Bài giảng Kỹ thuật cơ bản phân tích vi sinh vật trong thực phẩm - Trương Huỳnh Anh Vũ_1137949

4/18/2018 KỸ THUẬT CƠ BẢN PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ThS TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ Email: vutha@case.vn 0909182242 Tháng 04/2018 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ, PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 4/18/2018 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT Kích thước nhỏ bé Sinh trưởng, phát triển nhanh Thích nghi cao Phân bớ diện rộng, đa dạng về chủng loại VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT Tham gia q trình tuần hoàn vật chất tự nhiên: phân giải chất hữu cơ, khởi đầu chuỗi thức ăn, tham gia chu trình carbon, nitơ,… Trong cơng nghiệp: tham gia vào qui trình sản xuất hợp chất cồn, acid hữu cơ, enzyme,… Trong y học: vaccin, kháng sinh, vitamin, hormon,… Trong chế biến, bảo quản thực phẩm: sản xuất bột ngọt, sinh khối, rượu bia, đồ uống lên men, bacteriocin,… 4/18/2018 VAI TRÒ TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VI SINH VẬT Vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh chết người: thương hàn, dịch hạch, ung thư,… Là tác nhân gây bệnh cho người, động/thực vật Làm hư hỏng lương thực/thực phẩm PHÂN LOẠI VI SINH VẬT Vi sinh vật chia làm nhóm Virus (Vi rút) Bacteria (Vi khuẩn) Archae (Cổ khuẩn) Fungi (Nấm) Protozoa (Sinh vật nguyên sinh) Algae (Tảo) 4/18/2018 THIẾT KẾ PHỊNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT U CẦU CHUNG Khơng ảnh hưởng đến độ tin cậy phép phân tích Tránh nguy tạp nhiễm chéo Các cách để đạt mục tiêu là: a) xây dựng phịng thử nghiệm theo nguyên tắc “đường chiều” b) thực phịng ngừa thích hợp để đảm bảo phép thử độ nguyên vẹn mẫu (ví dụ: sử dụng hộp chứa hàn kín) c) tách riêng hoạt động theo thời gian/không gian d) Tránh điều kiện vượt cho phép như: nhiệt độ, bụi, độ ẩm, nước, tiếng ồn, độ rung v.v… 4/18/2018 YÊU CẦU CHUNG Để giảm nguy nhiễm chéo: a) Tường, trần sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa chịu chất tẩy rửa/chất khử trùng b) Sàn nhà không trơn c) Mọi cấu trúc phía cần bọc kín dễ làm vệ sinh định kỳ d) Các cửa vào cửa sổ cần đóng kín, chống bụi bám dễ lau rửa e) Nhiệt độ môi trường (18°C – 27°C) f) Mơi trường phịng thử nghiệm cần bảo vệ chống xạ mặt trời phía ngồi g) Khơng sử dụng rèm che phía khó làm vệ sinh trở thành nguồn tích bụi YÊU CẦU CHUNG Các khu vực phải tách biệt: - Nhận bảo quản mẫu - Chuẩn bị mẫu - Cấy/kiểm tra mẫu - Ủ cấy chuyền vi sinh vật - Bảo quản, cấy chủng chuẩn - Chuẩn bị khử trùng môi trường nuôi cấy/dụng cụ - Bảo quản môi trường nuôi cấy thuốc thử - Khử nhiễm,… 4/18/2018 KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG/KHỬ NHIỄM Tiệt trùng nhiệt khô - Tiệt trùng dụng cụ thủy tinh, đĩa petri,… - 170 °C ± 10 °C tương đương, Tiệt trùng nhiệt ẩm (hơi nước) - Tiệt trùng dụng cụ thủy tinh, mơi trường ni cấy vật liệu phịng thử nghiệm - Nhiệt độ 121 °C ± °C, 15 phút Tiệt trùng phương pháp lọc - Thường sử dụng cho