VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - HƯỚNG DẪN VÀ CÁC YÊU CẦUCỤ THỂ VỀ THỬ NGHIỆM THÀNH THẠO THÔNG QUA SO SÁNH LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9331 : 2012 ISO/TS 22117 : 2010 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - HƯỚNG DẪN VÀ CÁC YÊU CẦU CỤ THỂ VỀ THỬ NGHIỆM THÀNH THẠO THƠNG QUA SO SÁNH LIÊN PHỊNG THỬ NGHIỆM Microbiology of food and animal feeding stuffs - Specific requirements and guidance for proficiency testing by interlaboratory comparison Lời nói đầu TCVN 9331:2012 hồn tồn tương đương với ISO/TS 22117:2010; TCVN 9331:2012 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Các yêu cầu chung tổ chức chương trình thử nghiệm thành thạo (PT) tất lĩnh vực ISO/CASCO (Ủy ban đánh giá phù hợp) đưa ISO/IEC 17043; ra, có hướng dẫn chung từ Hiệp hội hóa học ứng dụng quốc tế (IUPAC, xem Tài liệu tham khảo [9]) Tổ chức hợp tác quốc tế cơng nhận phịng thử nghiệm (ILAC, xem Tài liệu tham khảo [8]) Tuy nhiên, khuyến nghị khơng áp dụng trực tiếp cho tất trường hợp chúng cần chuyển tải theo cách riêng cho lĩnh vực phòng thử nghiệm mà chương trình PT tổ chức Vì vậy, cần có tài liệu thiết lập tiêu chí mà nhà cung cấp chương trình PT (và đơn vị cộng tác với họ) cần đáp ứng để nhìn nhận đủ lực để cung cấp chương trình PT phân tích vi sinh Tài liệu đặc biệt áp dụng yêu cầu kỹ thuật cụ thể, cần thiết để xử lý vi sinh vật sống, chẳng hạn độ đồng độ ổn định mẫu, cách diễn giải phép thử phát (có/khơng có), mà yêu cầu chưa đề cập tài liệu trước Chương trình thử nghiệm thành thạo cho phòng thử nghiệm vi sinh chủ yếu sử dụng để đánh giá kỹ phân tích, đặc biệt độ (độ chệch) vài trường hợp độ chụm, phép thử vi sinh thực phẩm phịng thử nghiệm cụ thể Ngồi ra, liệu từ chương trình PT sử dụng: a) để cung cấp thông tin cho tổ chức có trách nhiệm chấp nhận phịng thử nghiệm hoạt động kiểm tra thức cho phép kiểm soát liên tục; b) để hỗ trợ việc cơng nhận phịng thử nghiệm hệ thống quản lý chất lượng chung; c) để thông báo cho người có trách nhiệm chất lượng phòng thử nghiệm phần yếu tố đào tạo từ đánh giá bên độ Thơng tin từ chương trình PT sử dụng để: 1) nhận dạng nguồn sai lỗi có thể, đặc biệt thành phần độ chệch độ không đảm bảo đo, để cải thiện kỹ phân tích; 2) ước lượng độ không đảm bảo đo cho phương pháp định lượng (xem ISO/IEC 19036 [6]) giới hạn phát phương pháp định tính; 3) chứng minh lực nhân viên thử nghiệm thực phép thử vi sinh cụ thể; 4) đánh giá thẩm định phương pháp cụ thể thông qua nghiên cứu độ độ chụm; 5) nhận dạng sai khác phòng thử nghiệm riêng rẽ; 6) ấn định giá trị “đích” cho đối tượng phân tích vật liệu thử để thiết lập chất chuẩn Tuy nhiên, khía cạnh khơng đề cập cụ thể tiêu chuẩn Do đó, chương trình thử nghiệm thành thạo tổ chức để đáp ứng số yêu cầu chương trình thử nghiệm (tần suất, số lượng mẫu, số lần lặp lại ) cần đáp ứng yêu cầu phương pháp sử dụng hàng hóa phân tích để đạt mức kiểm soát mà bên liên quan mong muốn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - HƯỚNG DẪN VÀ CÁC YÊU CẦU CỤ THỂ VỀ THỬ NGHIỆM THÀNH THẠO THƠNG QUA SO SÁNH LIÊN PHỊNG THỬ NGHIỆM Microbiology of food and animal feeding stuffs - Specific requirements and guidance for proficiency testing by interlaboratory comparison Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa yêu cầu hướng dẫn việc tổ chức chương trình thử nghiệm thành thạo kiểm tra vi sinh vật trong: a) thực phẩm đồ uống; b) thức ăn chăn nuôi; c) môi trường sản xuất, chế biến bảo quản thực phẩm; d) công đoạn đầu dây chuyền sản xuất Tiêu chuẩn áp dụng cho kiểm tra vi sinh nước nước sử dụng trình sản xuất thực phẩm nước coi loại thực phẩm theo quy định pháp luật Tiêu chuẩn có liên quan đến tổ chức kỹ thuật thực chương trình thử nghiệm thành thạo, xử lý thống kê kết kiểm tra vi sinh Tiêu chuẩn thiết kế để sử dụng với TCVN ISO/IEC 17043 ISO 13528, liên quan đến lĩnh vực cần có chi tiết cụ thể bổ sung chương trình thử nghiệm thành thạo phân tích vi sinh nêu Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung TCVN 6910-5 (ISO 5725-5) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 5: Các phương pháp xác định độ chụm phương pháp đo tiêu chuẩn TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 8244-1 (ISO 3534-1) Thống kê học - Từ vựng ký hiệu - Phần 1: Thuật ngữ chung thống kê thuật ngữ dùng xác suất TCVN 8244-2 (ISO 3534-2) Thống kê học - Từ vựng ký hiệu - Phần 2: Thống kê ứng dụng TCVN ISO/IEC 17043:2011 Đánh giá phù hợp - Yêu cầu chung thử nghiệm thành thạo ISO 13528 Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons (Các phương pháp thống kê sử dụng thử nghiệm thành thạo thông qua so sánh liên phòng thử nghiệm) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa TCVN 8244-1 (ISO 3534-1), TCVN 8244-2 (ISO 3534-2), TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), TCVN 6910-5 (ISO 5725-5), ISO 13528, TCVN ISO/IEC 17043 với thuật ngữ định nghĩa sau: CHÚ THÍCH 1: Một số thuật ngữ sử dụng tiêu chuẩn có nghĩa khác thống kê vi sinh vật học, ví dụ tính đồng nhất, tính khơng đồng nhất, phép thử, mẫu, phân bố Nội dung tiêu chuẩn rõ có hay khơng thuật ngữ mẫu thử vi sinh tập hợp liệu sử dụng cho phân tích thống kê CHÚ THÍCH 2: Một số nhà cung cấp thử nghiệm thành thạo sử dụng thuật ngữ đánh giá chất lượng bên (EQA) để đề cập đến chương trình với nghĩa rộng cho tất lĩnh vực hoạt động phòng thử nghiệm vấn đề đào tạo cụ thể Các yêu cầu tiêu chuẩn bao trùm hoạt động EQA đáp ứng định nghĩa thử nghiệm thành thạo 3.1 Vi sinh vật đích (target organism) Vi sinh vật định phân tích mẫu thử nghiệm thành thạo 3.2 Vi sinh vật (background flora) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Hệ vi sinh vật có mẫu thử nghiệm thành thạo, đưa vào để cạnh tranh gây nhầm lẫn với vi sinh vật đích 3.3 Chủng đối chứng (reference strain) Vi sinh vật thu trực tiếp từ sưu tập chủng thức xác định đến mức chi lồi, phân loại mô tả theo đặc trưng chúng tốt có nguồn gốc từ thực phẩm nước, (TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009)[3], 3.3.2] 3.4 Tỉ lệ thu hồi (recovery percentage) Tỉ lệ từ giá trị ấn định vi sinh vật đích thu hồi đơn vị tham gia CHÚ THÍCH 1: Tỉ lệ thu hồi tính cách nhân số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) thu hồi đơn vị thể tích khối lượng với 100 CHÚ THÍCH 2: Tỉ lệ thu hồi thấp đáng kể 100 % có mặt vi sinh vật cạnh tranh ảnh hưởng mẫu mẫu thử nghiệm thành thạo Thiết kế mục tiêu chương trình 4.1 Yêu cầu chung Yêu cầu chung thiết kế chương trình PT nêu TCVN ISO/IEC 17043; tiêu chuẩn đề cập đến khía cạnh yêu cầu xem xét đặc biệt chương trình PT vi sinh vật nội dung nguyên tắc chung 4.2 Mục tiêu chương trình Mục tiêu chương trình PT cung cấp thơng tin cho phép phịng thử nghiệm tin tưởng vào độ tin cậy kết phân tích Các u cầu chi tiết kế hoạch lập thành văn cho chương trình PT đề cập TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.1.3 kế hoạch cần bao gồm việc tham chiếu quy định liên quan Ví dụ kế hoạch cho chương trình thử nghiệm vi sinh thực phẩm điển hình nêu Phụ lục A Các nghiên cứu cần thiết để lập chương trình PT rộng phải xác định rõ mục tiêu chương trình Những nội dung tối thiểu cần bao gồm yêu cầu nêu Điều Các yêu cầu việc kiểm tra đợt thử nghiệm riêng rẽ, bao gồm thử độ đồng độ ổn định, cần thiết lập thiết kế chương trình phải phù hợp với mục tiêu chương trình 4.3 u cầu phịng thử nghiệm tham gia chương trình Các yêu cầu chung trang thiết bị phòng thử nghiệm thích hợp để xử lý tất khía cạnh chương trình PT nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.3.1 yêu cầu an toàn đề cập TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.6.2.4 Đối với chương trình vi sinh vật, nhà cung cấp phải có sách lập thành văn nhằm lưu ý đơn vị tham dự mối nguy đảm bảo đưa lời khuyên thích đáng an tồn (xem Điều 7) Ví dụ: phịng thử nghiệm vi sinh thực phẩm phải có trang thiết bị thích hợp để xử lý vi sinh vật cấp độ nguy hiểm: 1, 2, [xem TCVN 6404 (ISO 7218), 3.2), cần 4.4 Lựa chọn mẫu Những yêu cầu chung viện dẫn mẫu thử kế hoạch chương trình nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.1.3 chọn lựa mẫu phản ánh dạng mẫu thường gặp TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.2.3 Những lý để lựa chọn mẫu cần cơng bố, ví dụ: để cung cấp mức độ ổn định đồng mẫu phù hợp với mục tiêu định chương trình Khi mô tả nội dung thử nghiệm phải rõ mẫu (tự nhiên nhân tạo); vi sinh vật nhiễm tự nhiên hay nhân tạo; nguồn chủng xuất xứ nhằm tuân thủ quy định vận chuyển quốc tế; phương pháp bảo quản sử dụng, ví dụ: đơng khơ, thổi khơ 4.5 Thơng tin phương pháp thử nhà cung cấp PT sử dụng Các yêu cầu chung đối phương pháp nhà cung cấp PT sử dụng nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.1.3 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Nếu chương trình đặt mục tiêu nhiều phép thử cụ thể hóa yêu cầu quy định, phép thử thông dụng để kiểm soát chất lượng mẫu thử nghiệm thành thạo (ví dụ độ đồng độ ổn định) phải thực theo phương pháp định quy định phải cơng bố điều (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.5.1) Các đơn vị tham gia phải khuyến khích sử dụng phương pháp thơng dụng phòng thử nghiệm họ tiến hành phép thử theo quy định phải đưa hướng dẫn mức độ định, ví dụ: viện dẫn phương pháp ISO, văn pháp quy ấn bình duyệt (TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.5.1) 4.6 Thiết kế thống kê Các yêu cầu chung cho thiết kế thống kê nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.4 Một mô tả thiết kế thống kê cho chương trình PT vi sinh phải phân tích thống kê sử dung chịu ảnh hưởng từ mức độ đồng vật liệu thử, mà mức độ đồng bị tác động biến ngẫu nhiên phân bố vi sinh vật Ngoại trừ số lượng nhỏ, phân bố chuẩn theo hàm log thường kỳ vọng liệu phân tích định lượng phương pháp phân tích thống kê thích hợp phải ứng dụng cho liệu [TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.3.1.4d)] Khi số lượng vi sinh vật thấp yêu cầu phép thử định lượng (ví dụ: kiểm tra mẫu nước đồ uống) áp dụng phân bố Poisson thích hợp độ biến thiên số lượng vi sinh vật đơn vị khác vật liệu thử trở nên lớn che khuất độ biến thiên kĩ thao tác Độ đồng mẫu thông thường phải mức không gây ảnh hưởng đáng kể đến sai khác nhận thấy phòng thử nghiệm Các phép thử bán định lượng phép thử phát định tính cần đến phương pháp thống kê khác để phân tích liệu phương pháp xem xét kỹ 8.3 8.4 Kế hoạch chương trình PT cần phân biệt rõ thử nghiệm thành thạo phương pháp phát thử nghiệm thành thạo định lượng vi sinh vật đích Yêu cầu kĩ thuật hướng dẫn thiết kế mẫu thành phần mẫu 5.1 Mật độ vi sinh vật đích Vi sinh vật đích phải cung cấp mức phù hợp thấy phương pháp kiểm tra thích hợp với mục đích sử dụng để phản ánh mức nhiễm thường tìm thấy dạng mẫu thử (TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.2.3) Khi vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật đích mức nhiễm cần tính đến phản ánh mức độ gây nguy hiểm cho sức khỏe người, giới hạn quy định tiêu chuẩn vi sinh, cần CHÚ THÍCH: Mức nhiễm gây hại cho sức khỏe người ln ln biết xác phụ thuộc vào độ mẫn cảm cá nhân Mục đích việc kiểm tra vi sinh gây bệnh để ngăn ngừa bệnh tật để phát yếu tố gây bệnh mức thấp trước chúng tăng trưởng lên mức cao Đối với phương pháp định lượng mật độ vi sinh vật đích phải phù hợp với nồng độ thường tìm thấy quy định nhà nước áp dụng cho mẫu sử dụng Mật độ vi sinh vật đích đơi nên gần với mức giới hạn định lượng phương pháp thông dụng đề thử thách kĩ đơn vị tham gia so với phạm vi đo phương pháp Tuy nhiên, khơng nên gửi mẫu có mật độ vi sinh mức thấp sử dụng độ pha lỗng thơng thường giá trị trung bình dự kiến số lượng vi sinh mẫu 10 khuẩn lạc đĩa cấy Đối với phương pháp định tính (phát hiện), vi sinh vật đích nhìn chung u cầu mức thấp vừa đủ cho thử thách có phương pháp luận đóng góp liệu cho hoạt động thẩm định nhằm thiết lập thẩm tra giới hạn phát phòng thử nghiệm tham gia 5.2 Nguồn gốc, đặc tính khả truy xuất chủng vi sinh vật Các đặc tính vi sinh vật đích phải thiết lập trước sử dụng để đánh giá kỹ cách đáng tin cậy, đặc biệt chương trình cho phép đơn vị tham gia sử dụng phương pháp luận khác Cả chủng điển hình khơng điển hình cần xem xét đưa vào chương trình để thử thách kỹ phân tích phịng thử nghiệm Những chủng đối chứng bảo tàng chủng quốc tế công nhận nên sử dụng trường hợp chúng phù hợp cho mục đích chương trình; nhiên, chủng phòng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn thử nghiệm phân lập chủng “hoang dại” phân lập từ mẫu sử dụng chương trình PT hữu ích để làm cho mẫu gần với thực trạng Khi chủng sử dụng, chúng cần mô tả đủ đặc điểm theo phương pháp chuẩn thích hợp để đảm bảo phản ứng khơng điển hình đơn vị tổ chức PT nhận biết trước sử dụng Trong tất trường hợp, vi sinh vật sử dụng mẫu chương trình PT cần có khả truy xuất đến bảo tàng chủng tương ứng nhà tổ chức chương trình xác nhận liệu mơ tả đặc điểm Trong vài trường hợp, sử dụng chủng đối chứng mẫu chuẩn từ nguồn chuẩn quốc tế biết chủng phòng thử nghiệm ni cấy, ví dụ chương trình PT vi sinh vật nuôi cấy norovirus người Trong trường hợp này, vật phẩm y tế dùng để gây nhiễm nhân tạo lên mẫu kiểm tra, cách nhúng, phun, thơng qua tích lũy sinh học nhuyễn thể hai mảnh vỏ Phương pháp gây nhiễm nhân tạo phải gần với đường lây nhiễm tự nhiên tốt Cần thận trọng thao tác với mẫu bệnh phẩm người, phân mẫu dịch nôn mẫu phải sàng lọc tác nhân gây bệnh phụ trước sử dụng Các vi rút đích cần mơ tả đầy đủ mức độ dòng kỹ thuật PCR cổ điển kèm theo giải trình tự gen 5.3 Hệ vi sinh vật cạnh tranh Tổng hệ vi sinh vật mẫu thử, nhiễm tự nhiên nhân tạo, phải lựa chọn để đánh giá lực đơn vị tham gia việc phát và/hoặc định lượng vi sinh vật đích diện hệ vi sinh vật khơng phải đích (điển hình cho loại mẫu thử) vi sinh vật giả đích, mà thiếu phép thử khẳng định thích hợp dẫn đến kết dương tính giả Bất kỳ chủng sử dụng để tạo hệ vị sinh phải đáp ứng yêu cầu 5.2 đặc tính khả truy xuất Trong mẫu nhiễm tự nhiên, phải xác định ảnh hưởng hệ vi sinh mẫu lên vi sinh vật đích 5.4 Lựa chọn mẫu ảnh hưởng Tất mẫu phải đánh giá trước sử dụng để kiểm tra tác động đến vi sinh vật đích hệ vi sinh nền, ví dụ mẫu làm giảm độ thu hồi vi sinh đích đưa vào gây nhiễm Các đơn vị tham gia phải cảnh báo chất mẫu thực phẩm biết mẫu có ảnh hưởng bất lợi đến độ thu hồi vi sinh vật (ví dụ: mẫu bắt giữ lại tế bào, chẳng hạn chất béo) có chất diệt khuẩn hay có chất tính chất kìm hãm vi khuẩn Thơng tin gửi đến đơn vị tham gia phải bao gồm quy trình chuẩn bị thích hợp thẩm định Những mẫu sử dụng cho chương trình PT vi sinh thông thường (nhưng không cần thiết) tiệt trùng trước dùng Khi gửi mẫu tự nhiên không tiệt trùng, nhà tổ chức phải xác định ảnh hưởng hệ vi sinh mẫu Xác nhận giá trị mẫu nhà cung cấp 6.1 Yêu cầu chung Những yêu cầu chung kiểm tra, xác nhận giá trị mẫu nêu TCVN ISO/IEC 17043 ISO 13528 (xem thêm Tài liệu tham khảo [9]); phần mở rộng yêu cầu cụ thể trở ngại việc thử độ ổn định độ đồng vật liệu thử có chứa vi sinh vật sống 6.2 Thử độ đồng - Xem xét tổng quan (Xem thêm TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.3 B.5) Các phép thử độ thành thạo liên quan đến việc chuẩn bị khối lớn vật liệu thử, sau chia thành phần nhỏ gần để gửi đến đơn vị tham gia Cách khác, phần mẫu nhỏ ni cấy riêng biệt gửi Dù sử dụng phương pháp chuẩn bị vật liệu thử phải đánh giá độ đồng nhất, thường trước vào thời điểm thử loại vật liệu tươi, không bền vững Phép thử độ đồng cần thực đổi với mẻ mẫu, dựa nguyên tắc thống kê thích hợp (TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.3.2 B.5) Các phép thử nêu ISO 13528 Phụ lục B Cũng cần kiểm tra độ đồng vật liệu lưu khoảng thời gian dài để đảm bảo đáp ứng chuẩn mực định trước sử dụng Số mẫu kiểm tra từ mẻ chuẩn bị cần phải đủ để thu thông tin thực tế độ đồng mẻ mẫu đó; số lượng đề xuất 10 mẫu (được thử kép, cần) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Một vật liệu thử đồng sử dụng cho đợt thử nghiệm thành thạo (TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.3.1, Chú thích 3), miễn nguyên tắc thống kê thích hợp áp dụng để tính đến phương sai lớn mẫu (xem ISO 13528) Một phương án thống kê vật liệu không đồng bao gồm phép phân tích lặp lại vài mẫu thử [xem TCVN 6910-5 (ISO 5725-5)] nên sử dụng để giảm thiểu ảnh hưởng từ mẫu thiếu đồng đánh giá kỹ phân tích đơn vị tham gia 6.3.Thử độ đồng nhát mẫu định lượng Các yêu cầu chung quy trình kiểm tra độ đồng mẫu thử thành thạo định lượng nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.3, B.5 ISO 13528 Các vật liệu cho thấy khác đơn vị mẫu đủ lớn để gây ảnh hưởng đáng kể lên việc đánh giá kĩ phân tích phịng thử nghiệm khơng nên sử dụng nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trừ có yêu cầu phương pháp phân tích liệu đặc biệt áp dụng, ví dụ số lượng thấp vi sinh vật nước uống dạng mẫu khác Chuẩn mực “đủ đồng nhất” xác định yêu cầu so sánh liên phòng (xem ISO 13528 Phụ lục B) Tuy nhiên, nhìn chung vật liệu mà có độ lệch chuẩn đơn vị mẫu (trên thang chuyển thích hợp) ≤ 0,3 σp, σp độ lệch chuẩn đích sử dụng để đánh giá kĩ phân tích phịng thử nghiệm, coi đủ đồng (xem ISO 13528) Mọi phép thử khác độ đồng cần đáp ứng tiêu chí (theo Tài liệu tham khảo [9]): a) xác suất loại bỏ vật liệu thử đủ đồng phải ≤ %; b) vật liệu thử có độ biến thiên đơn vị mẫu 1,5 σp có xác suất bị loại bỏ lớn 80 %, σp mức sai lệch chấp nhận phòng thử nghiệm (được biểu thị theo độ lệch chuẩn mục tiêu) Xác suất 80 % loại bỏ vật liệu thử độ biến thiên đơn vị mẫu 1,5 σp dựa nghiên cứu mơ phân tích kép 10 đơn vị mẫu thử sử dụng phương pháp có độ lệch chuẩn phân tích 0,5 σp (nghĩa 0,125 đơn vị log) giá trị tới hạn T2 (xem Phụ lục B) đáp ứng tiêu chí a) nêu Điều thể kết đạt với nỗ lực phân tích hợp lý Các phép thử độ đồng dựa sở ước lượng phương sai đơn vị mẫu phương sai phân tích (độ lặp lại) thu điều kiện lặp lại Các phương pháp thử thích hợp độ biến thiên nêu Phụ lục B Phương sai phân tích (độ lặp lại) cần ước tính từ phân tích kép huyền phù gốc nhận từ phần mẫu thử (Tài liệu tham khảo [15][16]) Phương sai phân tích tính từ số lượng khuẩn lạc đếm độ chụm vật liệu thử sử dụng (Tài liệu tham khảo [10]) Trong vi sinh học, phương sai đơn vị mẫu phải ước tính điều kiện lặp lại (trong lần phân tích) Nếu điều khơng thể tiến hành phương sai đơn vị mẫu bao gồm độ tái lập nội phòng thử nghiệm dẫn đến việc loại bỏ sai vật liệu phù hợp Khi số Iượng khuẩn lạc đếm đủ lớn (nhiều 35 đến 40 khuẩn lạc đĩa) độ lệch chuẩn phân tích, σan, thường thỏa mãn: σp độ lệch chuẩn đích, nên sử dụng phép thử độ “đồng đủ" nêu Tài liệu tham khảo [11] (xem Phụ lục B) Nếu số khuẩn lạc thấp (nhỏ 35 đến 40 khuẩn lạc đĩa) nên dùng phép thử T1 - T2 (xem Phụ lục B) Khi đơn vị mẫu thử kép cung cấp cho phịng thử nghiệm tham gia chương trình khả biến thiên đơn vị mẫu nhận phòng thử nghiệm cần nhà cung cấp kiểm tra để đánh giá độ đồng vật liệu thử Cho dù khả biến thiên bao gồm độ tái lập nội bơ phịng thử nghiệm số lượng phòng thử nghiệm tham gia lớn làm tăng nguồn thống kê phép phân tích thị tốt cho vòng thử nghiệm thành thạo Khi số khuẩn lạc đếm thấp (nhỏ 20), phương sai (độ lặp lai) phân tích cao Trong trường hợp này, nhà cung cấp nên khuyến nghị phòng thử nghiệm tham gia chương trình lặp lai phép đếm phần mẫu thử để thỏa mãn điều kiện (xem ISO 13528): LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn đó: σr độ lệch chuẩn lặp lại; σp độ lệch chuẩn đích; n số phép thử lặp Nếu điều kiện khơng thỏa mãn kĩ phân tích phịng thử nghiệm cần đánh giá thận trọng Khi mẫu PT chứa số lượng khuẩn lạc thấp (nhỏ 20) phải xác định sai khác đơn vị mẫu (nghĩa mẫu lặp lại) để chứng minh khơng vượt q biến ngẫu nhiên (Poisson) nhằm đưa đánh giá có ý nghĩa Chỉ số phép thử độ phân bố n mẫu (trong n tối thiểu 10) không nên vượt giá trị với mức xác suất 0,05 6.4 Thử độ đồng mẫu phương pháp định tính Các nguyên tắc tương tự áp dụng để kiểm tra độ đồng mẫu dành cho phương pháp định tính (có mặt/khơng có), yêu cầu có xem xét cụ thể mức gây nhiễm vào mẫu thấp (xem 8.4) Độ đồng mẫu định tính kiểm tra cách đếm mẫu thêm chủng Cũng xác định mức nhiễm kỹ thuật đếm số có xác suất lớn (MPN) Nếu phương pháp đếm thực phép thử độ đồng nêu chi tiết 6.3 sử dụng, tùy thuộc vào cách mẫu gây nhiễm nhân tạo cách mà mẫu thêm chủng vi sinh định lượng 6.5 Thử độ ổn định mẫu nhà cung cấp 6.5.1 Yêu cầu chung Các mẫu dùng cho thử nghiệm liên phịng phải bền vững, suốt giai đoạn từ chuẩn bị (bởi nhà cung cấp) ngày phân tích đến cuối khoảng thời gian cho phép lưu giữ (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.4.3) Nếu dạng mẫu với loại chủng thử ln ln sử dụng cần tiến hành phép thẩm định (ví dụ: kiểm tra sau chuẩn bị mẫu vào ngày phân tích) mẫu đủ Nhà cung cấp cần kiểm tra kết thu từ phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra lại độ ổn định vật liệu thử suốt thời gian cho phép nghiên cứu 6.5.2 Độ ổn định điều kiện bảo quản Đối với mẫu ổn định luôn lưu nhiệt độ thấp (ví dụ: -70 °C, -20 °C, +5 °C) độ ổn định phải xác định cách kiểm tra định kì mật độ vi sinh vật độ đồng mẻ sau khoảng thời gian định kì trình lưu mẫu Khoảng thời gian tối thiểu để thử độ ổn định nên thời gian giai đoạn chuẩn bị mẫu ngày thời điểm phân tích cụ thể Tần suất kiểm tra tùy thuộc vào thông tin sẵn có mẻ mẫu tổng thời gian cần thiết để có thơng tin độ ổn định Ví dụ: tổng thời gian lưu hai tuần cần phải kiểm tra hai ngày lần, yêu cầu bảo quản năm kiểm tra hàng tháng đủ Đối với mẻ mẫu lớn tối thiểu mẫu thử lần thấy độ ổn định thực tế toàn mẻ (ISO 13528:2005, Phụ lục B) Dù áp dụng tần suất kiểm tra tần suất phải đơn vị tổ chức chương trình chứng minh thẩm định chấp nhận 6.5.3 Độ ổn định điều kiện vận chuyển Ngồi thơng tin độ ổn định điều kiện bảo quản thu thập nghiên cứu thẩm định để lập chương trình PT mới, điều quan trọng không kiểm tra ảnh hưởng “các điều kiện bất thường” lên mẫu, ví dụ thời gian vận chuyển dài nhiệt độ cao (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.6.3.2) Phép thử độ ổn định nhiệt độ khác để phản ánh điều kiện vận chuyển “tồi tệ nhất” chậm trễ tối đa dự kiến cần thực từ giai đoạn đầu để kiểm tra tác động điều kiện xấu lên mẫu thử Ví dụ: mẫu mẻ bảo quản nhiệt độ quy định (ví dụ -20 °C) bảo quản +5 °C, +15 °C, +25 °C Mỗi ngày có mẫu giữ nhiệt độ phân tích tổng thời gian hai tuần LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Thiết kế thực nghiệm độ ổn định thay đổi cần thích hợp để nhận thơng tin ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản khác lên mẫu thử thiết lập giới hạn nhiệt độ phịng thử nghiệm tiếp nhận mẫu Thơng tin thu được sử dụng để lựa chọn điều kiện phân phối tối ưu cho mẫu chương trình PT, ví dụ: có cần làm mát mẫu suốt trình vận chuyển cách sử dụng đá khô túi nước đá hay vận chuyển điều kiện bình thường chấp nhận Khi phân phối mẫu mẫn cảm với nhiệt độ, u cầu phải có hệ thống làm lạnh kiểm sốt với chuẩn mực chấp nhận mẫu nghiêm ngặt chương trình hỗ trợ thử nghiệm mang tính pháp lý E coli nhuyễn thể hai mảnh vỏ, nên đưa cảm biến nhiệt vào hộp mẫu để ghi lại nhiệt độ mẫu trình vận chuyển Việc kiểm tra liệu nhiệt độ cho phép nhà cung cấp chương trình PT giải thích kết bất thường đơn vị tham gia Quản lý mẫu 7.1 Yêu cầu chung Các yêu chung quản lý mẫu thử nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.6.1 4.6.2, thông tin bổ sung liên quan đến mẫu thử vi sinh nêu phần 7.2 Hướng dẫn cho đơn vị tham gia Đối với đợt nghiên cứu, phòng thử nghiệm tham gia phải nhận hướng dẫn rõ ràng bao gồm: a) điều kiện bảo quản cho tất dạng mẫu, đặc biệt thông tin nhiệt độ bảo quản cần ghi rõ bên ngồi bao bì vận chuyển mẫu; b) nhiệt độ tối đa mẫu tiếp nhận phòng thử nghiệm, cần; c) hướng dẫn cách xử lý mẫu - hoàn nguyên, pha loãng yêu cầu xử lý khác, điều cần mô tả rõ ràng mẫu dạng mẫu thử; d) bảng liệu an tồn thích hợp cần đưa vào đơn vị mẫu gửi (ví dụ cụ thể nêu Phụ lục D); e) hướng dẫn bổ sung khác như: 1) thời hạn muộn phải tiến hành phân tích thời hạn gửi kết cho nhà tổ chức; 2) phương pháp phân tích (mơ tả lựa chọn đơn vị tham gia, có yêu cầu); 3) cách thức báo cáo kết cho nhà tổ chức, đặc biệt đơn vị đo; 4) nhà tổ chức yêu cầu chi tiết vật liệu, phương pháp, điều kiện nuôi cấy , biểu mẫu báo cáo, có, cần đưa hướng dẫn để điền vào biểu mẫu Đánh giá kĩ thao tác 8.1 Yêu cầu chung Bất có thể, nguyên tắc thống kê sử dụng để đánh giá lực chương trình PT nên dựa vào nội dung nêu tiêu chuẩn TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.7 ISO 13528 (xem thêm thông tin Tài liệu tham khảo [9]) cho