Với hoạt tính kháng nấm cao, vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite có thể được sử dụng trong thành phần vỏ bọc hạt giống nhằm kiểm soát nấm gây bệnh trên cây trồng.. (Moteshafi et al..[r]
(1)Tạp chí Cơng nghệ Sinh học15(2): 349-357, 2017
NGHIÊN C
Ứ
U KH
Ả
N
Ă
NG
Ứ
C CH
Ế
N
Ấ
M GÂY B
Ệ
NH TRÊN CÂY
ĐẬ
U T
ƯƠ
NG C
Ủ
A
V
Ậ
T LI
Ệ
U NANO Ag/BENTONITE
Nguyễn Hoài Châu1, Nguyễn Thị Thúy1, Đào Trọng Hiền1, *, Hoàng Thị Mai1,Nguyễn Văn Quang1,
Phạm Hồng Long1, Nguyễn Thị Bích Ngọc2,Trần Thị Phương Thêu1
1Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2Viện Bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội
* Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: tronghienvh@gmail.com
Ngày nhận bài: 22.8.2016 Ngày nhận đăng: 20.5.2017 TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, vật liệu nano bạc/Bentonite (Ag/CTS/Bentonite) tổng hợp thành công phương pháp khử Ag+ trong dung dịch nitrat bạc (AgNO
3) borohydrid natri (NaBH4) Chitosan (CTS)
được sử dụng làm chất phân tán, chất ổn định kết dính hạt nano bạc lên vật liệu bentonite Hình dạng kích thước hạt nano bạc đo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kết thu cho thấy hạt nano bạc có dạng hình cầu phân bố kích thước hạt khoảng rộng 5-90 nm Trong đó, thành phần bạc bentonite xác định phương pháp phổ huỳnh quang tia X (XRF) Khả ức chế nấm gây bệnh đậu tương vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite xác định hai đối tượng nấm
Fusarium oxysporum (F oxysporum) và Rhizoctonia solani (R solani) Viện Bảo vệ Thực vật phân lập từ đậu tương nhiễm bệnh lở cổ rễ, bệnh thối rễ tỉnh Bắc Ninh Kết nghiên cứu cho thấy vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite có khả ức chế hai lồi nấm đậu tương Hiệu ức chế nấm F oxysporum vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite nồng độ bạc 400 ppm đạt 66,70%, nồng độ bạc vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite có khả ức chế nấm R solani cao đạt 92,82% sau ngày nuôi cấy Với hoạt tính kháng nấm cao, vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite sử dụng thành phần vỏ bọc hạt giống nhằm kiểm soát nấm gây bệnh trồng
Từ khóa:Đậu tương, Fusarium oxysporum, hoạt tính kháng nấm, nano Ag/Bentonite, Rhizoctonia solani
MỞĐẦU
Trong trồng trọt, việc canh tác liên tục dẫn đến có nhiều loại nấm gây bệnh hại trồng tồn lưu đất, ảnh hưởng đến suất gây thiệt hại lớn sản xuất nông nghiệp Trong loại nấm gây bệnh, đáng ý chủng nấm F oxysporum và R solani gây thiệt hại nghiêm trọng đến suất nhiều loại ngũ cốc (lúa, ngô, khoai tây), loại rau (cà chua, bắp cải, rau diếp), loại ăn công nghiệp ngắn ngày, dài ngày (lạc, đậu, bông, cao su) F oxysporum và R solani gây triệu chứng thối rễ, lở cổ rễ, thối thân, bệnh đốm đậu tương (Baysal et al., 2008; Nelson et al., 1989; Petersen Buddemeyer, 2004) Đặc biệt, R solani và F oxysporum tồn đất, mô chết thời gian dài (Nelson, Summerll, 1989; Petersen, Buddemeyer, 2004)
(2)Nguyễn Hoài Châu et al. cho thấy nano bạc công vi sinh vật cách
thay đổi cấu trúc màng tế bào chức vi sinh vật (Pal et al., 2007) Có điều quan trọng hạt nano bạc ức chế vi sinh vật nhiều hoạt động khác nhau, khác với chất kháng sinh ức chế vi sinh vật đặc hiệu (Jo et al., 2009) Những thử nghiệm in vitro được thực hiệu quảức chế hạt nano bạc nhiều loại nấm gây bệnh thực vật (Gopinath, Velusamy, 2013; Kim et al., 2009) Trong nghiên cứu khác, hạt nano bạc có khả chống lại với nhiều nấm bệnh thực vật nhưBipolaris sorokiniana Magnapothe grisea (Jo et al., 2009) Nồng độ khác hạt nano bạc thử nghiệm để biết tác dụng ức chếđối với tác nhân gây bệnh nấm Alternata, Sclerotinia sclerotiorum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea Curvularia lunata (Krishnaraj et al., 2012) Nano bạc thể hoạt tính kháng khuẩn nấm cao nồng độ nhỏ, tương đương với ion bạc chất kháng khuẩn thông thường (Taylor et al., 2005; Rogers et al., 2008; Kim et al., 2009a,b)
Để ứng dụng hiệu nano bạc thực tế, người ta tìm cách gắn nano bạc lên vật liệu mang nhằm giảm giá thành, hạn chế tác nhân bên làm bất hoạt nano bạc kéo dài hoạt tính kháng nấm nano bạc Montmorillonite (MMT - thành phần bentonite) có đặc trưng khả trao đổi ion, khả trương nở, tính kết dính diện tích bề mặt lớn nên ứng dụng rộng rãi đời sống Theo số nghiên cứu cơng bố, ion bạc xen vào lớp MMT, vật liệu tạo thành có khả ức chế số chủng nấm gây bệnh Để gắn nano bạc lên MMT, nhà nghiên cứu sử dụng polyme chất kết dính chức hóa bề mặt MMT nhằm tạo vật liệu composite (Shameli et al., 2011; Santosa et al., 2011)
