàm chúng khác Nitrite có điểm cực đại 220 điểm cực đại đạo hàm bậc 235 Cịn Nitrate có điểm cực đại 205 điểm cực đại đạo hàm bậc 225 Ngoài ra, click chuột vào bên trái bên phải phổ Nitrate cho hình ảnh giống nhau, chứng tỏ Nitrate, khơng phải chất khác Kết khảo sát hàm lượng nitrate số loại rau củ phương pháp ❖ Phương pháp tinh cột C18 Bảng 4.9: Kết khảo sát hàm lượng nitrate số mẫu rau (C18) Mẫu (C18) Khối lượng Diện tích Thời gian Nồng độ Nồng độ thực mẫu (g) peak lưu (phút) nitrate mẫu tế (mg/kg) Khổ qua 10.02 853 5.28 10.4 518.2 Cà chua 10.3 Cải bẹ xanh 10.41 6871.3 5.75 83.9 4030.4 Cà rốt 10.26 905.7 5.746 11.0 537.5 Bầu 10.2 139 5.606 1.7 81.4 Hành tây 10.21 162.1 5.554 1.9 95.2 Cà tím 10.56 265.3 5.62 3.2 151.8 Củ dền 10.58 2494.2 5.688 30.4 1438.4 Khoai tây 10.03 617.9 5.576 7.5 374.5 Hành 10.11 2095 5.71 25.6 1264.1 0.0 ❖ Phương pháp tinh Carrez Bảng 4.10: Kết khảo sát hàm lượng nitrate số mẫu rau (Carrez) Mẫu (C18) Khối lượng Diện tích Thời gian Nồng độ Nồng độ thực mẫu (g) peak lưu (phút) nitrate mẫu tế (mg/kg) Khổ qua 10.02 681.7 5.7 8.3 517.2 Cà chua 10.3 Cải bẹ xanh 10.41 5496.5 5.8 67.1 4029.6 Cà rốt 10.26 726.1 5.7 8.8 538.2 Bầu 10.2 110.3 5.7 1.3 80.3 Hành tây 10.21 130.7 5.6 1.6 95.5 Cà tím 10.56 213.3 5.6 2.6 152.1 0.0 Củ dền 10.58 2048.5 5.7 25.0 1476.3 Khoai tây 10.03 493.4 5.6 6.0 373.4 Hành 10.11 1668.2 5.7 20.3 1257.7 Một số hình ảnh sắc kí đồ mẫu phân tích  Chồng phổ: Peak theo thứ tự: chuẩn nitrate 5ppm (xanh dương), củ dền Carrez (đỏ), khoai tây Carrez (xanh cây) Hình 4.10: Chồng phổ nitrate mẫu củ dền, khoai tây với chuẩn nitrate  Chồng phổ: Hành C18 (xanh dương) hành Carrez (đỏ) Hình 4.11: Chồng phổ nitrate mẫu hành C18 Carrez  Sắc kí đồ chuẩn: ví dụ chuẩn ppm DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-15 09-12-53 DAT\003-0101.D) mAU 50 40 30 20 10 0 10 10 Hình 4.12: Sắc ký đồ chuẩn nitrate 5ppm  Sắc ký đồ số rau củ: DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000024.D) mAU Củ dền C18 400 8 350 300 250 200 150 100 50 Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu củ dền Cải bẹ xanh Carrez DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000011.D) mAU 1000 5 800 600 400 200 0 10 10 Hình 4.14: Sắc ký đồ mẫu cải bẹ xanh DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000014.D) mAU Cà rốt C18 1000 800 600 400 200 0 Hình 4.15: Sắc ký đồ mẫu cà rốt Khoai tây Carrez DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000022.D) mAU 250 200 150 100 50 0 10 10 Hình 4.16: Sắc ký đồ mẫu khoai tây DAD1 A, Sig=210,1 Ref=of (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\20100614000001.D) mAU Hành Carrez 8 200 150 100 50 0 Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu hành ... hiệu cao HPLC  Khảo sát hàm lượng nitrate có số loại rau củ có mặt thị thường Đối tượng nghiên cứu: số loại rau củ phổ biến bữa ăn hang ngày Phạm vi nghiên cứu: rau củ mua từ số chợ đia bàn thành... người 2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate số loại rau củ 2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 2.2 Tổng quan HPLC 2.2.1 Giới thiệu HPLC 2.2.2 Khái niệm HPLC 2.2.3 Phân loại sắc ký 2.2.4... tượng nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu tính chất vật lí, hố lí, tác hại nitrate có rau củ  Đưa phương pháp xác định hàm lượng nitrate rau củ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC  Khảo