VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – GIAI ĐOẠN SẢN XUẤT BAN ĐẦU – KỸ THUẬT LẤY MẪU

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10782:2015 ISO 13307:2013 Xuất lần VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – GIAI ĐOẠN SẢN XUẤT BAN ĐẦU – KỸ THUẬT LẤY MẪU Microbiology of food and animal feed – Primary production stage – Sampling techniques HÀ NỘI – 2015 TCVN 10782:2015 TCVN 10782:2015 Lời nói đầu TCVN 10782:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 13307:2013; TCVN 10782:2015 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 10782:2015 TCVN 10782:2015 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10782:2015 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Giai đoạn sản xuất ban đầu – Kỹ thuật lấy mẫu Microbiology of food and animal feed – Primary production stage – Sampling techiniques Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định kỹ thuật lấy mẫu giai đoạn sản xuất thực phẩm-thức ăn chăn nuôi ban đầu để phát định lượng vi sinh vật sống có khả gây bệnh truyền qua thực phẩm Tiêu chuẩn không dùng để chuẩn đoán bệnh động vật Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Giai đoạn sản xuất ban đầu (primary production stage) Bao gồm tất giai đoạn sản xuất thực phẩm từ trại chăn nuôi đến thu hoạch đến sở giết mổ TCVN 10782:2015 3.2 Mẫu phòng thử nghiệm (laboratory sample) Mẫu chuẩn bị để gửi đến phịng thí nghiệm để kiểm tra thử nghiệm Bố trí chung 4.1 Yêu cầu chung Các bên có liên quan người đại diện bên có liên quan cần có mặt tiến hành lấy mẫu Trường hợp đặc biệt, ví dụ: quy định, yêu cầu lấy mẫu và/hoặc phát sinh từ phép phân tích cụ thể cần thực cần tuân thủ yêu cầu 4.2 Nhân viên lấy mẫu Việc lấy mẫu để kiểm tra vi sinh vật phải người đào tạo có kinh nghiệm kỹ thuật lấy mẫu phân tích vi sinh thực 4.3 Bao gói dán nhãn mẫu Các mẫu phải bao gói để tránh lây nhiễm chéo tránh rị rỉ thất độ ẩm Các mẫu phải ghi nhãn rõ ràng Các chi tiết tối thiểu phải kèm mẫu thử là: chất mẫu, nhận biết mẫu, tên họ tên viết tắt người ủy quyền lấy mẫu, ngày, (nếu thích hợp) địa điểm lấy mẫu Các thông tin phải ghi lại biểu mẫu Có thể sử dụng biểu mẫu cho vài mẫu thử với điều kiện mẫu thử có đặc điểm nhận dạng riêng mẫu thử có kèm theo biểu mẫu liệt kê chi tiết mẫu với mã nhận dạng thống 4.4 Chuẩn bị biểu mẫu lấy mẫu Các mẫu phải kèm theo báo cáo, tốt ghi đầy đủ biểu mẫu chuẩn phòng thử nghiệm cung cấp, người lấy mẫu ký ghi họ tên Báo cáo phải bao gồm thông tin cụ thể sau đây: - Địa điểm, ngày thời gian lấy mẫu (nếu thích hợp); - Tên người lấy mẫu; - Bản chất, số lượng nhận biết mẫu tạo thành chuyến hàng; - Mục đích lấy mẫu vi sinh vật cần nghiên cứu TCVN 10782:2015 Khi cần, báo cáo phải bao gồm điều kiện chi tiết thông tin cụ thể có liên quan đến sản phẩm cần lấy mẫu, ví dụ: khó khăn việc lấy mẫu đại diện Nếu sử dụng chất bổ sung ví dụ dịch pha lỗng, mơi trường vận chuyển thuốc thử kiềm hóa cần phải báo cáo lại Dịch pha loãng chất khử trùng 5.1 Dịch pha loãng 5.1.1 Yêu cầu chung - Dịch pha loãng dùng để làm ẩm tất loại gạc (bao gạc bọc ủng, tăm v.v ): - Dung dịch muối pepton chuẩn bị theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1); - Nước đệm pepton chuẩn bị theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1); - Nước vô trùng; - Nước uống dùng cho mẫu nước khơng làm ảnh hưởng đến q trình phân tích, ví dụ: bao gạc bọc ủng 5.1.2 Môi trường vận chuyển gạc dùng cho mục đích cụ thể Mục đích chung mơi trường để bảo tồn sống sót quần thể đích, ví dụ Campylobacter đặc biệt nhạy với mơi trường khơ Ví dụ mơi trường vận chuyển: - Nước đệm pepton dùng cho Salmonella chuẩn bị theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1); - Môi trường vận chuyển Cary-blair tương đương; - Môi trường vận chuyển than chì Amies tương đương Trong trường hợp mẫu có tính axit tính kiềm thay đổi suốt q trình vận chuyển dùng dịch pha loãng đệm Nếu cần định lượng phải tính đến khả nhân lên sinh vật đích sinh vật cạnh tranh trước kiểm tra phòng thử nghiệm TCVN 10782:2015 5.2 Chất khử trùng để khử nhiễm bề mặt