đối tượng không bền nhiệt dễ hoạt tính tiếp xúc với nhiệt độ cao - Kích thước lỗ thường dùng 0.22, 0.45 µm 4/18/2018 Khử nhiễm hợp chất hóa học Sử dụng hợp chất hóa học sản phẩm chứa clo, cồn, hợp chất amoni bậc bốn,… nồng độ thích hợp để tiếp xúc với dụng cụ thời gian phù hợp Đảm bảo dư lượng hóa chất khơng ảnh hưởng đến phục hồi vi sinh vật Khử nhiễm tia UV Tia UV (tia cực tím) sóng điện từ nằm phổ điện từ ánh sáng nhìn thấy tia X Theo ISO 21348 tia UV chia thành ba loại sau: - Tia UVA (400nm÷315nm; 3.1÷3.94eV) UV gần - Tia UVB (280nm÷315nm; 3.94÷4.43eV) UV trung - Tia UVC (180nm÷280nm; 4.43÷12.4eV) UV xa 4/18/2018 MỘT SỐ THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ CƠ BẢN 4/18/2018 TỦ AN TOÀN SINH HỌC Khơng nên sử dụng đầu đốt khí đèn cồn tủ Sử dụng dụng cụ dùng lần (que cấy vòng, pipet, v.v ) lựa chọn thích hợp Cần để tủ xa thiết bị khác tốt Bố trí thiết bị vật liệu để giảm thiểu xáo trộn luồng khơng khí khoang làm việc CÂN PHÂN TÍCH Cân chủ yếu sử dụng để cân mẫu thử, môi trường nuôi cấy thuốc thử Ngồi ra, cân sử dụng để đo thể tích dịch pha lỗng theo khối lượng Độ xác cân cần đạt dung sai 1% phải đủ để đạt dung sai tối đa 5% khối lượng, trừ có quy định khác Ví dụ: Để cân 10g, cân cần có khả đọc đến 0,1 g Để cân 1g, cân cần có khả đọc đến 0,01 g Đặt cân mặt phẳng nằm ngang ổn định, điều chỉnh cần để đảm bảo mức thăng bằng, chống rung xê dịch 4/18/2018 BỘ ĐỒNG HÓA/MÁY DẬP MẪU Được sử dụng để chuẩn bị huyền phù ban đầu từ mẫu thử nghiệm Không sử dụng số loại thực phẩm như: - Có nguy làm thủng túi (có mặt hạt sắc nhọn, cứng khơ) - Các sản phẩm khó đồng hóa cấu trúc chúng (ví dụ: xúc xích dạng salami) Các máy trộn rung sử dụng cho hầu hết loại thực phẩm, bao gồm sản phẩm cứng/khô Thông thường thời gian hoạt động từ 0,5 đến Nếu vi sinh vật nằm sâu bên cấu trúc cần cắt mẫu thành miếng nhỏ trước xử lý MÁY ĐO pH Được sử dụng để đo chênh lệch điện thế, nhiệt độ xác định Phải có khả đọc đến 0,01 đơn vị pH, thực phép đo xác đến ± 0,1 đơn vị pH Máy đo pH phải có chế độ bù nhiệt thủ công bù nhiệt tự động 10 4/18/2018 NỒI HẤP ÁP LỰC Để khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ thử nghiệm, Không sử dụng nồi hấp áp lực để tiệt trùng dụng cụ (hoặc môi trường nuôi cấy) đồng thời với dụng cụ (hoặc môi trường nuôi cấy) qua sử dụng Tốt sử dụng nồi hấp áp lực riêng biệt cho hai trình Sau hấp khử trùng, tất vật liệu dụng cụ phải làm nguội nồi hấp, trước lấy Vì lý an tồn, khơng lấy sản phẩm khỏi nồi hấp áp lực nhiệt độ chưa giảm xuống 80°C TỦ ẤM Các tủ ấm phải điều chỉnh nhiệt độ thông số khác đồng ổn định Nếu nhiệt độ môi trường xung quanh cao nhiệt độ tủ, cần có hệ thống làm mát Thành tủ ấm cần bảo vệ tránh ánh nắng mặt trời Không nên để đầy tủ tủ thời gian dài để cân nhiệt độ Không mở cửa tủ thời gian dài 11 4/18/2018 TỦ LẠNH/TỦ ĐÔNG Tủ lạnh Để tránh nhiễm chéo, bảo quản mẫu vật riêng rẽ ngăn khác nhau: - Môi trường chưa nuôi cấy thuốc thử; - Các mẫu thử nghiệm; - Các chủng chuẩn vi sinh vật làm việc Việc để sản phẩm