BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) phân tích hàm lượng flavonoid trong lá và nụ vối

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y  BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG LÁ VÀ NỤ VỐI GVHD: Sinh viên thực hiện: I ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Đông y, vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hóa tốt Nước nụ vối có hoạt chất ức chế phát triển số vi trùng Gram âm Gram dương nên dùng lâu dài để điều trị bệnh viêm đại tràng bệnh tiêu hóa khác Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất năm 2013-2014) có chuyên luận nụ vối Tuy nhiên, chuyên luận chưa có tiêu chí định lượng flavonoid nụ vối, flavonoid thành phần có nhiều tác dụng quan sinh học quan trọng XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TRONG LÁ VÀ NỤ VỐI II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng: • Flavonoid: Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Hơn nửa rau thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid thành phần hay gặp dược liệu nguồn gốc thực vật Cho đến có khoảng 4.000 chất xác định cấu trúc Chỉ riêng nhóm flavon flavonol với nhóm OH và/hoặc OCH3 theo lý thuyết gặp 38.627 chất Phần lớn chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid từ flavus có nghĩa màu vàng) Tuy nhiên số có màu xanh, tím đỏ, số khác lại khơng có màu thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật có số nhóm hợp chất khác khơng thuộc flavonoid lại có màu vàng carotenoid, anthranoid, xanthon, cần ý để khỏi nhầm lẫn • Cây vối (lá nụ): Cây vối có tên khoa học Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry, thuộc họ Sim (Myrtaceae), loại mọc nhiều nhiệt đới Lá Vối chứa tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) tinh dầu, tinh dầu gồm nhiều thành phần thành phần (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen Trong vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự sterol Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần xác định cấu trúc hóa học Nụ vối phơi sấy 50oC khô Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp hóa lý dựa vào lực khác chất khác với hai pha tiếp xúc không đồng tan với nhau, pha động pha tĩnh Quá trình sắc ký xảy chế: hấp thụ, phân bố, trao đổi ion rây phân tử Thời gian lưu chất thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến chất khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic sắc ký đồ Dấu hiệu nhận biết Flavonoid • Tính chất lý hóa: Các dẫn chất flavon có màu vàng nhạt có khơng màu (trường hợp nhóm OH methyl hố), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol khơng có nối đơi liên hiệp vịng B với nhóm carbonyl nên khơng màu Các dẫn chất anthocyanidin màu thay đổi tuỳ theo pH môi trường Tuy nhiên flavonoid phận cịn phụ thuộc vào hỗn hợp với sắc tố khác Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid flavonoid sulfat hợp chất phân cực nên khơng tan tan dung mơi hữu cơ, tan nước tốt cồn nườc Các aglycon flavonoid tan dung mơi hữu cơ, không tan nước Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan dung dịch kiềm loãng Flavonoid tạo phức với ion kim loại mà ion kim loại xúc tác nhiều phản ứng oxy hóa • Tác động người: Các dẫn chất flavonoid có khả dập tắt gốc tự HO., ROO Các gốc sinh tế bào nhiều nguyên nhân sinh cạnh DNA gây ảnh hưởng nguy hại gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh lão hoá, tăng thị lực vào ban đêm., chống độc, kích thích tiết mật, chống co thắt tổ chức nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản số tổ chức khác), thông tiểu, chống viêm loét, ngừa nguy xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá , tổn thương xạ, thối hố gan… b Dụng cụ thiết bị hóa chất • Cân kỹ thuật Precisa XT 620M • Cân phân tích Precisa XT 220A • Máy cất quay Buchi B481 • Tủ sấy Binder – FD 115 • Đèn tử ngoại • Hệ thống HPLC _LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản) • Dung mơi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen • Bản sắc ký mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck) • Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63àm (Merck) ã Cỏc húa cht lm cỏc phn ứng định tính định lượng c Điều kiện quy trình trình thực Quá trình thực hiện: 1) Chiết xuất phân lập Flavonoid từ nụ vối: Cân kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết ethanol 96% phương pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm lần (dịch nhạt màu) Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol cô cách thủy, thu cao toàn phần (1192 g) Lấy 1000g cao đem hịa tan lượng vừa đủ 0,5 lít ethanol 96%, tiếp tục bổ sung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung mơi từ 49:1 đến 1:1) Dùng bình nón tích 250 ml để hứng dung dịch khỏi cột, thu 32 bình (200 ml) Tất bình hứng kiểm tra sắc ký lớp mỏng Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống có vết màu vàng, gộp bình lại, cất thu hồi dung môi cô cách thủy đến khô thu chất rắn có màu da cam, gọi chất rắn CO-1 (4,329 g) Chất rắn CO-1 tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-127 0C Kiểm tra độ tinh khiết máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic Kết hợp số liệu phổ UV, IR, 1H-NMR 13C-NMR cho thấy chất CO-1 2',4'dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT C18H18O4 KLPT 298 amu Phổ khối MS cho pic ion phân tử [M+H]+, có m/z = 299; [M-H]+ có m/z = 297, tương ứng với khối lượng phân tử chất rắn CO-1 M = 298 amu Kiểm tra độ tinh khiết HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy CO-1 nhiều lần cho kết ổn định 125-127oC Như vậy, sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập làm chất đối chiếu việc định lượng flavonoid mẫu nụ vối 2) Xây dựng phương pháp định lượng • Khảo sát tính thích hợp hệ thống: Pha mẫu đối chiếu có nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký lần với điều kiện sắc ký lựa chọn • Khoảng tuyến tính phương pháp: Chuẩn bị dãy gồm dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml tiến hành chạy sắc ký • Độ lặp lại phương pháp: Tiến hành thí nghiệm riêng biệt cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml với mẫu thực nụ vối Hưng Yên • Độ giới hạn phương pháp: Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) xác định hàm lượng lượng xác chất chuẩn cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát Phân tích mẫu chuẩn nồng độ 44 μg/ml, sau pha lỗng dần đến dung dịch chuẩn khơng cịn xuất tín hiệu chất phân tích Tiến hành phân tích theo điều kiện lựa chọn, nồn độ 0,031μg/ml coi giới hạn phát (LOD) củachứa phương 1: Bình phapháp động thể qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường (S/N) đạt khoảng 2-3 2: Bộ phận khử khí Xác định giới hạn LOL: Xác định cách nới rộng điểm đường chuẩn cho 3: Bơm đến tương quan nồng độ diện tích pic khơng cịn tuyến tính cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) d Tiến hành phân tích máy 6: Đầu dị 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý liệu7 điều khiển hệ thống 8: In liệu III III III III III III III TÍNH TỐN KẾT QUẢ • Khảo sát tính thích hợp hệ thống: Lần tiêm Thời gian lưu Diện tích pic 9,12766 2190950 9,7053 2186244 9,18479 9,47704 9,53417 9,41771 2205546 2245278 2214240 2213154 Các thông số thống kê SD = 21052 RSD = 0,95 (%) Kết cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC phù hợp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng CO-1 • Khoảng tuyến tính phương pháp: Δa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739 Δb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935 Phương trình hồi quy đầy đủ đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng sau: y = a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x107 ± 1898815,935) CC.01 (1) • Độ lặp lại phương pháp: • Độ giới hạn phương pháp: Hiệu suất thu hồi tính theo cơng thức sau : H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn thêm vào 10 Qua bảng cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả thu hồi lại cao 90% chấp nhận Như phương pháp có độ cao Ta có S/N = = = Kết xác định nồng độ giới hạn LOL Nồng độ (mg/ml) Diện tích Pic 0,11 0,1375 0,22 0,275 0,367 0,55 4575033 7119423 12105281 14809513 16490167 20791750 Từ kết cho thấy nồng độ giới hạn LOL 0,275 mg/ml, nồng độ trở đồ thị cho thấy diện tích pic nồng độ khơng cịn tuyến tính Như vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết tốt xác định nằm khoảng 0,1-0,275 mg/ml IV KẾT LUẬN 11  Đã phân lập flavonoid (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone) nụ vối làm chất đối chiếu định lượng flavonoid  Xác định độ tinh khiết flavonoid HPLC (98,21%)  Đưa điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký việc định lượng flavonoid nụ vối  Xác định khoảng tuyến tính (0,1 – 0,275 mg/ml) lập đường chuẩn flavonoid  Xác định giới hạn phát (LOD = 0,031 μg/ml) giới hạn định lượng phép đo (LOQ = 0,1023 mg/ml)  Đánh giá sai số độ lặp lại phép đo V     TÀI LIỆU THAM KHẢO http://www.duoclieu.org/2012/02/khai-niem-chung-ve-flavonoid.html http://www.duoclieu.org/2012/02/sac-ky-flavonoid.html http://www.duoclieu.org/2012/02/tac-dung-sinh-hoc-cua-flavonoid.html https://www.academia.edu/8276244/X%C3%A2y_d%E1%BB%B1ng_ph %C6%B0%C6%A1ng_ph%C3%A1p_%C4%91%E1%BB%8Bnh_t%C3%ADnh_ %C4%91%E1%BB%8Bnh_l%C6%B0%E1%BB%A3ng_flavonoid_trong_l %C3%A1_v%C3%A0_n%E1%BB%A5_v%E1%BB%91i  http://www.duoclieu.org/2012/02/tinh-chat-inh-tinh-flavonoid.html  http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/240816 Contents 12 ... ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TRONG LÁ VÀ NỤ VỐI II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng: • Flavonoid: Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Hơn nửa rau thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid... mẫu thực nụ vối Hưng Yên • Độ giới hạn phương pháp: Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) xác định hàm lượng lượng xác chất chuẩn cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát Phân tích mẫu... bệnh tiêu hóa khác Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất năm 2013-2014) có chuyên luận nụ vối Tuy nhiên, chun luận chưa có tiêu chí định lượng flavonoid nụ vối, flavonoid thành phần