bao gói, thiết bị bề mặt số mẫu định 5.2.1 Etanol, 70 % thể tích 5.2.2 Khăn lau chứa cồn 5.3 Chất trung hòa, dùng cho chất khử trùng cịn sót lại 5.3.1 u cầu chung Chất trung hịa thích hợp dùng cho tất trường hợp, khơng quy định chất khử trùng cần kiềm hóa tối ưu hóa chất đặc hiệu (xem Bảng 1) Tuy nhiên, sử dụng chất khử trùng chưa biết xác thành phần sử dụng chất trung hòa dùng cho nhiều mục đích (5.3.2) Bảng – Thành phần chất trung hịa thành phần trung hòa Thành phần chất trung hòa Các thành phần trung hòa Lexithin đậu tương Amoni bậc bốn Sorbitan monooleat (polysobat 80) Etanol L-Histidin Aldehyd Natri thiosulfat (Na2S2O3.5H2O) Halogen Phenol Dinatri phosphat (Na2HPO4.12H2O) 5.3.2 Axit kiềm Chất trung hịa dùng cho nhiều mục đích 5.3.2.1 Thành phần Lexithin đậu tương 3,0 g Sorbitan monoleat (polysorbat 80) 30,0 g L-Histidin 1,0 g Natri thiosulfat (Na2S2O3.5H2O) 7,8 g Dinatri phosphat (Na2HPO4.12H2O) 100,8 g Nước 000 ml TCVN 10782:2015 5.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng Khử trùng 15 nồi hấp áp lực trì 121 oC Có thể bảo quản mơi trường chuẩn bị nhiệt độ (5 ± 3) oC ba tháng bình chứa đậy kín tránh ánh sáng Thường sử dụng dung dịch trung hòa nồng độ 10 % thể tích dịch pha lỗng (5.1) Thiết bị, dụng cụ vật liệu 6.1 Dụng cụ lấy mẫu mô tả 6.1.1 Yêu cầu chung Cần khử trùng thiết bị lấy mẫu loại không dùng lần trước sử dụng, ví dụ: nhiệt nóng (nồi hấp áp lực) nhiệt khơ theo TCVN 6404 (ISO 7218) Trong trường hợp cụ thể,có thể khử nhiễm hóa chất thích hợp Sau xử lý, thiết bị phải sạch, vô trùng không chứa chất gây ức chế Nếu thiết bị cần sử dụng lại lấy mẫu tốt khử trùng lửa (xem 6.1.10) etanol 70 % thể tích chất khử trùng thích hợp khác [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Dụng cụ dùng lần chất dẻo đựng bao gói kín (ví dụ: găng tay cao su, túi bọc ủng, loại túi chất dẻo) thích hợp để sử dụng suốt trình lấy mẫu sản phẩm giai đoạn sản xuất ban đầu Mỗi lần lấy mẫu (ví dụ: lấy mẫu trại chăn ni khác nhau), nên sử dụng bao gói Trong suốt trình lấy mẫu, cần thực biện pháp phòng ngừa để tránh nhiễm bẩn vật liệu/thiết bị dùng lần mà chưa sử dụng 6.1.2 Găng tay cao su, dùng lần, không thấm nước, sử dụng suốt trình lấy mẫu để bảo vệ người lấy mẫu để tránh nhiễm bẩn chéo Cách khác, sử dụng túi chất dẻo 6.1.3 Túi bọc ủng, chất dẻo dai, có kích cỡ thích hợp túi hình ủng để bọc bên ủng giày, dùng cho hai mục đích: đảm bảo an tồn sinh học đến trại chăn nuôi để tránh bị nhiễm bẩn để bọc bên ủng trước lấy mẫu bao gạc bọc ủng (6.1.6) 6.1.4 Gạc vải, thường miếng vải vô trùng lớn, bọt biển từ xenlulose, vải dệt không dệt dùng để lau diện tích bề mặt lớn 6.1.5 Tăm bơng, miếng gạc bơng tất loại gạc gồm nhiều phần sợi nhỏ vật liệu tổng hợp gắn vào đầu que gỗ, kim loại chất dẻo Các que lấy mẫu thường đựng ống vơ trùng chứa mơi trường mơi trường vận chuyển than chì Amies Vật liệu sử dụng khơng có hợp chất ức chế vi sinh vật trừ hợp chất quy định để lấy vi sinh vật đích TCVN 10782:2015 6.1.6 Bao gạc bọc ủng, loại gạc vải thiết kế phù hợp để bọc bên chân, cho người lấy mẫu lấy mẫu gạc xung quanh Bao gạc sử dụng phải có khả thấm hút thích hợp để hút ẩm Chúng làm từ vật liệu băng đàn hồi dạng ống cắt thành đoạn dài thích hợp kéo qua giày ủng Ngồi ra, sử dụng bao gạc bọc ủng thương mại (tránh loại giày đế chất dẻo) vật liệu vơ trùng thích hợp khác để bọc bàn chân mũ trùm đầu vải vô trùng (bao trùm tóc) Để tránh bị nhiễm bẩn từ giày dép người lấy mẫu, cần mang bao gạc bên túi bọc ủng chất dẻo (6.1.3) mới, vào khu vực lấy mẫu 6.1.7 Gạc tấm, chủ yếu sử dụng ngành chăn nuôi gia cầm, bao gồm bốn vải lớn làm ẩm (ví dụ miếng hút ẩm khơng có chất kháng khuẩn) gắn vào kéo dài qua lớp rơm lót chuồng khu vực dát gỗ hố có chứa chất thải rắn Gạc bọt biển loại nhỏ bán sẵn có diện tích bề mặt hạn chế so với thiết kế nêu 6.1.8 Gạc Moore gạc lót bơng, thường miếng gạc vải rộng có nhiều lớp gạc sợi bọc gạc Thường sử dụng khăn vệ sinh gạc lót bơng (khơng chứa chất kháng khuẩn) loại Các miếng bọt biển xenlulose rộng thích hợp 6.1.9 Gạc dây Các đoạn dây bện thừng mềm, vơ trùng có đường kính từ cm đến cm (ví dụ bảy dây chuồng nuôi lớn) đặt ngang qua máng thức ăn nước cho gia súc nhai chạm nhẹ vào dây 6.1.10 Đèn khí đốt đèn nung nhỏ cầm tay 6.1.11 Kẹp, dao, kéo vơ trùng 6.1.12 Thìa dao trộn vơ trùng 6.1.13 Bàn chải cứng vô trùng 6.1.14 Hộp lạnh, cách ly, có hệ thống làm lạnh túi lạnh để trì mẫu nhiệt độ thấp (khoảng oC) q trình vận chuyển đến phịng thí nghiệm 6.2 Hộp đựng mẫu Hộp túi đựng mẫu phải làm vật liệu thích hợp có kết cấu cho bảo vệ toàn mẫu, không gây biến đổi bên mẫu khơng làm ảnh hưởng đến kết phép phân tích Thường túi chất dẻo vật chứa cứng (bình chai có nắp vặn thủy tinh nhựa) Vật chứa bao bì kín phải khơ, sạch, kín vơ trùng Hình dạng thể tích vật chứa phải thích hợp với yêu cầu cụ thể sản phẩm lấy mẫu Các vật chứa khác với túi chất dẻo phải đóng kín nút thích hợp nắp chắn 10 TCVN 10782:2015 Kỹ thuật lấy mẫu – Yêu cầu chung Mẫu lấy từ động vật môi trường xung quanh chúng, kể suốt trình vận chuyển sở giết mổ, để giám sát lây truyền yếu tố gây bệnh từ động vật sang người Việc lấy mẫu phải tiến hành cho thu mẫu đại diện vật liệu cần thử nghiệm Các mẫu phải lấy kỹ thuật vô trùng, thiết bị, vật liệu vật chứa quy định Điều Phương pháp lấy mẫu, khối lượng thể tích chất mẫu cần lấy thay đổi theo chất sản phẩm mục đích dùng mẫu lấy Để biết chi tiết yêu cầu, xem Điều đến Điều 11 Vật chứa mẫu phải đóng kín sau mẫu lấy Kỹ thuật lấy mẫu môi trường trại chăn nuôi 8.1 Việc lấy mẫu thực sau làm khử trùng Lấy mẫu từ bề mặt khử trùng khó khăn có chất khử trùng cịn sót lại thường khơng biết trước chất khử trùng sử dụng Có thể sử dụng chất trung hịa chất khử trùng cụ thể “thơng dụng”, số chất trung hịa có ảnh hưởng không mong muốn đến phát triển vi sinh vật bị ức chế sinh vật cạnh tranh dẫn đến phép thử cho âm tính giả Khi lấy mẫu chuồng nuôi gia súc khử trùng tốt lấy mẫu sau tất bề mặt khô để giảm thiểu ảnh hưởng ức chế chất khử trùng cịn sót lại mẫu Ví dụ vị trí lấy mẫu tường bề mặt sàn, dụng cụ uống nước, máng cho ăn, chuồng ni, vách ngăn, thiết bị di chuyển máy cân, hệ thống ống dẫn, dầm gờ, bảng điều khiển, sàn phòng chờ khu vực dịch vụ Hệ thống băng tải qua chuồng ni tầng lấy mẫu Khi thích hợp, chuyển mẫu gạc lấy cho vào lượng dư (ít phần khối lượng 100 phần thể tích) mơi trường tăng sinh mơi trường tăng sinh sơ đặc hiệu (ví dụ cho miếng gạc vải vào 225 ml BPW Salmonella mơi trường đặc hiệu khác hịa tan và/hoặc bất hoạt chất khử trùng Trong trường hợp này, mẫu phòng thử nghiệm phải cấy ngày lấy mẫu Nếu kiểm tra ngày lấy mẫu phải sử dụng dịch pha lỗng có chứa chất trung hịa để làm ẩm miếng gạc trước lấy mẫu Nếu sử dụng chất khử trùng biết thêm chất trung hịa thích hợp (xem Bảng 1) vào dịch pha lỗng có liên quan (5.1) Nếu sử dụng chất khử trùng chưa biết xác thêm chất trung hịa “thơng dụng” (5.3.2) 11 TCVN 10782:2015 8.2 Lấy mẫu bề mặt 8.2.1 Lấy mẫu gạc vải Khi sử dụng loại gạc (6.1.4) cần đeo găng tay cao su (6.1.2) mẫu sử dụng “kỹ thuật lộn ngược túi”, túi polyetylen (6.1.2) giữ miếng gạc lộn ngược để lộ miếng gạc, sử dụng miếng gạc để lấy mẫu bề mặt Chà mạnh miếng gạc bề mặt chọn cho mặt miếng gạc phủ hết nhìn thấy miếng gạc bị bẩn, lấy mẫu diện tích tối thiểu m2 Túi sau lộn ngược trở lại, niêm phong để vận chuyển mẫu gạc Khi lấy mẫu bề mặt khô, miếng gạc cần làm ẩm dịch pha lỗng thích hợp (5.1) Nếu nên sử dụng hai mặt miếng gạc để tối đa diện tích bề mặt lau thu vật liệu miếng gạc Cũng dùng miếng gạc lấy mẫu từ phần riêng biệt bề mặt Khi lấy mẫu khu vực vết nứt khe tường miếng gạc gắn vào que gỗ vơ trùng dụng cụ tương tự ấn nhẹ xuống vết nứt 8.2.2 Lấy mẫu tăm Để thu tối đa vi sinh vật sử dụng tăm bơng(6.1.5) lớn Khi lấy mẫu từ khu vực q ướt tăm bơng phải khơ khu vực lấy mẫu khơ (ví dụ mẫu mơi trường) tăm bơng cần làm ẩm dịch pha lỗng thích hợp (xem 5.1) Lấy tăm bơng khỏi vỏ bọc vô trùng làm ẩm đầu tăm cách ngâm ống chứa dịch pha loãng Ấn đầu tăm vào thành ống để loại bỏ chất lỏng dư Khi lấy mẫu bề mặt, diện tích lớn vừa đủ cần lau để đảm bảo tất bề mặt tăm phủ vật liệu Một vài vị trí đặc biệt khác cần lau lấy nhiều