vào tủ lạnh bố trí cho khơng khí lưu thơng thích hợp giảm thiểu khả lây nhiễm chéo Tủ đông Tủ đông lạnh, nhiệt độ phải thấp -15°C, tốt -18°C Tủ đông sâu, nhiệt độ phải thấp -70°C Sử dụng để bảo quản vi sinh vật, chủng làm việc/chủng chuẩn thuốc thử KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Tránh đặt kính nơi có độ ẩm cao dẫn đến suy giảm chất lượng thấu kính Lau vật kính soi dầu phận liên quan khăn lau kính 12 4/18/2018 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 13 4/18/2018 YÊU CẦU CHUNG • • • • • • • Môi trường nuôi cấy dùng cho việc tăng sinh, phân lập, cấy chuyền định danh vi sinh vật Phân loại môi trường theo thành phần Môi trường tự nhiên Môi trường tổng hợp Môi trường bán tổng hợp Phân loại môi trường theo công dụng Môi trường tiền tăng sinh Môi trường tăng sinh chọn lọc Môi trường phân lập Mơi trường thử nghiệm sinh hóa Thành phần: nước, thạch, nguồn cacbon, đạm, vi khoáng, chất ức chế tăng trưởng, kháng sinh, thị,… THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI NƯỚC Chỉ sử dụng nước tinh khiết nước có chất lượng tương đương khơng chứa chất gây ức chế/ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật điều kiện thử nghiệm, ví dụ: tồn dư clo, amoniac ion kim loại Nước phải bảo quản vật chứa có nắp đậy kín làm vật liệu trơ (thủy tinh trung tính, polyetylen v.v ) khơng chứa chất gây ức chế Số lượng vi khuẩn không vượt 103 CFU/ml tốt 102 CFU/ml Độ dẫn điện nước không lớn 25 μS.cm-1 (tương đương với điện trở ≥ 0,04 MΩ.cm) tốt μS.cm-1 14 4/18/2018 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI AGAR Agar (thạch) tác nhân gây đông đặc để tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật Ưu điểm agar nhiều lồi vi sinh vật khơng sử dụng làm chất dinh dưỡng Nồng độ thích hợp để làm rắn môi trường thường – 2% Agar nóng chảy nhiệt độ 85 0C đơng đặc 32 – 40 0C THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI NITƠ HỮU CƠ Peptone Peptone sản phẩm phân giải trung gian protein, dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng Peptone trypticase sản phẩm phân giải casein pancreatin Phytone hay peptone papainic trích xuất từ đậu nành Peptone thịt sản phẩm phân giải thịt pepsin Cao nấm men (Yeast extract) Cao nấm men giàu loại axit amin, vitamin, tạo điều kiện phát triển tốt cho nhiều loại vi sinh vật Cao nấm men điều chế cách đơng khơ dung dịch ly trích từ nấm men qua trình tự phân Cao thịt (Meat extract) Được chế từ thịt loại bỏ gân, mỡ xử lý sơ enzym trước ly trích đặc Đây thành phần dinh dưỡng cực tốt 15 4/18/2018 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI CÁC CHẤT ỨC CHẾ CHỌN LỌC Azide sulfite: ức chế trực khuẩn gram âm môi trường chọn lọc Streptococcii Chất hoạt động bề mặt (Sodium Lauryl Sulphate, Sodium Dodecyl Sulfate): ức chế phần lớn vi khuẩn tạp nhiễm môi trường canh lauryl sulfate dung tăng sinh chọn lọc sang lọc sơ Coliforms THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Các chế phẩm từ mật bò (Ox bile) Mật bò: làm giảm sức căng bề mặt vùng