dù chương trình PT vi sinh chấp nhận quy trình khác với quy trình thường sử dụng lĩnh vực khác quy trình thích hợp với chương trình vi sinh cụ thể 8.2 Xem xét sơ Thử nghiệm thành thạo liên quan đến phân phối định kỳ vật liệu thử đến phòng thử nghiệm tham gia để họ kiểm tra mẫu thử thông số cụ thể (trong hầu hết trường hợp vi sinh vật) Kết kiểm tra sau so sánh với kết phòng thử nghiệm khác Do vậy, thử nghiệm thành thạo cung cấp phương thức thử độc lập so sánh kĩ phòng thử nghiệm Việc liên tục đạt kết tốt qua vòng thử nghiệm thành thạo cho thấy phòng thử nghiệm đảm bảo phương pháp phân tích, đào tạo, trang thiết bị, thuốc thử, quy trình kiểm sốt chất lượng, diễn giải kết kỹ thuật báo cáo Tuy nhiên, kết không tốt cho thấy kĩ phân tích phịng thử nghiệm yếu so với giá trị ấn định điều dẫn đến số câu hỏi như: tất mẫu thử có giống khơng; phịng thử nghiệm khác tiến hành nào, phương pháp có kết chệch khơng kết có diễn giải khơng Do đó, nhà tổ chức chương trình nên LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn sử dụng hệ thống đánh giá kĩ phân tích thích hợp để giúp bên tham gia trả lời câu hỏi Có nhiều cách khác để diễn giải liệu từ chương trình thử nghiệm thành thạo phương pháp phải khách quan Phần lớn đơn vị tham gia chương trình PT vi sinh khơng quen với phép thống kê phải tin quy trình sử dụng nhà cung cấp chương trình PT Những xem xét nguyên tắc thống kê áp dụng phải đề cập: a) giá trị pháp lý; b) thơng tin giải thích cho đơn vị tham gia; c) lý lựa chọn; d) tính chắn Các đơn vị tham gia phải cung cấp thông tin rõ ràng không thiên lệch nhằm cho phép họ tự đánh giá diễn giải kết để tận dụng tối đa lợi ích từ việc tham gia chương trình 8.3 Phương pháp định lượng 8.3.1 Yêu cầu chung Thiết kế thống kê cho chương trình PT phương pháp định lượng vi sinh vật bị tác động mức độ đồng vật liệu thử, chịu tác động độ biến thiên ngẫu nhiên phân bố vi sinh vật mẫu Ngoài ra, dường có khác biệt đáng kể phịng thử nghiệm tham gia độ chụm yêu cầu mong đợi phép thử Việc lựa chọn phương pháp thống kê phải tính đến yếu tố liệt kê 8.1 8.2, với xem xét khác số lượng phòng thử nghiệm tham gia chương trình cụ thể Những tham số đưa đến định phép thống kê dùng cho phân tích kết cần cơng bố Ví dụ: chương trình đặc biệt có 30 đơn vị tham dự; kết từ 30 đơn vị tham dự phân tích theo phương thức khác với chương trình lớn hơn, ví dụ có 100 đơn vị tham dự Phương pháp chọn phân tích thống kê phải thích hợp khơng với số lượng phòng thử nghiệm tham gia phép thử mà cịn phải thích hợp với phương pháp thử sử dụng Ví dụ: cách phân tích kết từ phương pháp đếm khuẩn lạc khác so với phân tích kết từ phương pháp MPN Điều độ biến thiên gắn với phương pháp MPN có xu hướng lớn so với phương pháp đếm khuẩn lạc Thực tế, tham số thống kê khác cần đến để đánh giá kĩ phân tích phịng thử nghiệm tham gia phép thử khác chương trình thử nghiệm (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, 4.5.2) Điều phải cơng bố tài liệu thiết kế chương trình thử nghiệm thành thạo tiêu chí vi sinh chấp nhận nói chung nên viện dẫn kế hoạch chương trình PT Những phân tích thống kê thích hợp xác định điểm phòng thử nghiệm tham gia đề cập TCVN ISO/IEC 17043:2011, Phụ lục B 8.3.2 Sự phân bố liệu Khi phép thử định lượng lặp lại vài lần điều kiện lặp lại phân bố tần suất kết kỳ vọng tạo thành đường cong hình chng, gọi phân bố chuẩn Các số đếm vi sinh vật thường theo phân bố chuẩn hàm log liệu (cần) chuyển sang giá trị dạng logarit số 10 để tạo nên đường phân bố chuẩn Tuy nhiên, số lượng nhỏ vi sinh vật, sử dụng số đếm thực áp dụng cách chuyển sang dạng bậc hai LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn CHÚ DẪN: f tần số µ giá trị trung bình σ độ lệch chuẩn Hình - Đồ thị phân bố chuẩn Cho dù tiến hành thử mẫu, kết giống có số sai khác nhỏ, độc lập dự kiến xảy thao tác khác liên quan đến trình thực phép thử Trong thử nghiệm thành thạo, thông thường phép thử không thực điều kiện lặp lại, chí điều kiện tái lập Các phép thử tiến hành người phân tích khác nhau, phịng thử nghiệm khác vào thời điểm khác nhau, dùng thiết bị, môi trường, thuốc thử phương pháp phân tích khác kết khác nhiều hơn, mơ tả điều kiện “siêu tái lập” “quá tái lập", thông thường khái niệm độ tái lập sử dụng phạm vi phương pháp đơn lẻ Phân bố chuẩn (log) kết thường quan sát có khác biệt điều kiện thử nghiệm trên, cần sử dụng nguyên tắc thống kê thích hợp phân bố chuẩn (log) để phân tích liệu, miễn phân bố nhìn chung đối xứng đồng dạng Nếu phân bố liệu không dạng chuẩn (log) cần xem xét ngun nhân diễn giải liệu cho phù hợp với việc sử dụng phép thử thích hợp khác 8.3.3 Xác định giá trị ấn định Mục tiêu thử nghiệm thành thạo đánh giá mức độ thành thạo bên tham gia trình đạt đến kết “đúng” Tuy nhiên, nhiều chương trình thử nghiệm thành thạo, khơng thể biết kết “đúng” nhiều người phân tích kiểm tra vật liệu thử đưa kết khác nhiều Thay vào đó, cần ước tính kết “đúng” hay “thực” điều viện dẫn đến “giá trị ấn định” Giá trị ấn định xác định số phương pháp nêu TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.2 ISO 13528 Phương pháp phổ biến chương trình thử nghiệm thành thạo vi sinh đồng thuận giá trị từ phòng thử nghiệm tham gia Giá trị ấn định xác định từ giá trị trung bình thơ trung vị kết từ tất bên tham gia Việc sử dụng phương pháp thô nhằm giảm thiểu ảnh hưởng giá trị bất thường, để không cần loại kết khỏi liệu khó nhận dạng giá trị bất thường “thực sự” Giá trị ấn định có độ khơng đảm bảo cao so với phương pháp khác, điều tính đến đánh giá kĩ phòng thử nghiệm Giá trị ấn định cho hợp lý kết tất bên tham gia đóng góp vào việc tính tốn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Nếu trung vị tổng thể thấp tạo thành, giá trị ấn định thiết lập từ giá trị đồng thuận (ví dụ: có nhiều đơn vị tham gia khó phân lập khó nhận dạng vi sinh vật cụ thể đó), nhà tổ chức chương trình cần đưa nhận xét hợp lý để kỹ phòng thử nghiệm khơng có kết giả đánh giá xác 8.3.4 Độ không đảm bảo đo giá trị ấn định Giá trị ấn định thể giá trị ước tính tốt giá trị “thực” Có độ không đảm bảo đo chuẩn biểu thị mức tin cậy giá trị ước tính Nếu độ khơng đảm bảo đo chuẩn giá trị ấn định lớn so với độ lệch chuẩn đợt thử thành thạo sau vài phịng thử nghiệm tham gia nhận đánh giá cảnh báo hành động, khơng phải kỹ phân tích họ mà độ không đảm bảo đo lớn giá trị ấn định Vì vậy, cần thiết lập tiêu chí chấp nhận giá trị ấn định theo độ khơng đảm bảo đo Một vài phương pháp để ước tính độ khơng đảm bảo đo xác định khả chấp nhận có sẵn mô tả ISO 13528 8.3.5 Các phương pháp đánh giá kỹ Nhà tổ chức chương trình PT phải xác định giá trị ấn định đánh giá kết từ phòng thử nghiệm lệch so giá trị ấn định với kết từ tất phòng thử nghiệm tham gia khác Như vậy, kỹ phân tích đơn vị tham gia xem xét không dựa kết “đúng" mà dựa ước tính thống kê kết “đúng” từ tất số liệu báo cáo thu Lượng liệu lớn ước tính thống kê dường xác Các phương pháp chung đánh giá kỹ tính điểm nêu chi tiết TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.3 ISO 13528 8.3.6 Sử dụng số z 8.3.6.1 Yêu cầu chung Một phương pháp thông dụng chấp nhận rộng rãi thử nghiệm thành thạo hệ thống số z (z-score), hệ thống tương đối dễ tính tốn diễn giải (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.3) Chỉ số z cho biết chênh lệch giá trị so với giá trị trung bình lần độ lệch chuẩn, ví dụ số z thể chênh lệch giá trị so với giá trị trung bình 2σ, σ độ lệch chuẩn Như mơ tả Hình 1, liệu với phân bố chuẩn có 95 % giá trị nằm 2σ kể từ giá trị trung bình 99,7 % giá trị nằm phạm vi 3σ Do đó, kết với số z lớn nên xem xét nguyên nhân có % giá trị đo dự kiến sai lệch với giá trị ấn định Các kết với số z lớn coi không thỏa mãn có 0,3 % giá trị đo dự kiến khác với giá trị ấn định (xem TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.4) 8.3.6.2 Độ lệch chuẩn đích cho tính tốn số z Việc tính số z sử dụng giá trị đích độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn đích định rõ khoảng biến thiên chấp nhận phòng thử nghiệm phép thử cụ thể Nên sử dụng độ lệch chuẩn đích cho tất đợt thử chương trình thử nghiệm thành thạo để so sánh số z đợt với đợt khác Một số phương pháp