tăm để thu vi sinh vật đích tối đa Khi lấy mẫu khu vực có vết nứt hay khe tường, mục đích để thăm dị độ sâu vật liệu hữu có mặt thu nhiều vật liệu tăm bơng Sau lấy mẫu, bẻ cắt tăm kỹ thuật vô trùng Cho vào môi trường vận chuyển (xem Điều 12), cần 8.3 Lấy mẫu sàn nhà 8.3.1 Lấy mẫu bao gạc bọc ủng Đảm bảo diện tích bề mặt bao gạc bọc ủng (6.1.6) tối đa bao gạc phải ướt hoàn toàn trước sử dụng Bao gạc phải bên “túi bọc ủng” (6.1.3) không để túi bọc ủng bao gạc tiếp xúc trực tiếp với chất khử trùng Do đó, để vào khu vực lấy mẫu cần phải qua máng chứa chất khử trùng trước túi bọc ủng bao gạc bọc ủng Bao gạc bọc ủng sử dụng để lấy mẫu loại bề mặt sàn Bao gạc bọc ủng sử dụng để lấy mẫu nhóm động vật trước có thay đổi có lớp lót bổ sung 12 TCVN 10782:2015 Các bao gạc bọc ủng làm ẩm nước dịch pha lỗng thích hợp khác (xem 5.1) sử dụng bao gạc làm ẩm trước Điều quan trọng phải diện tích lớn đại diện cho khu vực lấy mẫu, ví dụ chuồng ni gia cầm cần 100 bước chuồng, bao gồm toàn chiều dài, chiều rộng chuồng, khu vực rác thải khu vực dát gỗ mỏng đảm bảo bao gồm khu vực chứa phân rác thải ướt bên nguồn nước uống Thay bao gạc bọc ủng sau đơn vị lấy mẫu 8.3.2 Lấy mẫu gạc Có thể sử dụng gạc (6.1.7) giống bao gạc bọc ủng áp dụng nguyên tắc lấy mẫu, nghĩa cần lấy đại diện bề mặt lấy mẫu, tốt sử dụng nhiều gạc diện tích Để tăng hiệu gạc, dẫm lên gạc vài lần mang túi bọc ủng (6.1.3) 8.3.3 Lấy mẫu phân chuồng 8.3.3.1 Mô tả Phân chuồng lớp đất trộn lẫn với phân động vật 8.3.3.2 Quy trình lấy mẫu Việc lấy mẫu phân chuồng từ rơm lót ổ gia cầm dễ dàng thường không đại diện, thiếu độ nhạy Tốt thu lấy lượng mẫu lớn sau lấy phần mẫu thử trại chăn nuôi Cách tốt để lấy mẫu phân chuồng di chuyển qua tồn chuồng ni, lấy lượng nhỏ phân chuồng từ 60 khu vực riêng rẽ chuồng nuôi để thu lượng mẫu khoảng kg Lượng mẫu gửi đến phịng thử nghiệm trộn kỹ lấy phần mẫu thử 25 g gửi đến phòng thử nghiệm Các mẫu phân chuồng nên lấy trước cho ăn 8.3.4 Các mẫu phân sàn hỗn hợp không tự nhiên 8.3.4.1 Mô tả Phân sàn loại phân động vật tiết ra, thu từ sàn chuồng ni 8.3.4.2 Quy trình lấy mẫu Mẫu chung thường lấy từ đến 20 mẫu phân riêng rẽ khơng làm giảm mạnh độ nhạy việc xác định Salmonella, kết cạnh tranh hệ sinh vật cạnh tranh ảnh hưởng chất ức chế axit hữu cơ, chất kháng khuẩn thể thực khuẩn, mẫu chung lớn 13 TCVN 10782:2015 thường thu từ gia cầm, hỗn hợp phần mẫu thử lấy Điều tăng nguy làm lỗng mẫu khơng phát vật liệu dương tính mẫu chung tỷ lệ đàn thấp, làm tăng khả lấy phân tươi rải rác Các loại phân hỗn hợp tự nhiên loại phân bám phận cào phân băng tải lót chuồng gia cầm cầu dẫn phân chuồng lỏng, máy cào phân máy rải phân trại chăn nuôi lợn gia súc thường mẫu tốt phân từ lượng lớn động vật riêng rẽ thường gộp thành mẫu gom lại thời gian dài Cần đảm bảo phân bố mẫu lấy đại diện cho bầy đàn vật nuôi Trong mẫu phân lớn, ví dụ mẫu phân từ gia súc, tác nhân gây bệnh đích phân bố khơng đồng mẫu phân riêng rẽ Vì vậy, nên lấy nhiều phần mẫu thử để tối ưu hóa việc phát sinh vật đích Đối với vi sinh vật phép thử phát dựa phương pháp ni cấy có độ nhạy thấp khơng nên gộp mẫu phân riêng rẽ ảnh hưởng cạnh tranh sinh vật khác lớn dẫn đến giới hạn phát vi sinh vật đích tương đối cao 8.3.5 Các mẫu phân hỗn hợp tự nhiên 8.3.5.1 Mô tả Đây mẫu phân kết hợp tự nhiên từ động vật nuôi giữ đàn Sự tích trữ phân xảy khoảng thời gian gộp lại dọn vệ sinh hệ thống làm phân 8.3.5.2 Quy trình lấy mẫu Các mẫu phân hỗn hợp tự nhiên từ chuồng nuôi riêng rẽ ni theo đàn, ví dụ lợn gia súc, thu thủ cơng thìa, dao trộn (6.1.12) – lấy xẻng lấy mẫu Cách khác, phân thu gom từ mặt đất, dùng tay lồng bên túi chất dẻo lộn ngược (túi chất dẻo lộn ngược mặt phía ngồi) Sau lấy phân, túi tháo khỏi tay lộn ngược mặt phải để giữ kín mẫu phân Túi sau niêm phong kín Ngồi ra, sử dụng miếng gạc vải (6.1.4) để lau qua khu vực vật liệu dính phân tươi gom lại Ví dụ phân tươi hỗn hợp tự nhiên trộn lẫn với phân đổ đống lót phân máy cào phân sau chạy máy cào phân băng tải phân trại chăn nuôi nhiều tầng; phân đổ đống bãi thả gia súc băng tải tự động cầu