tiếp xúc màng mơi trường, kích thích men autolysin nội bào dẫn đến phân giải màng tế bào • Thường dùng làm môi trường chọn lọc phân lập khả kích thích phát triển hệ vi sinh vật đường ruột ức chế vi khuẩn gram dương Hỗn hợp muối mật (Bile salts): hỗn hợp muối Na acid có mật bị (cholic, taurocholic, desoxycholic,…) tác dụng giống mật bò hoạt tính cao dùng với nồng độ thấp Trong desoxycholate taurocholate hợp chất có khả phân giải màng mạnh Sodium desoxycholate: chế phẩm muối mật dùng nhiều môi trường chọn lọc phân lập vi khuẩn đường ruột, gram âm 16 4/18/2018 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI CƠ CHẤT PHẢN ỨNG SINH HÓA Những chất thường dùng loại đường lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose, arabinose, xylose, galactose, raffinose, melibiose, glycerine, mannitol, sorbitol, adonitol, … với nồng độ khoảng 0,5 – 1% Các vi sinh vật tạo enzym phân giải biến đổi chất môi trường thành chất mới, chất nhận diện thuốc thử thay đổi pH qua chất thị màu thích hợp 17 4/18/2018 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CƠ BẢN VI SINH VẬT KỸ THUẬT PHA LOÃNG 18 4/18/2018 KỸ THUẬT ĐỔ/TRÃI ĐĨA KỸ THUẬT CẤY RIA/CẤY ĐÂM SÂU 19 4/18/2018 KỸ THUẬT LỌC MÀNG KỸ THUẬT MPN 20 4/18/2018 21 4/18/2018 KỸ THUẬT CRYOBANK BẢO QUẢN CHỦNG CHUẨN Gồm hạt sứ, xốp, rỗng tự nhiên sử lý với axit chất lưu trữ lạnh phù hợp (cryopreservative fluid) tạo điều kiện cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bám lên bề mặt hạt 22 4/18/2018 CÁCH SỬ DỤNG PIPET 23 4/18/2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://nihe.org.vn/vn/tin-tuc-su-kien/dao-tao/dao-tao-ngan-hantap-huan/ky-thuat-pha-che-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vikhuan-c12326i14680.htm ISO 7218:2007/Amd.1:2013 Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations AMENDMENT F Power, P Pell, and P Sneath, 1978 A simple method for storage of bacteria at −76°C J Appl Bacteriol 44:313-316 http://www.mastgrp.biz/MASTD_en/MIBI-Fly-291XXXCryobank-Rekultivierungsstudie-e.pdf https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colisure/ https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colilert/ Một số hình ảnh sử dụng tài liệu trích dẫn từ nhiều nguồn từ internet khác 24 ... Các vi sinh vật tạo enzym phân giải biến đổi chất môi trường thành chất mới, chất nhận diện thuốc thử thay đổi pH qua chất thị màu thích hợp 17 4/18/2018 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CƠ BẢN VI SINH VẬT KỸ... Vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh chết người: thương hàn, dịch hạch, ung thư,… Là tác nhân gây bệnh cho người, động /thực vật Làm hư hỏng lương thực/ thực phẩm PHÂN LOẠI VI SINH VẬT Vi sinh vật chia... bào vi khuẩn dễ dàng bám lên bề mặt hạt 22 4/18/2018 CÁCH SỬ DỤNG PIPET 23 4/18/2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://nihe.org.vn/vn/tin-tuc-su-kien/dao-tao/dao-tao-ngan-hantap-huan/ky-thuat-pha-che-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vikhuan-c12326i14680.htm