thiết lập độ lệch chuẩn đích nêu chi tiết Tài liệu tham khảo [9], TCVN ISO/IEC 17043:2011, B.3 ISO 13528 8.3.6.3 Các kết đa giá trị hệ thống số z Chênh lệch kết bên tham gia xuất phát từ khác biệt phòng thử nghiệm khác biệt nội phòng thử nghiệm Độ biến thiên nội phòng thử nghiệm phương sai phòng thử nghiệm sai khác lần đo thực phòng thử nghiệm, mẫu thử nét đặc trưng phép kiểm tra vi sinh vật Độ biến thiên nội phòng thử nghiệm đo phương sai độ lặp lại Khi phòng thử nghiệm tham gia báo cáo kết nhiều giá trị cho vật liệu thử đơn lẻ điều gây độ chệch tiềm tàng đến phần liệu cịn lại từ đơn vị khác Ví dụ: 10 phân tích viên phịng thử nghiệm phân tích mẫu mà mẫu pha lỗng khơng xác từ đầu 10 kết nói sai Số kết sai trở thành tập hệ thống liệu thu làm chệch tất kết khác Để tránh độ chệch nên đưa kết báo cáo từ phịng thử nghiệm vào phân tích tổng thể phân bố liệu Khi phòng thử nghiệm tham gia chương trình thu nhiều kết từ mẫu PT đơn lẻ kết phải báo cáo riêng rẽ giá trị trung bình Khi nhà tổ chức LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn chương trình cho phép báo cáo kết cho phòng thử nghiệm phải chọn kết riêng lẻ để báo cáo trước tiến hành phép thử biết kết 8.3.7 Các phương pháp đánh giá kỹ khác 8.3.7.1 Yêu cầu chung Mặc dù số z sử dụng phổ biến đánh giá kết chương trình PT cho phương pháp đếm, phương pháp đánh giá khác thích hợp cho chương trình đặc biệt Ví dụ: với mẫu có số lượng vi sinh thấp (như nước uống) đánh giá thống kê dựa mơ hình dự đốn biến ngẫu nhiên Khi số đếm cận biên “cao” “thấp” xác định rõ cách sử dụng công thức Poisson Các kết cao thấp xuất ngẫu nhiên phòng thử nghiệm nào, việc có nhiều kết cận biên cho thấy kỹ phân tích Các ưu điểm nhược điểm mơ hình so với cách tiếp cận phân vị để đánh giá thống kê đề cập Tài liệu tham khảo [17] Với chương trình PT dự kiến có số đếm cao quy tắc 0,5 log 10 cách tiếp cận phân vị sử dụng, cần sử dụng phương pháp độ lệch tuyệt đối trung vị cho chương trình có phịng thử nghiệm tham gia Các nội dung tóm lược 8.3.7.2 đến 8.3.7.4 8.3.7.2 Sử dụng quy tắc 0,5 log10 Một hệ thống tính điểm dựa vào quy tắc 0,5 log 10 sử dụng cho phép đếm khuẩn lạc (theo Tài liệu tham khảo [13]) Về bản, khoảng tin cậy 95 % xung quanh giá trị trung bình số đếm nhìn chung khơng lớn ± 0,5 log10 cfu Các thủ tục kiểm soát chất lượng nội phòng thử nghiệm vi sinh thường yêu cầu phép đếm lặp để thấy phù hợp với mức không vượt 0,5 log10 đơn vị để chứng minh việc kiểm sốt tốt q trình Hệ thống áp dụng cho kết bên tham gia, theo tất kết nằm phạm vi ± 0,5 log 10 đơn vị từ giá trị trung vị bên tham gia xem chấp nhận tính điểm tối đa Quy tắc cho phép điểm bên tham gia cải thiện theo thời gian xét tổng thể chất lượng phép đếm họ cải tiến Quy tắc ± 0,5 log10 dựa chuẩn mực vi sinh vật có giá trị thống kê số đếm dự kiến đĩa 10 khuẩn lạc vi sinh vật phân bố ngẫu nhiên 95 % kết phải nằm khoảng từ đến 17 khuẩn lạc Trên thang logarit thập phân với số đếm trung vị kỳ vọng giới hạn 0,47 giới hạn 1,23, nghĩa giới hạn nằm 0,5 log 10 đơn vị Do vậy, kết nằm ± 0,5 log 10 đơn vị giá trị kỳ vọng cần xem chấp nhận 8.3.7.3 Sử dụng phân vị Phân vị dùng để nhận dạng giá trị bất thường phép thử định lượng có nhiều 50 đơn vị tham gia tiến hành định lượng cách đếm khuẩn lạc Cách đòi hỏi tính tốn phân vị thứ 5, thứ 10, thứ 90 thứ 95 phân bố kết bên tham gia (lần lượt C5, C10, C90 C95) C5 C10 cần làm tròn xuống đến giá trị 0,05 log 10 đơn vị gần (ví dụ: làm trịn 2,23 thành 2,20), C90 C95 cần làm trịn lên (ví dụ: làm trịn 3,36 thành 3,40) Sau ví dụ cách tính điểm (như trường hợp đếm khuẩn lạc hiếu khí): - Các kết nằm C10 C90 (khoảng chấp nhận): Điểm = - Các kết nằm C5 C10 C90 C95: Điểm = - Các kết nằm C5 C95 Điểm = Việc áp dụng quy tắc 0,5 log10 mở rộng khoảng chấp nhận nâng hạng điểm tính cho vài kết C5, C10, C90 C95 Phương pháp phân vị ổn định không phụ thuộc vào phân bố thực số đếm logarit thập phân với phân bố chuẩn Nó cho phép diễn đạt rõ ràng kết đánh giá kỹ phân tích Nếu số lượng phịng thử nghiệm tham gia chương trình PT 50 số đơn vị tham gia báo cáo kết định lượng thông số cụ thể 50 cần sử dụng giá trị độ lệch tuyệt đối trung vị (MAD) (xem 8.3.7.4) thay cho phân vị 8.3.7.4 Sử dụng độ lệch tuyệt đối trung vị (MAD) từ giá trị trung vị Phương pháp MAD sử dụng để xác định số đếm bất thường có 50 đơn vị tham dự thực phép thử định lượng Khơng nên sử dụng phương pháp phân vị số kết thu nhỏ 50 không cung cấp đủ liệu để tính tốn giá trị có ý nghĩa cho C5, C10, C90, C95 Các giá trị MAD cung cấp phương pháp thơ để tính khoảng chấp nhận đánh giá kết bên tham gia tính điểm Phương pháp phân tích yêu cầu tính độ chênh lệch trung vị từ trung vị LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn kết quả, sau nhân với 1,4826 để thu giá trị ước tính thơ độ lệch chuẩn (giá trị MAD), σMAD Ví dụ cách tính điểm sử dụng giá trị MAD cho đây: - Các kết vùng giá trị trung vị bên tham gia ± 2σMAD: Điểm = - Các kết nằm ± 2σMAD ± 2,58σMAD: Điểm = - Các kết nằm ± 2,58σMAD: Điểm = Khi sử dụng phân vị giới hạn cần làm trịn xuống đến giá trị 0,05 log 10 gần giới hạng cần làm tròn lên giá trị 0,05 log10 gần Lưu ý trừ quy tắc 0,5 log10 áp dụng, nên có khoảng % phịng thử nghiệm nằm vùng ± 2σMAD % nằm vùng ± 2,58σMAD (giả định phân bố chuẩn số đếm logarit thập phân khơng có giá trị bất thường) Phương pháp MAD nên sử dụng cho chương trình PT có 100 đơn vị tham gia 8.3.7.5 Các xem xét đặc biệt phương pháp đếm số có xác suất lớn Phương pháp thử dùng để xác định giá trị MPN có độ biến thiên nội lớn phương pháp đếm khuẩn lạc, thường xem phương pháp bán định lượng Tuy nhiên, đơi cần phát ước tính mật độ vi sinh vật dự kiến thấp, đặc biệt vi sinh vật bị ức chế (ví dụ: ảnh hưởng q trình xử lý làm đông lạnh) Phương pháp MPN quy định văn pháp quy yêu cầu kiểm tra vi sinh vật vài sản phẩm sản phẩm từ sữa động vật thân mềm hai mảnh vỏ loại thủy sản có vỏ khác Bất kỳ phương pháp đánh giá kết xác định giá trị MPN bên tham gia cần tính đến độ biến thiên nội phương pháp MPN giả định mẫu thử trộn kỹ trước phân tích Đối với phương pháp nồng độ x ống, độ lệch chuẩn kết log 10 MPN xấp xỉ 0,24, miễn kết không cho thấy tổ hợp ống “ngoại lai”, ví dụ: tổ hợp ống 3, 0, đến 5, [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Đối với phương pháp nồng độ x ống độ lệch chuẩn kết log 10 MPN xấp xỉ 0,32, miễn kết không cho thấy tổ hợp ống “ngoại lai”, ví dụ tổ hợp ống 2, 0, 3, 3, Điều có nghĩa là: trường hợp hoàn hảo, độ biến thiên phịng thử nghiệm khơng q lớn 95 % kết cần nằm khoảng ± 2σ 99 % nằm khoảng ± 3σ, σ độ lệch chuẩn Tuy nhiên, thực tế có biến thiên định phịng thử nghiệm Việc phân tích số tập hợp liệu cho thấy thay đổi làm tăng phương sai khoảng 2,5 lần (và làm tăng độ lệch chuẩn lên 1,58 lần) Vì giới hạn chấp nhận kết xác định MPN bên tham gia cần nâng lên thành ± 3σ ± 5σ (xem Bảng 1) Bảng - Giới hạn chấp nhận Giới hạn chấp nhận Phương pháp x ống Phương pháp x ống ± 3σ ± 0,96 log10 (gấp 9,1 lần) ± 0,72 log10 (gấp 5,2 lần) ± 5σ ± 1,60 log10 (gấp 39,8 lần) ± 1,20 log10 (gấp 15,8 lần) Quy tắc 0,5 log10 không nên áp dụng cho kết MPN tính biến thiên phương pháp Đối với phương pháp MPN, kiểm tra xem tổ hợp ống dung dịch pha lỗng báo cáo có phù hợp với giá trị MPN có cách tra bảng [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Nếu chương trình PT văn pháp quy yêu cầu giá trị MPN phải xác định song hành, kết so sánh tổ hợp ống đáng tin cậy chênh lệch hai kết không sai khác 2,58 x x 0,24 = 0,88 phương pháp x ống 2,58 x x 0,32 = 1,17 phương pháp x ống, tính theo đơn vị logarit thập phân Nếu so sánh hai phân bố với hai kết lặp lại cho phân bố trung bình hai giá trị không sai khác 2,58 x 0,24 = 0,62 phương pháp x ống 2,58 x 0,32 = 0,83 phương pháp ống x nồng độ, tính theo đơn vị logarit thập phân LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 8.3.8 Đánh giá kỹ dài hạn 8.3.8.1 Yêu cầu chung Đánh giá kỹ chương trình thử nghiệm thành thạo thường bó gọn khn khổ đánh giá kết từ đợt thử đơn lẻ, mở rộng phạm vi, việc đánh giá khoảng thời gian dài có ích Có số hướng dẫn áp dụng kiểu đánh giá cho chương trình đánh giá chất lượng từ bên để hoàn thiện phương pháp Bất kể