nâng phân bón máy rải phân bón q trình chăn ni lợn; phân bón khu vực cho ăn khu vực nước uống khu ăn nghỉ động vật cho sữa Không lấy mẫu loại hệ thống bãi rác thải sâu, trường hợp thu chất lỏng bị rò rỉ từ rác thải miếng gạc vải Ngồi sử dụng bao gạc bọc ủng để lấy mẫu lớp lót 14 TCVN 10782:2015 8.4 Mẫu bụi 8.4.1 Mô tả Bụi lắng đọng hạt khơng khí có nguồn gốc chủ yếu từ phân khô động vật bao gồm vật liệu từ da, lông da động vật vật liệu mơi trường khơ, ví dụ vật liệu lót bị vỡ khô thành bụi, hạt thức ăn dạng bột mịn Các mẫu bụi khơng thích hợp để khảo sát vi sinh vật nhạy với môi trường khơ Campylobacter 8.4.2 Quy trình lấy mẫu Bụi lấy thủ cơng cách sử dụng găng tay cao su lấy từ sàn nhà cách sử dụng bàn chải cứng thích hợp vơ trùng (6.1.13) Ở nơi khó lấy, sử dụng dụng cụ cạo Ở nơi bụi sử dụng miếng gạc vải (6.1.4) ẩm để lấy lớp bụi mỏng bề mặt Đối với hầu hết mẫu, nhiều bụi bẩn thu phép thử có độ nhạy cao Tốt nhất, tránh lấy mẫu bụi bẩn từ khu vực gần hệ thống phân phối thức ăn hạt bụi thức ăn xuất khắp khu vực bụi tích tụ Nơi thích hợp để lấy mẫu bụi vách chắn quạt thơng gió, gờ tường, dầm kết cấu chuồng trại thiết bị/khớp nối di động lối chuồng nuôi Có thể đặt giá tạm thời nơi cần thiết để gom bụi kết cấu có sẵn chuồng trại khơng phù hợp Cũng sử dụng thiết bị điện Không thu lấy bụi từ máy sưởi đèn chiếu sáng sử dụng nhiệt ánh sáng làm giảm lượng vi khuẩn có mẫu 8.5 Mẫu nước 8.5.1 Mơ tả Mẫu nước phải bao gồm cặn có mẫu lấy từ hệ thống cấp nước uống cho động vật 8.5.2 Quy trình lấy mẫu Có thể lấy mẫu nước cách dễ dàng cách sử dụng miếng gạc vải khô (6.1.4) vớt cặn từ dụng cụ uống nước kiểu chuông kiểu máng làm xung quanh bề mặt chung máng vật chứa nước, ngăn ngừa phát triển tảo đơn bào động vật nguyên sinh Miếng gạc hấp thu từ 20 ml đến 30 ml nước q trình thao tác Thơng thường khơng làm dụng cụ uống nước có khớp nối kể vết nứt rò rỉ dụng cụ uống nước chuồng ni sử dụng, điều đưa nhiễm bẩn mơi trường nói chung Đối với động vật uống nước từ nguồn nước tự nhiên bãi chăn thả mẫu tốt cặn lấy từ dòng nước chảy chậm khúc cong sông suối hố sâu suối nơi mà cặn lắng đọng lại Các cặn vớt lên cho vào lọ thu miếng gạc vải 15 TCVN 10782:2015 Lấy mẫu đường ống hệ thống cấp nước trước xả cho động vật cách tốt để thu thể tích nước lớn (ví dụ: từ lít đến 10 lít) Phương pháp khác lắp lọc hệ thống cấp nước để kiểm tra định kỳ treo miếng bọt biển cellulose miếng gạc lót bơng vơ trùng thùng chứa nước để giữ lại sinh vật Miếng gạc gỡ bỏ cấy chỗ sau ngày đến ngày lấy mẫu 8.6 Mẫu gạc Moore gạc lót bơng Sử dụng gạc Moore (6.1.8) để tập trung vi khuẩn dòng chất lỏng chảy qua hệ thống làm cống rãnh dòng nước Đây mẫu sàng lọc hữu ích để phát vi khuẩn Salmonella chỗ Các dụng cụ lấy mẫu thường thả neo cống rãnh cho nước thải chảy qua từ đến ngày, sau lấy đưa vào nuôi cấy 8.7 Gạc dây Phương pháp sử dụng thành công để phát Escherichia coli (VTEC) O157 sinh độc tố verotoxin nhóm gia súc, nguyên tắc áp dụng cho hầu hết vi sinh vật môi trường Da gia súc thường xuyên bị nhiễm bẩn phân gia súc thường xuyên liếm da chúng q trình chải lơng gây nhiễm bẩn lưỡi khoang miệng Nếu dây gạc vô trùng (6.1.9) treo phía máng đựng thức ăn nước gia súc chuồng ni cọ xát nhai dây, vi khuẩn bám vào sợi dây gạc Sau khoảng 24 h để chỗ, dây gạc tháo bỏ vi sinh vật đích cấy cách ngâm canh thang làm giàu 8.8 Bộ lọc sữa dùng lần Bộ lọc sữa thường bố trí thiết bị vắt sữa bể chứa sữa để loại bỏ hạt vật liệu ngoại lai lớn khỏi sữa, bao gồm phân Các lọc dùng lần thường làm giấy Vật liệu thu từ lọc cung cấp đánh giá tổng thể đầy đủ tình trạng vi sinh vật tiêu chuẩn vệ sinh trại chăn ni, chúng tập trung từ nhiều nguồn khác tạo thành mẫu đơn lẻ Nếu khơng có lọc dùng lần, rửa lọc cố định cách tráng rửa lọc dịch pha lỗng sử dụng phép thử vi sinh vật khác 16 TCVN 10782:2015 Kỹ thuật lấy mẫu từ động vật 9.1 Lấy mẫu từ động vật trại chăn nuôi 9.1.1 Lấy mẫu tăm Việc nhốt giữ động vật thường cần thiết Khi lấy mẫu trực tràng, ổ nhớp khoang mũi que gạc (6.1.5), cần cẩn thận để không làm bị thương vật thu lấy vật liệu lấy tăm Điều thực cách nhẹ nhàng ngốy vịng tăm bơng đồng thời kiểm tra cẩn thận khoang mũi lấy mẫu Không nên sử dụng tăm gỗ để làm trực tràng Tăm cần thấm ướt trước sử dụng dung dịch muối đẳng trương, nước vô trùng môi trường có ích cho vi khuẩn an tồn động vật 9.1.2 Phân 9.1.2.1 Mô tả Phân tươi phải lấy sàn nhà lấy trực tiếp từ trực tràng động vật Thông thường dễ dàng thu mẫu phân tươi sau vật nuôi ăn no kích thích q trình tiết 9.1.2.2 Quy trình lấy mẫu Một mẫu phân gồm hỗn hợp phân tươi lấy từ năm địa điểm khác sàn chuồng nuôi, mẫu phân hỗn hợp đại diện cho mẫu phân phân bố chuồng Để lấy mẫu phân riêng rẽ, việc nhốt giữ vật nuôi thường cần thiết Cẩn thận lấy mẫu phân khỏi trực tràng cách sử dụng ngón tay đeo găng tay vơ trùng (6.1.2) thay găng tay lần lấy mẫu vật 9.1.3 Lấy mẫu da lông 9.1.3.1 Mô tả Da lông thường bị nhiễm bẩn phân vị trí thuận lợi để lấy mẫu, việc lấy mẫu da lông có mặt mầm bệnh đàn Các miếng gạc lớn làm ẩm bao gồm miếng gạc vải sử dụng (xem 6.1.4) 9.1.3.2 Quy trình lấy mẫu Việc nhốt giữ vật ni cần thiết, lấy mẫu thường thực suốt trình cho ăn Lựa chọn số lượng vật nuôi đại diện chuồng nuôi 17 TCVN 10782:2015 Tiếp tục lau lưng khu vực bị nhiễm bẩn khác vật nuôi (tối đa năm miếng gạc) Đối với lợn, lau lưng từ vai đến đuôi miếng gạc cho thấy có hiệu Đối với loại động vật khác, khu vực đáy chậu bụng thích hợp 9.1.4 Lấy mẫu đoạn nối trực tràng-hậu môn 9.1.4.1 Mô tả Nhiều nghiên cứu chứng minh hình thành khuẩn lạc VTEC O157 đoạn nối trực tràng – hậu môn gia súc Lấy mẫu thủ công cách lau cho độ nhạy cao so với lấy mẫu phân từ vật nuôi riêng rẽ Sử dụng miếng gạc vải (6.1.4) 9.1.4.2 Quy trình lấy mẫu Các vật nuôi riêng rẽ lấy mẫu thủ cơng cách dùng ngón tay di chuyển miếng gạc vải trực tiếp lên niêm mạc bên hậu môn Đối với gia súc trưởng thành, miếng gạc quấn quanh tay xoay bàn tay trình kiểm tra trực tràng 9.2 Lấy mẫu vật ni sở giết mổ 9.2.1 Lượng chứa trực tràng 9.2.1.1 Mô tả Thu lấy lượng chứa trực tràng sở giết mổ sau vật nuôi chết cách lấy trực tràng lượng chứa trực tràng sau moi ruột số trường hợp lấy mẫu trực tràng trước moi ruột 9.2.1.2 Quy trình lấy mẫu Sử dụng đèn khí đốt cầm tay, đốt bề mặt bên ngồi trực tràng khử trùng etanol khăn lau (5.2) có tẩm cồn, để chất khử trùng bay hết Thu lấy tối thiểu 25 g lượng chứa trực tràng vào túi kín vơ trùng vào vật chứa có nắp vặn vơ trùng 9.2.2 Lượng chứa manh tràng toàn manh tràng 9.2.2.1 Mô tả Lấy lượng chứa manh tràng khỏi ruột sau moi ruột 18 TCVN 10782:2015 Đối với gia cầm, mẫu tốt manh tràng nguyên vẹn Đối với lợn vật nuôi khác, đoạn cuối manh tràng buộc lại gửi đến phịng thử nghiệm, khử trùng cẩn thận bên manh tràng lượng chứa lấy chỗ 9.2.2.2 Quy trình lấy mẫu 9.2.2.2.1 Đối với gia cầm Cắt ngang đầu gần ruột đầu manh tràng cách kéo cắt, hai túi manh tràng cho vào vật chứa vô trùng Cách khác, cắt cẩn thận túi manh tràng nguyên vẹn mà khơng làm rơi lượng chứa ngồi 9.2.2.2.2 Lợn vật nuôi khác Lấy ruột buộc đầu vào manh tràng tay Vuốt lượng chứa manh tràng phía cuối Sử dụng đèn khí đốt cầm tay, đốt bề mặt khử trùng etanol (5.2), để etanol bay hết Rạch vết hình khuy áo dài khoảng 0,5 cm thành manh tràng dao mổ vô trùng Xoay ngược manh tràng để vết hình khuy áo quay xuống Thường khơng cần thiết gây áp lực lên manh tràng để đưa lượng chứa manh tràng qua vết rạch, điều thực cần Lấy cẩn thận cho lượng chứa không chạm đến phần chưa khử trùng thành manh tràng khơng để giọt chất lỏng từ bên ngồi ruột lẫn vào mẫu Thu lấy mẫu vào túi vật chứa lớn vơ trùng có nắp đậy kín 9.2.3 Hạch bạch huyết màng treo ruột 9.2.3.1 Mơ tả Phân lập ruột Xác định đoạn nối ruột tịt-manh tràng Gỡ phần màng treo ruột tịt-manh tràng tay để tiếp cận đến hạch bạch huyết ruột tịt-manh tràng 9.2.3.2 Quy trình lấy mẫu Sử dụng găng tay (6.1.2) (găng tay chất dẻo bó sát thích hợp) gỡ hạch bạch huyết khỏi màng treo xung quanh mô mỡ tay Để thu 25 g mẫu chung, thông thường mẫu cần bao gồm hạch bạch huyết đầu gần hỗng tràng Cho mẫu vào túi kín vật chứa có nắp vặn vơ trùng 19 TCVN 10782:2015 9.2.4 Amiđan 9.2.4.1 Mô tả Trong số trường hợp, cần loại