phương pháp đánh giá kỹ lâu dài phải đảm bảo phòng thử nghiệm thực phép thử định lượng không bị nhận dạng ngẫu nhiên có “kỹ kém” số lượng vi sinh vật mẫu mà họ nhận Các số đếm “thấp“ “cao” cần định rõ theo quy tắc khách quan (ví dụ: sử dụng mơ hình Poisson số đếm thấp, phương pháp phân vị phương pháp khác số đếm cao), sau dùng để xác định phịng thử nghiệm có báo cáo kết thường xuyên dự kiến hay khơng Nhà tổ chức chương trình nên khuyến khích bên tham gia vận dụng nhận xét chuyên môn họ để đánh giá thơng tin cung cấp báo cáo, từ tự đánh giá kỹ Nhà tổ chức gọi ý cho bên tham gia cách khác thực tự đánh giá phòng thử nghiệm họ khơng nên ấn định tiêu chí tự đánh giá cho phòng thử nghiệm; tốt hơn, tiêu chí nên lập phịng thử nghiệm tham gia, dựa họ tin có ý nghĩa vi sinh học xét theo cơng việc ngày họ yêu cầu khách hàng 8.3.8.2 Đánh giá số đếm thấp Nếu ngẫu nhiên yếu tố có liên quan số đếm vùng biên cần phân bố ngẫu nhiên Các kết xem xét kỹ lưỡng để xác định độ phân tán kết vùng biên, phòng thử nghiệm qua loạt mẫu (ví dụ: sử dụng phép thử Q theo Cochran) Nếu chúng khơng phân bố ngẫu nhiên tiến hành phân tích giai đoạn để xác định phân bố dự kiến số đếm vùng biên số phịng thử nghiệm có báo cáo số liệu này, kết đơn giản thay đổi tự nhiên mẫu không ảnh hưởng từ kỹ phân tích phịng thử nghiệm Từ đó, trái ngược số kỳ vọng phòng thử nghiệm số thực tế quan sát phịng thử nghiệm có vấn đề kinh nghiệm Ví dụ đánh giá kỹ phân tích mẫu có số lượng vi sinh thấp nêu Bảng Bảng - Các số kỳ vọng quan sát tập hợp kết giả định phân bố ngẫu nhiên kết thấp (từ phân bố mức mật độ thấp Clostridium perfringens mẫu nước uống, mà biến thiên số lượng mẫu thử vượt biến đổi kỹ phân tích phịng thử nghiệm) Số thấp Quan sát Kỳ vọng 58 58 32 48,56 18 16,94 14 3,15 0,33 0,02 Tổng số 127 127 Một hai kết ngẫu nhiên; ba khơng ngẫu nhiên; bốn ngẫu nhiên quy trình cần kiểm tra lại 8.3.8.3 Đánh giá số đếm cao Đánh giá số đếm cao dựa vào nguyên tắc tương tự, kết bên tham gia biến động khác thành phần mẫu dự kiến Có thể đánh giá kỹ thời gian dài với 12 mẫu, ví dụ phương pháp phân vị, cho phép tính tối đa 24 điểm Các đơn vị tham gia giao đích kỹ 70 % Nếu bỏ qua quy tắc 0,5 log10 giả định tất bên tham gia có khả đạt đến kỹ tương đương cách sử dụng lý thuyết đa thức, thấy xác suất để phịng thử nghiệm nhận điểm số tích lũy 70 % điểm tối đa 5,2 % Điều có nghĩa LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn điều kiện xấp xỉ 20 đơn vị tham gia nhận dạng khơng xác “kỹ kém” Trong thực tế, kỹ đơn vị không tương đương vài phòng thử nghiệm thiếu kinh nghiệm phép thử mà họ thực hiện, xác suất kỹ đạt yêu cầu bị nhận định nhầm “kém” thấp nhiều so với giá trị Hơn nữa, việc sử dụng quy tắc 0,5 log10 làm giảm xác suất đến 0,1 % Ví dụ thực tế đánh giá kỹ thời gian dài qua cách sử dụng bảng thống kê nêu Phụ lục C 8.4 Đánh giá phương pháp định tính 8.4.1 Yêu cầu chung Đối với nghiên cứu so sánh liên phịng thử nghiệm sử dụng nhiều phương pháp định tính kết rõ ràng, có khơng, phát khơng phát Các phương pháp phân tích thống kê dạng kết bị hạn chế, nhiều tùy chọn khác đề cập chẳng hạn LOD50, đánh giá mức phù hợp, tương hợp tỷ lệ xác, cách tiếp cận tối ưu xem xét 8.4.2 Kỹ phòng thử nghiệm đơn lẻ Một phương pháp đơn giản để phòng thử nghiệm tham gia tự đánh giá ghi lại số kết dương tính âm tính họ thu với số kết dương tính âm tính kỳ vọng Thơng tin cần kết nối với ghi chép mật độ vi sinh đích mẫu để đánh giá kỹ phân tích đồng thời cung cấp số liệu hành giới hạn phát phương pháp phịng thử nghiệm Vì kết phép thử “có” “khơng” nên cần thử nhiều mẫu để đánh giá kỹ phịng thử nghiệm chương trình PT Mỗi đơn vị tham gia nên thử tổng cộng 18 mẫu 18 mẫu bao gồm lặp lại lần mức nhiễm khác mẫu Ba mức là: âm tính (kiểm tra xuất dương tính giả, ví dụ: nhiễm chéo); mức mật độ thấp (nghĩa mẫu bị nhiễm cao giới hạn phát phương pháp sử dụng, lý tưởng nên có mức nhiễm mà 50 % mẫu tìm thấy dương tính 50 % âm tính (LOD 50) mức cao (mức nên gấp 10 lần so với mức thấp đại diện cho mức nồng độ tất mẫu thử phải cho dương tính) Diễn giải liệu theo cách đơn giản: a) mức âm tính: tất mẫu cần phải âm tính; b) mức cao: tất mẫu cần phải dương tính; c) mức thấp: tính toán (xem Bảng 3) cách sử dụng phân bố nhị thức tỷ lệ phần trăm mẫu tìm thấy dương tính (có thể nhận giá trị tham chiếu từ nhà tổ chức số ước tính tốt từ kết tất bên tham gia) với mức tin cậy 95 % Bảng - Xác suất tìm thấy số định dương tính số mẫu thử, tính theo phần trăm trung bình từ mẫu dương tính (phân bổ nhị thức) Số dương tính từ sáu mẫu Phần trăm trung bình dương tính 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 53,1 % 26,2 % 11,8 % 4,7 % 1,6 % 0,4 % 0,1 % 0,0 % 0,0 % 35,4 % 39,3 % 30,3 % 18,7 % 9,4 % 3,7 % 1,0 % 0,2 % 0,0 % 9,8 % 24,6 % 32,4 % 31,1 % 23,4 % 13,8 % 6,0 % 1,5 % 0,1 % 1,5 % 8,2 % 18,5 % 27,6 % 31,3 % 27,6 % 18,5 % 8,2 % 1,5 % 0,1 % 1,5 % 6,0 % 13,8 % 23,4 % 31,1 % 32,4 % 24,6 % 9,8 % 0,0 % 0,2 % 1,0 % 3,7 % 9,4 % 18,7 % 30,3 % 39,3 % 35,4 % 0,0 % 0,0 % 0,1 % 0,4 % 1,6 % 4,7 % 11,8 % 26,2 % 53,1 % Ví dụ: Để sử dụng Bảng 3, trước hết cần biết tỷ lệ dương tính trung bình Ở đây, giả định tỷ lệ 30 %, có nghĩa khoảng ba mẫu có chứa vi sinh vật đích Vì có 30 % mẫu có vi sinh vật đích, nên dường có số mẫu khơng chứa vi sinh vật đích có mẫu thử chẳng hạn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Bảng cho thấy xác suất để có tập hợp sáu mẫu bao gồm bốn mẫu dương tính hai mẫu âm tính % Điều khơng xảy chấp nhận giả định mức tin cậy 95 % Tổng xác suất tìm thấy 0, 1, 2, mẫu dương tính 99,0 % (11,8 + 30,3 + 32,4 + 18,5 + 6,0) Trong trường hợp này, 99 % giá trị nhỏ 95 % (là giới hạn độ tin cậy) Bỏ kết dương tính thành 93 %, tỷ lệ thấp mức tin cậy 95 % Theo cách lập luận khác xác suất để tìm thấy mẫu dương tính 0,1 % Điều chắn không xảy ngẫu nhiên Khi độ không đảm bảo đặt mức tối đa %, (100 % - 95 % độ tin cậy), tỷ lệ nằm phạm vi giới hạn Cũng tương tự tình có mẫu tổng số mẫu thử tìm thấy dương tính Tổng xác suất 1,1 %, thấp giới hạn % Chỉ tình có thêm mẫu mẫu tìm thấy dương tính làm cho độ khơng đảm bảo vượt giới hạn % Khi mức tối đa thiết lập %, tình có mẫu dương tính tổng mẫu thử xem kết không mong đợi CHÚ THÍCH: Tại LOD50, 50 % số mẫu thử tìm thấy dương tính Về mặt lý thuyết [có tính đến phương pháp sử dụng có khả phát vi sinh vật đơn lẻ mẫu giả định có phân bố đồng (Poisson) mẫu], mức nhiễm trung bình mẫu dự kiến 0,7 vi sinh vật/mẫu để đạt LOD 50 Trong thực nghiệm, phân bố đồng cách lý tưởng thường không đạt theo cách tương đối, nên có nhiều số mẫu không chứa vi sinh vật (sống) trông đợi vào phân bố đồng thực Để nhận 50 % mẫu dương tính, cần tăng mức nhiễm trung bình lên, dựa kinh nghiệm vật liệu dùng thử nghiệm 8.4.3 Chương trình so sánh kỹ phòng thử nghiệm Để so sánh kỹ phân tích phịng thử nghiệm so với phịng thử nghiệm khác nhà tổ chức tính tốn số lượng (hoặc tỉ lệ phần trăm) dương tính mức độ nhiễm vi sinh vật đích tìm thấy cho mẫu thử phịng thử nghiệm (được báo cáo theo mã phòng thử nghiệm) Ví dụ cụ thể nêu Hình Trong nghiên cứu này, 28 phòng thử nghiệm tham gia (được thị theo mã phòng thử nghiệm trục NL Hình 2) Mỗi phịng thử nghiệm phân tích 22 mẫu phân gà gây nhiễm nhân tạo với vật liệu chuẩn chứa hai typ vi khuẩn Salmonella khác mức nhiễm khác (dao động từ 10 đến 500 cfu/mẫu) Trong Hình 2, kết tổng hợp mẫu có mức nhiễm thấp (n = 14) Số mẫu dương tính mà phòng thử nghiệm tham gia thu dao động từ đến 11 mẫu (trục n+ Hình 2) Ngồi cách mô tả rõ ràng kết trên, tính tốn tỉ lệ đặc hiệu, tỉ lệ chọn lọc tỉ lệ xác cho mức độ nhiễm mẫu (theo ISO 16140 [4]) Các tỉ lệ tính tốn cho phòng thử nghiệm cho kết từ tất phòng thử nghiệm tham gia CHÚ DẪN: NL mã phịng thử nghiệm n+ số phát dương tính Hình - Số lượng dương tính phân lập phòng thử nghiệm tất mẫu có mức vi sinh thấp thử nghiệm (n = 14) Độ đặc hiệu, rSP, tính theo cơng thức: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn đó: n_ số kết âm tính tìm thấy; E(n-tot) tổng số mẫu âm tính kỳ vọng Độ chọn lọc, rSE, tính theo cơng thức: đó: n+ số kết dương tính tìm thấy; E(n+tot) tổng số mẫu dương tính kỳ vọng Độ xác, rAC, tính theo cơng thức: đó: ntot tổng số mẫu Việc đánh