bỏ hàm khỏi đầu động vật để tiếp cận đến họng Các hạch nhân lưỡi ghép thành cặp gốc lưỡi, amiđan vòm miệng nằm khu vực vòm miệng (gốc miệng) niêm mạc vòm miệng Các hạch nhân lưỡi thường loại bỏ với lịng gắn lại vào đầu 9.2.4.2 Quy trình lấy mẫu Sử dụng công cụ vô trùng (dao kẹp) (6.1.11), cẩn thận cắt hai hạch nhân lưỡi tránh cắt amiđan hạch nhân lưỡi Nếu khơng có hạch nhân lưỡi cắt amiđan vịm miệng Cho mẫu vào túi vơ trùng buộc kín vật chứa có nắp vặn vô trùng 10 Kỹ thuật lấy mẫu trại sản xuất giống 10.1 Yêu cầu chung Kiểu lấy mẫu chủ yếu dùng để phát Salmonella 10.2 Các mẫu lớp lót lồng ấp 10.2.1 Mơ tả Lớp lót lồng ấp giấy sử dụng để lót khay ấp trứng chất dẻo kim loại 10.2.2 Quy trình lấy mẫu Mẫu có diện tích bề mặt lót lớn tốt, tổng cộng khoảng m2, nghĩa mẫu lớn thu phải nuôi cấy túi vật chứa lớn Nếu có thể, cịn bao gồm vỏ trứng vỡ, mẫu bao gồm vỏ trứng vỡ bị nghiền nát lớp lót Thu cẩn thận mẫu lớp lót vào túi vô trùng để giữ nguyên chất nhớt nhiều tốt 10.3 Vỏ trứng vỡ 10.3.1 Mô tả Các loại mẫu vỏ trứng rỗng lại sau gà nở gà mang 10.3.2 Quy trình lấy mẫu Vỏ trứng vỡ thu từ hệ thống không sử dụng lớp lót lồng ấp Cần thu mảnh trứng vỡ từ nhiều ổ lồng ấp tốt vào túi lớn 20 TCVN 10782:2015 10.4 Lông tơ lồng ấp 10.4.1 Mô tả Mẫu vật liệu lớn, nhẹ, khô bụi bắt nguồn từ lớp da gà con, với vật liệu từ phân su khô số bụi bề mặt lồng ấp 10.4.2 Quy trình lấy mẫu Mặc dù thường có lượng lớn lơng tơ sinh q trình trứng nở, có số vật liệu thích hợp để thử nghiệm so với vật liệu khác Lông tơ lấy từ sàn lồng ấp tốt nhất, chúng ẩm độ ẩm lồng ấp cao phải gửi đến phòng thử nghiệm, tập hợp mẫu lông tơ khô từ ống nối cao tốt hơn, đặc biệt mẫu lơng tơ ống thơng khí lồng ấp Có thể thu mẫu tay đeo găng miếng gạc vải Để tránh việc xử lý lơng phịng thử nghiệm hạn chế nguy lây nhiễm chéo, nên thu lấy lượng lơng cần phân tích vào túi bình đủ lớn để bổ sung trực tiếp mơi trường ni cấy vào bình thu Lượng lơng tơ bụi cần thiết cho vào túi gạc rộng để giảm thiểu phân tán lơng nhỏ thao tác phịng thí nghiệm 10.5 Phân su 10.5.1 Mơ tả Đây mẫu thải từ đường ruột gà nở, thu cách dùng tay bóp lỗ huyệt gà 10.5.2 Quy trình lấy mẫu Thao tác thường tiến hành q trình phân loại giới tính lỗ huyệt kiểm tra tay phần thao tác phân loại gà thông thường Phân su dồn vào vật chứa thu mẫu chung từ 250 gà Tốt phải thu mẫu từ 300 gà cho phát tỷ lệ nhiễm bẩn phân su % đàn 10.6 Lấy mẫu lồng ấp 10.6.1 Mô tả Các mẫu lấy miếng gạc vải (6.1.4) 10.6.2 Quy trình lấy mẫu Xem 8.2.1 21 TCVN 10782:2015 10.7 Chất thải ướt nơi ấp trứng 10.7.1 Mô tả Mẫu bao gồm tất vật liệu có nguồn gốc từ q trình ấp trứng: vỏ trứng, phơi chết vỏ, gà chết vật thừa xử lý qua máy ngâm trước xả vào thùng chất thải 10.7.2 Quy trình lấy mẫu Gạc vải lau phía máy ngâm, vật liệu bị đổ văng khỏi máy ngâm sử dụng để đánh giá nhiễm bẩn vật liệu ngâm trước 10.8 Phơi chết vỏ 10.8.1 Mô tả Các phôi gà chết lấy mẫu để kiểm tra sau chết để phát Salmonella lây nhiễm Khi trứng cịn ngun vẹn phơi thị đặc trưng có khả nhiễm Salmonella đàn giống Vấn đề tần suất lây truyền bên trứng chưa nở thường thấp, trừ lượng lớn mẫu kiểm tra độ nhạy phát lây nhiễm thấp Mẫu khơng tính đến việc truyền nhiễm Salmonella qua bề mặt vỏ, vết nứt, màng vỏ 10.8.2 Quy trình lấy mẫu Thông thường, lấy tối thiểu 60 trứng đưa đến phịng thử nghiệm Dùng kỹ thuật vơ trùng lấy phận nội tạng túi nỗn hồng khỏi phôi gộp lại 10.9 Gà loại 10.9.1 Mô tả Gà nở trại nuôi chọn giống (những trống dòng gà đẻ) gà bị khuyết tật phát khơng thích hợp để nuôi dưỡng thường chọn lọc trại giống 10.9.2 Quy trình lấy mẫu Việc kiểm tra thực theo nguyên tắc tương tự mẫu phôi chết vỏ Thông thường, lấy tối thiểu 60 gà đưa đến phòng thử nghiệm 22 TCVN 10782:2015 10.10 Lấy mẫu từ gà vận chuyển đến trại chăn nuôi 10.10.1 Mô tả Mẫu bìa cứng đặt đáy hộp chứa gà vận chuyển gà đến trại chăn ni Phân su gà dính lên bìa Khi sử dụng mùn cưa làm lớp lót mẫu khơng thích hợp bị lẫn lộn lấy miếng vụn từ đáy nhiều hộp có sử dụng miếng gạc vải 10.10.2 Quy trình lấy mẫu Tốt nên lấy mẫu trước thả gà vào chuồng điều lúc thực Mẫu cần lấy cẩn thận để giảm thiểu nhiễm bẩn từ chuồng tay người lấy mẫu Đặt vào năm lớp lót cho đàn, tổng diện tích bề mặt m2 vào túi chất dẻo vô trùng đặt túi mẫu vào túi thứ hai trước gửi đến phòng thử nghiệm 11 Kỹ thuật lấy mẫu động vật vận chuyển xe, thùng sọt 11.1 Yêu cầu chung Lấy mẫu gạc từ động vật vận chuyển phải thực sớm tốt sau đưa động vật 11.2 Xe chở gia súc lớn (trâu, cừu, lợn, ngựa) Sử dụng miếng gạc vải loại lớn (6.1.4) dụng cụ lấy mẫu thích hợp khác (trong xe tải chở gia súc), dùng bao gạc bọc ủng (6.1.6) để lấy mẫu phân cịn sót lại mặt sàn Lấy mẫu đại diện tất khu vực sàn Khi lấy mẫu bề mặt, bề mặt lấy mẫu rộng, số lượng mẫu riêng rẽ lấy thử nghiệm lớn khả phát sinh vật đích cao 11.3 Thùng sọt dùng để vận chuyển gia cầm Rất khó làm khử trùng hiệu sọt sử dụng để vận chuyển gia cầm giết mổ, nhiễm bẩn phát cách lấy mẫu gạc liên quan đến vấn đề trước gia cầm có Mặc dù vậy, lấy mẫu gạc phần phân lại sọt sàn xe vận chuyển có ích để đánh giá khả nhiễm bẩn lô hàng giết mổ Khi lấy mẫu bề mặt, lấy mẫu gạc lượng đại diện sọt lơ lớn hội phát vi sinh vật lớn Chỉ nên dùng gạc lau sàn sọt nên lấy nhanh lượng lớn sọt lấy mẫu toàn số lượng nhỏ sọt Trong trường hợp thùng sọt dùng để vận chuyển gia cầm q trình ni vỗ béo ni đẻ trứng (làm giống sản xuất trứng thương phẩm), trang thiết bị phải 23 TCVN 10782:2015 khử trùng hiệu lô cho việc lấy mẫu gạc đại diện tình trạng lơ hàng 11.4 Lấy mẫu xe vận chuyển sau làm khử trùng Sử dụng gạc vải cầm tay (6.1.4) để lấy mẫu nhiều tốt bề mặt tiếp xúc với động vật, bề mặt khác xe bao gồm quạt thơng gió Để đánh giá khả xe vận chuyển có khả nhiễm bẩn (sau làm khử trùng), lấy mẫu chỗ để chân, bánh xe vật liệu bề mặt cần lấy mẫu 12 Bảo quản vận chuyển mẫu 12.1 Khuyến cáo chung Đối với yêu cầu chung, xem TCVN 6404 (ISO 7218) Việc vận chuyển mẫu phải tuân theo quy định an toàn sinh học Sự chậm trễ thời điểm lấy mẫu kiểm tra nên ngắn tốt Các mẫu tốt nên làm lạnh trước cho vào vật chứa vận chuyển cách ly phương tiện vận chuyển cần làm lạnh Mẫu vận chuyển nhiệt độ thường, tốt cần kiểm tra vòng 24 h sau lấy mẫu Mẫu giữ lạnh vận chuyển cần thực kiểm tra vòng 72 h Đối với mẫu phân mẫu môi trường để phát Salmonella tránh vận chuyển nhiệt độ mơi trường nóng q mức (trên 25 oC) tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời tiến hành kiểm tra mẫu vòng 72 h 12.2 Khuyến cáo vi sinh vật nhạy cảm Đối với vi khuẩn nhạy cảm, như: Campylobacter, tất mẫu nên làm ẩm, vận chuyển kiểm tra vòng 24 h nhiệt độ thường vòng 48 h 72 h tùy thuộc loại mẫu giữ lạnh (xem Bảng 2) Tiến hành cẩn thận để tránh làm đông mẫu làm lạnh Trong số trường hợp, môi trường vận chuyển có ích, ví dụ mơi trường vận chuyển Amies dùng cho tăm môi trường Cary-Blair dùng cho bao gạc bọc ủng (6.1.6) Mẫu phòng thử nghiệm chưa kiểm tra phải bảo quản lạnh trước phân tích Khuyến cáo lấy loại mẫu khác cho sinh vật nhạy cảm khác liệt kê Bảng 24 TCVN 10782:2015 Bảng – Khuyến cáo bảo quản, vận chuyển, nhiệt độ thời gian vi sinh vật nhạy cảm Loại mẫu Môi trường vận chuyển Nhiệt độ Thời gian tối đa trước kiểm tra mẫu o o Từ C đến 10 C Phân (chọn mẫu tươi ẩm) Không cần thiết (mẫu ẩm tự nhiên) Nhiệt độ môi trường từ oC đến 25 oC 72 h 24 h 48 h Bao gạc bọc ủng Các mẫu môi trường (được làm ẩm trước sử dụng) Hoặc ngày thu mẫu Giữ ẩm cách bổ sung môi o o Từ C đến 10 C trường vận chuyển thích hợp thể tích sử dụng thu lấy môi trường sử dụng để nuôi cấy vào vật chứa để tăng sinh Nhiệt độ môi trường từ oC đến 25 oC Lượng chứa manh tràng (chỉ dùng để phát hiện) Lượng chứa manh tràng dùng để định lượng Từ oC đến 10 oC Không cần thiết manh tràng nguyên vẹn (mẫu ẩm tự nhiên) nguyên vẹn (mẫu ẩm tự nhiên) lỗ huyệt, manh tràng từ oC đến 25 oC Nhiệt độ môi trường từ oC đến 25 oC Từ oC đến 10 oC Que gạc có lượng chứa trực tràng, Nhiệt độ môi trường Từ oC đến 10 oC Không cần thiết manh tràng Môi trường Amies thu mẫu tồn Nhiệt độ mơi trường từ oC đến 25 oC 24 h 72 h 48 h 48 h 24 h 72 h 48 h phân tươi Cũng tham khảo tiêu chuẩn cụ thể vi sinh vật nghiên cứu tất yêu cầu bổ sung bảo quản vận chuyển _ 25