có ý nghĩa liên kết với số lượng vi sinh vật đích có mặt mẫu PHỤ LỤC A (Tham khảo) VÍ DỤ VỀ CÁC CHI TIẾT ĐƯỢC ĐƯA VÀO KẾ HOẠCH CỦA CHƯƠNG TRÌNH PT Kế hoạch chương trình PT - Tóm tắt chương trình Tên chương trình: Chương trình kiểm tra thực phẩm Dạng chương trình: Vi sinh thực phẩm Mục đích: Cung cấp mẫu đánh giá chất lượng từ bên phép thử thơng thường phịng thử nghiệm vi sinh thực phẩm Tiêu chí lựa chọn đơn vị tham gia: Phịng thử nghiệm vi sinh thực phẩm có trang thiết bị phù hợp để thao tác với vi sinh vật gây bệnh thuộc cấp nguy hiểm Các phòng thử nghiệm mục tiêu: Các phòng thử nghiệm vi sinh thuộc tư nhân khu vực công Luật quy định: Quy định EU số 882/2004 liên quan đến kiểm soát pháp quyền thực phẩm Dạng mẫu: Vi sinh vật đơng khơ, đóng lọ thủy tinh nhỏ Các phép thử: Phát hiện/không phát hiện: Campylobacteria spp Escherichia coli O157 Salmonella spp Định lượng: Vi sinh vật hiếu khí Bacillus cerius Clostridium perfringens LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê Tên chương trình: www.luatminhkhue.vn Chương trình kiểm tra thực phẩm Coliforms Enterobacteriaceae Escherichia coli Listeria monocytogenes Staphylococci dương tính với coagulase Các tiêu chí thành phần mẫu: Có mặt hệ vi sinh vật giống tồn mẫu thực phẩm thật đưa đến thách thức thực cho quy trình thử vi sinh thực phẩm thơng dụng Số lượng đích đơn vị tham gia: Lớn 200 Số đợt phân phối hàng năm: Sáu (6) Số mẫu phân phối đợt: Hai (2) Nhà thầu phụ bên ngồi: Khơng Chun gia kỹ thuật: Tên người Thử nghiệm kiểm soát chất lượng mẻ mẫu: Tên phòng thử nghiệm phương pháp tiêu chuẩn dùng 25 mẫu từ mẻ kiểm tra tất tiêu định Phương pháp thống kê: Trung vị đồng thuận (phương pháp đếm) Phân vị để xác định giá trị bất thường Tính điểm: Có Tiêu chí chấm điểm: Ba điểm tính cho mẫu: i) kiểm tra vi sinh gây bệnh; ii) đếm khuẩn lạc hiếu khí; iii) vi sinh vật thị Đánh giá kỹ liên tục: Có Tiêu chí xác định “kết kém”: 70 % điểm tối đa qua đợt phân phối mẫu Tiếp cận hỗ trợ tích cực nhà tổ chức “nơi có kết kém": Có Phương pháp đánh giá: Có - có tính chất thị Điều phối viên chương trình người ủy quyền ký/ngày Phê chuẩn ban lãnh đạo: Ngày Tài liệu đề xuất ủy quyền: Ngày Trị giá duyệt: Ngày Ngày công nhận: Ngày Các nhận xét khác: Xem xét họp ban lãnh đạo PHỤ LỤC B (Tham khảo) CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MỨC SAI KHÁC GIỮA CÁC PHẦN MẪU CỦA VẬT LIỆU CẦN THỬ B.1 Phép thử T1-T2 Phép thử nên sử dụng cho trường hợp có vi sinh vật diện phần chia từ vật liệu thử (TM), mức từ 35 đến 40 cfu/đĩa, trường hợp ấn định “độ lệch chuẩn mục tiêu” để đánh giá độ đồng đạt Độ biến thiên phần mẫu phân tích đơn vị (hồn ngun) từ TM, T phần mẫu phân tích từ đơn vị khác (đã hoàn nguyên) mẻ TM, T 2, kiểm tra theo cách khác Các chi tiết đề cập Tài liệu tham khảo [12], nội dung tóm tắt nêu LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Áp dụng phép thử thống kê T1 để xác định độ biến thiên phần mẫu phân tích từ đơn vị (hoàn nguyên) TM (kiểm tra lặp lại): (B.1) đó: zij số cfu phần mẫu phân tích j đơn vị thứ i; zi+ tổng số cfu tất phần mẫu phân tích đơn vị i (B.2) J số phần mẫu phân tích từ đơn vị mẫu Áp dụng phép thử thống kê T2 để xác định độ biến thiên phần mẫu phân tích từ đơn vị khác (hoàn nguyên) mẻ TM: (B.3) đó: z++ tổng số (cfu) tất phần mẫu phân tích từ đơn vị kiểm tra mẻ TM I số đơn vị mẫu kiểm tra Nếu áp dụng phân bố Poisson T1 T2 tuân theo phân bố với bậc tự I(J - 1) I - Trong trường hợp này, giá trị kỳ vọng T1 T2 số bậc tự Vì vậy, kì vọng Đối với độ biến thiên đơn vị mẻ TM, theo phân bố Poisson độ biến thiên nhỏ theo lý thuyết đạt Tuy nhiên, người ta dự kiến có phân tán mạnh lớn (Tài liệu tham khảo [12]) Một mức biến thiên chấp nhận đơn vị mẻ TM ≤ VÍ DỤ Các liệu cho đây: Đơn vị: số đếm (kép) z11 = 45 z12 = 49 z21 = 33 z22 = 42 z31 = 40 z32 = 42 I = (ba đơn vị) J = (lặp lại hai lần) z1j/J = (45+49)/2 = 94/2 = 47 z2j/J = (33+42)/2 = 75/2 = 37,5 z3j/J = (40+42)/2 = 82/2 = 41 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê T1 cần tuân theo phân bố www.luatminhkhue.vn với I(J - 1) = x (2 - 1) = bậc tự Kiểm tra hai phía mức tin cậy 95 %, giới hạn giới hạn phân bố này, với bậc tự do, 0,22 9,3 Giá trị T1 tính (1,298) tuân theo tiêu chí Mức biến thiên chấp nhận cho mẻ mẫu là: T2 /(I - 1) ≤ Ở đây, T2 /(I - 1) = 2,206/(3 - 1) = 1,103 vậy, tuân thủ tiêu chí chấp nhận mẻ mẫu B.2 Kiểm tra mức độ đồng Kiểm tra độ đồng khuyến nghị trường hợp mà phần mẫu thử có chứa lượng lớn vi sinh vật (nhiều 35 đến 40 cfu/đĩa) có sẵn độ lệch chuẩn đích σp, thể mức hiệu suất dự kiến đơn vị tham gia PT Phép kiểm tra dựa phép thử “độ đủ đồng nhất” Tài liệu tham khảo [11] Với tập hợp phần mẫu thử phân tích kép kết thể dạng đơn vị log, kết kiểm tra đạt mức sai khác phần mẫu, S 2sam, thỏa mãn điều kiện (B.5): đó, S2an độ biến thiên phân tích Phép kiểm tra không chắn phép thử T1 - T2 dẫn đến định loại bỏ vật liệu không đồng hồn tồn (các kết phân tích tn theo phân bố Possion), vật liệu lại đủ độ đồng để sử dụng cho đợt thử nghiệm thành thạo với độ lệch chuẩn đích σp Điều mẫu chấp nhận trừ có biểu với mức tin cậy cao (95 %) rằng, phù hợp với mục đích sử dụng tiêu chuẩn σsam > 0,3 σp, σsam độ lệch chuẩn từ Ssam ước tính VÍ DỤ: Các kết định lượng thu từ phân tích kép 10 phần mẫu thử, tính độ chênh lệch D, tổng S D2 dạng logarit thập phân, cho nhóm kết (Bảng 1) Phần mẫu Phân tích Phân tích Log - phân tích Log - phân tích D S D2 35 51 1,5441 1,7076 -0,1635 3,2516 0,026733 52 46 1,7160 1,6628 0,0532 3,3788 0,002835 35 33 1,5441 1,5185 0,0256 3,0626 0,000653 53 38 1,7243 1,5798 0,1445 3,3041 0,020878 30 40 1,4771 1,6021 -0,1249 3,0792 0,015610 33 30 1,5185 1,4771 0,0414 2,9956 0,001713 41 60 1,6128 1,7782 -0,1654 3,3909 0,027346 35 55 1,5441 1,7404 -0,1963 3,2844 0,038532 68 67 1,8325 1,8261 0,0064 3,6586 0,000041 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Phần mẫu Phân tích Phân tích Log - phân tích 10 52 60 Log - phân tích D S D2 1,7782 -0,0621 3,4942 0,003362 1,7160 Tính tổng D chia cho hai lần số phần mẫu Đây trung bình tổng bình phương chênh lệch mẫu, Trong trường hợp này, Tính phương sai Trong trường hợp này, Tiếp đó, S2an = = 0,1382/20 = 0,00691 chia kết cho Giá trị = 0,04224/2 = 0,02112 S2sam = ( - )/2 Trong trường hợp này, S2an = 0,00691 S2sam = (0,02112 - 0,00691)/2 = 0,007104 Giá trị F1 F2 phụ thuộc vào số phần mẫu kiểm tra phép thử Khi phân tích 10 phần mẫu F1 = 1,88 F2 = 1,01 (giá trị cho số phần mẫu khác tham khảo thêm Tài liệu tham khảo [11]) Nếu độ lệch chuẩn mục tiêu áp dụng cho kết phép thử thành thạo này, σp, 0,25 log10, đơn vị, Giá trị lớn S2sam (0,007104) Do đó, Điều kiện (8.5) thỏa mãn vật liệu thử đủ độ đồng PHỤ LỤC C (Tham khảo) PHƯƠNG PHÁP THỰC HÀNH ĐÁNH GIÁ DÀI HẠN KỸ NĂNG CỦA CÁC ĐƠN VỊ THAM GIA CHƯƠNG TRÌNH PT SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG C.1 Chuẩn bị liệu phân tích Bốn cột bảng trình bày dùng để phân tích kết định lượng: a) số đếm báo cáo đơn vị tham gia (số đếm nR); b) số đếm sử dụng vẽ đồ thị biểu đồ, và/hoặc để tính điểm (số đếm ns); c) số đếm để phân tích (số đếm nA); d) cột để nhận xét (nội dung điền) (số đếm nc) để ghi lại lưu ý kết đơn vị tham gia Số đếm nR thông thường điền vào dạng số học (ví dụ: 1100) số khoa học (ví dụ, 1,1e3) Nếu kết báo cáo dạng giá trị bị chặn, sử dụng nội dung nhận xét kí hiệu “lớn hơn” “nhỏ hơn” điền vào trước chữ số (ví dụ: < 10, > 1100, v.v ) Số đếm nR điền với nội dung khác, NE (không thử/không kiểm tra), ND (không phát hiện) UA (không thể đánh giá) Cần thực nhập giá trị cho tất trường cột Nếu số đếm nR khơng thể phân tích được, (ví dụ: điền vào NE) khơng phân tích sâu khơng tính điểm Nếu số đếm nR khơng thể đưa vào phân tích thống kê, ví dụ: kết báo cáo dạng giá trị bị chặn, tính điểm số, và/hoặc kết gắn lên đồ thị, sau ấn định giá trị số học cho số đếm ns Giá trị đảm bảo điểm số xác tính kết vẽ xác lên đồ thị Ví dụ: điểm số khơng tính cho kết báo cáo “khơng phát hiện” hữu ích đưa kết lên biểu đồ Trong trường hợp này, số đếm ns điền vào -99 cột số đếm nA cần để trống LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Nếu kết báo cáo tính điểm, điểm số đưa vào tính tốn thống kê; số đếm nA = số đếm ns C.2 Xử lý số liệu bị giới hạn Tất kết bị chặn phân tích theo cách sau: a) Tất kết ấn định giá trị số đếm ns 0,2, khơng đưa vào phân tích (số đếm nA = 0) Điều phát sinh việc báo cáo giá trị bị chặn dưới, báo cáo “zero” (0), “không phát hiện” rõ ràng lỗi phịng thử nghiệm mức vi sinh vật nhóm vi sinh đích có mẫu tương đối cao b) Tất giá trị bị chặn kết “không phát hiện” ấn định số đếm ns 0,2 1) đưa vào phân tích mật độ vi sinh vật nhóm vi sinh vật đích tương đối thấp kết phát sinh ngẫu nhiên (số đếm ns = số đếm nA = 0,2) Có số ngoại lệ, chẳng hạn giá trị bị chặn báo cáo (x, giá trị x thấp giá trị trung vị trường số đếm nA nên để trống C.3 Dựng biểu đồ kết Biểu đồ xây dựng dựa giá trị số đếm nS Có hai dạng biểu đồ sử dụng cho kết chương trình PT: biểu đồ tần suất (hoặc biểu đồ cột) biểu đồ phân tán Các điểm xem xét lựa chọn kiểu biểu đồ để sử dụng, kể kiểu định lượng (MPN đếm khuẩn lạc ) số đơn vị tham gia áp dụng cách định lượng Biểu đồ cột tạo từ giá trị log thập phân số đếm nR, nhóm lại sau: < 0, (0 đến 0,05), (0,05 đến 0,1), (0,1 đến 0,15), [giá trị log 10(số đếm nR) lớn nhất], [giá trị log10 (số đếm nR) lớn + 0,05] Mọi trường hợp đặc biệt khơng số hóa đưa lên biểu đồ (ví dụ: - 99) cần đưa chúng vào thang riêng Cách khác, tạo dựng biểu đồ cột dựa giá trị logarit thập phân số đếm nR làm tròn đến 0,05 gần Trong trường hợp này, tạo nhóm giá trị sau: 0, 0,05, 0,1, 0,15, giá trị log10 (số đếm nR) lớn Trong trường hợp này, thang 0,1 bao gồm kết từ 0,075 đến 0,124 Biểu đồ phân tán dựng cách sử dụng trực tiếp giá trị số đếm ns, sau hốn đổi trục y thành thang log thập phân Các số liệu không số hóa loại khỏi biểu đồ phân tán Cách nhóm theo 0,05 log10 thường sử dụng cho biểu đồ cột, dãy tính điểm làm trịn đến 0,05 log10 C.4 Tính điểm Khi kết chương trình PT đánh giá điểm số, chuẩn mực tính điểm cần liệt kê kế hoạch chương trình PT báo cáo Điểm số tính cho kết định lượng điền vào trường (cột) điểm (nc-score); điều bổ sung thủ cơng, cần Lưu ý điểm số cuối kết đạt từ n c-score, yếu tố khác cần xem xét đến PHỤ LỤC D (Tham khảo) VÍ DỤ VỀ MỘT BẢNG DỮ LIỆU AN TOÀN LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Bảng liệu an toàn mẫu chương trình PT thực phẩm - dạng đơng khơ Ngày có hiệu lực: ngày-tháng-năm Ngày sốt xét: ngày-tháng-năm Ban hành đến: tất đơn vị tham gia chương trình Nhận dạng sản phẩm nơi thiết lập Sản phẩm: Các mẫu thực phẩm tạo cho phép thử vi sinh thông thường Nơi thiết lập: Địa đầy đủ chi tiết liên hệ với nhà tổ chức chương trình Cấu tạo thông tin thành phần Các lọ thủy tinh nhỏ (vial) với ngun liệu làm đơng khơ, có chứa hỗn hợp vi khuẩn thuộc nguy nhóm theo quy định luật quốc gia quốc tế Vi sinh vật thuộc nhóm nguy gây bệnh cho người mối nguy cho cán phịng thử nghiệm, khơng phát tán cộng đồng Nhận dạng mối nguy Mối nguy hóa lý: Khơng áp dụng Mối nguy sức khỏe: Nguy lây nhiễm thấp, miễn ý thao tác tốt phòng thử nghiệm Mối nguy môi trường: Không áp dụng Các phương tiện sơ cứu Nếu xảy tai nạn tiếp xúc với vật liệu thử nhân viên phịng thử nghiệm phải tn thủ quy trình sơ cứu nội thường áp dụng phơi nhiễm với mẫu thực phẩm tương tự (có chứa mối nguy vi sinh) Tiếp theo, cần có dẫn thầy thuốc phơi nhiễm Các phương tiện chống cháy Không áp dụng Các phương tiện làm giảm bớt tai nạn Phủ lên khu vực thao tác vật liệu hút-thấm tưới đẫm lên chất sát trùng thích hợp Khu vực cần để yên 30 trước lau dọn lớp dung dịch sát trùng lớp vật liệu hút-thấm Cần mang trang bị bảo vệ cá nhân thích hợp Quản lý lưu giữ Bảo quản nhiệt độ phòng, chỗ tối Các mẫu cần xử lý môi trường phòng thử nghiệm, hướng dẫn quy chuẩn quốc gia, thích hợp với phân tích vi sinh Cán thao tác với vật liệu thử cần đào tạo cách thao tác với mẫu sinh vật lây nhiễm Vật liệu cần xử lý với mức thận trọng giống làm việc với với mẫu thực phẩm tương tự Cần tránh tiếp xúc tay miệng trình thao tác với mẫu thử quy trình chuẩn rửa tay liên quan đến thao tác với mẫu thường cần áp dụng với mẫu PT Kiểm soát phơi nhiễm bảo hộ cá nhân Sử dụng GLP mặc đồ bảo hộ phịng thử nghiệm thích hợp, mang găng tay kính bảo vệ mắt Việc lấy lọ mẫu khỏi bao bì hồn ngun cần thực tủ hút bảo vệ Đặc tính hóa học vật lý Vật liệu khơ, trơ, khơng mùi Độ ổn định tính phản ứng Q trình bảo quản dường khơng làm tăng giảm nguy lây nhiễm gắn với việc xử lý mẫu Thơng tin độc tính Khơng áp dụng Thơng tin vệ sinh thái Không áp dụng Xem xét loại bỏ LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các vật liệu sử dụng cần phải khử nhiễm nồi hấp tiệt trùng, giống thực phẩm có chứa vi sinh vật lây nhiễm phù hợp với quy định quốc gia nội Thông tin vận chuyển Tham khảo quy định quốc gia quốc tế vận chuyển vi khuẩn thuộc nhóm nguy hiểm cấp độ (chất sinh học, cấp hạng B, UN3373) Thông tin quy định EC Tác nhân sinh học, cấp độ nguy hiểm/nhóm nguy CẢNH BÁO - Bảng liệu an tồn khơng hàm chứa đánh giá mối nguy không gian thao tác riêng người sử dụng theo yêu cầu luật an tồn sức khỏe Thơng tin khác Khi xảy cố liên quan đến nhân viên thử nghiệm bị phơi nhiễm với vật liệu chứa mẫu, cần liên hệ với nhà tổ chức chương trình PT Để có thêm thơng tin an tồn liên quan đến mẫu, bên tham gia nên đọc kỹ hướng dẫn gửi kèm theo mẫu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [2] TCVN 6910-4 (ISO 5725-4) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 4: Các phương pháp xác định độ phương pháp đo tiêu chuẩn [3] TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Hướng dẫn chuẩn bị sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy phòng thử nghiệm [4] ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods [5] TCVN ISO/IEC 17025 Yêu cầu chung lực phòng thử nghiệm hiệu chuẩn [6] ISO/TS 19036 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations [7] ISO/IEC Guide 99 International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM) [8] ILAC-G13, ILAC Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficience schemes Available (2010-02-10) at: http://www.ilac.org/documents/ILAC G13 08 2007.pdf [9] Thompson, M., ELLISON, L.R, WOOR, R for IUPAC The international harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories Pure Appl Chem 2006, 78, pp 145- 196 Available (2010-10-08) at: http://iupac.org/publications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf [10] AUGUSTIN, J.C., CARLIER, V Lessons from the organization of a proficiency testing program in food microbiology by interlaboratory comparison: analytical methods in use, impact of methods on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts Food Microbiol 2006, 23, pp 1-138 [11] FEARN, T., THOMPSON, M A new test for “sufficient homogeneity” Analyst 2001, 126, pp, 14141417 [12] HEISTERKAMP, S.H., HOEKSTRA, J.A., VAN STRIJP-LOCKEFEER, N.G.W.M, VAVELAAR, A.H, MOOIJMAN, K.A, IN’T VELD, P.H., S.H.W., MAIER, E.A.; GRIEPINK.B Statistical analysis of certification trials for microbioligcal reference materials Luxembourg: commission of the European communities, 1993 41 p (Report EUR 15008 EN.) [13] JARVIS, B Sampling for microbiological analysis In: LUND, B.M., BAIR-PACKER, A C., GOULD, G.W., editors The microbiological safety and quality of food, Vol 2, pp.1691-1734 Gaithersburg, MD: Aspen, 2000 [14] JARVIS B Statistical aspects of the microbiological examination of foods, nd edition Amsterdam: Academic Press, 2008 306 p LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn [15] JARVIS, B., HEDDGES.A.J., CORRY, J.E.L Assessment of measurement uncertainty for quantitative methods of analysis: comparative assessment of the precision (uncertainty) of bacterial colony counts Int J Food Microbiol 2007, 116, pp 44-51 [16] JARVIS.B., CORRY, J.E.R., HEDGES, A.J Estimates of measurement uncertainty from proficiency testing schemes, internal laboratory quality monitoring and during routine enforcement examination fo foods J Appl Microbiol 2007, 103, pp 462-467 [17] TILLETT, H.E., LIGHTFOOT, N.F EATON, S PLACE, B.M External quality assessment of microbial counts from water: To score or not to score for proficiency J Chart Inst Water Environ Manage 2000, 14, pp 304-308 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162