Trong số polyme tự nhiên, CTS nghiên cứu ứng dụng rộng rãi polyme cation sinh học polyme có tính tương thích sinh học cao, dễ phân hủy, khơng độc hại, dễ hịa tan mơi trường acid acetic nhẹ, có khả tạo màng, CTS xen vào lớp MMT qua trình trao đổi cation liên kết hydro tạo thành vật liệu cấu trúc bionanocomposit Vật liệu bionanocomposit kim loại/CTS/Bentonite với đặc tính đặc biệt mang lại nhiều ứng dụng đầy hứa hẹn (Shameli et al., 2011)
Để chế tạo vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite, trước tiên ion bạc đưa lên vật mang bentonite, ion bạc phân tán vào khoảng không gian hai lớp bentonite bề mặt vật liệu hỗ trợ máy khuấy tốc độ cao Tiếp theo, hạt nano bạc bentonite tạo cách khử ion bạc sử dụng dung dịch natri borohydrit theo tỷ lệ mol BH4-:Ag+ = 1:4, có mặt CTS có vai trị làm chất phân tán kết dính vật liệu bionanocomposit (Shameli et al., 2011; Santosa et al., 2011; Ngo Quoc Buu et al., 2011 )
Trong nghiên cứu này, vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite tổng hợp thành công cách sử dụng AgNO3, CTS NaBH4 làm tiền chất bạc, chất ổn định chất khử tương ứng, bentonite sử dụng làm vật liệu mang Ngồi ra, hoạt tính kháng nấm vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite chứng minh qua tác dụng ức chế số chủng nấm gây bệnh thực vật như: F oxysporum và R solani Các kết thu từ cơng trình sở khoa học đểđề xuất biện pháp kiểm soát dịch bệnh trồng tương lai
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Mẫu bệnh: nấm gây bệnh héo vàng (F oxysporum) lở cổ rễ đậu tương (R solani) Viện Bảo vệ thực vật phân lập từ đậu tương nhiễm bệnh lở cổ rễ, bệnh thối rễở tỉnh Bắc Ninh
Hóa chất: AgNO3 (99,5%, Merck), NaBH4 (>99%, Cica), axit citric (99,5%, Merck) chitosan (độ deacetylated: 75% - 85%, Sigma - Aldrich), bentonite (Hàm lượng MMT> 70%, Viện Công nghệ môi trường cung cấp)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chế tạo vật liệu nano
Ag/CTS/Bentonite
(3)Tạp chí Cơng nghệ Sinh học15(2): 349-357, 2017 chỉnh pH dung dịch axit citric 1% cho pH hỗn hợp đạt 4,5, tiếp tục khuấy thêm 30 phút thu dung dịch C Dung dịch C để bóng tối qua đêm, sau khuấy máy khuấy học với tốc độ 2.000 vòng/phút Các ion bạc khử cách nhỏ từ từ 1,25 mmol dung dịch NaBH4 vào dung dịch C, tiếp tục khuấy hỗn hợp
trong 15 phút Tiếp theo, lọc hỗn hợp huyền phù để thu vật liệu nanocomposite Ag/CTS/Bentonite Cuối cùng, sản phẩm sấy khô nhiệt độ 50oC 24 thu bột nanocomposite Ag/CTS/Bentonite Sơđồ quy trình chế tạo vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite thể hình (Lee et al., 2013; Oves et al., 2013)
Nghiên cứu đặc trưng của vật liệu nano
Phổ huỳnh quang tia X: việc xác định thành phần bạc bentonite thực máy phổ kế huỳnh quang tia X - VietSpace, kiểu XRF5006-HQ02, điện áp 40 kV, dịng 20 mA
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): kích thước hạt nano bạc xác định máy đo TEM (Model-JEOL 1010, Nhật Bản), hệ số phóng đại M = x50 - x600.000, độ phân giải δ = Å, điện áp gia tốc U = 40-100 kV
Phân lập loại nấm
Các mẫu bệnh F oxysporum và R solani được thu thập từ đậu tương nhiễm bệnh lở cổ rễ, bệnh thối rễ tỉnh Bắc Ninh Phương pháp xử lý mẫu gồm: a) chọn mô bệnh sau cắt mẫu thành miếng nhỏ có kích thước 1-2 mm; b) khử trùng dụng cụ cồn 70o; c) rửa nước cất khử trùng lần; d) thấm khô bề mặt giấy thấm đặt mẫu đĩa petri chứa môi trường potato dextrose agar (PDA) Khi đường kính tản nấm đạt 1-2 cm, lấy phần bên hệ sợi nấm, chuyển sang môi trường thạch nghiêng PDA ủ 28oC
Dung dịch A: Bentonite (Tạo huyền phù 10%)
Dung dịch B: CTS AgNO3
Hỗn hợp dung dịch (A + B)
Axit citric 1,0 %
Dung dịch C
1,25 mmol NaBH4
Huyền phù Ag/Bentonite
Nanocomposite Ag/CTS/Bentonite
(1*) (2*)
(3*)
(4*)
(5*)
(4)Nguyễn Hoài Châu et al. 48 Sau đó, mẫu bảo quản 4oC cho
các thí nghiệm
Đánh giá hoạt tính kháng nấm của nano bạc
Trước tiên, môi trường PDA hấp khử trùng 121°C 20 phút, sau để nguội đến nhiệt độ 50-60°C Tiếp theo, vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite đưa vào môi trường PDA với nồng độ bạc khảo sát từ 20 – 400 ppm, lắc đổ 30 ml vào đĩa petri Nấm làm thuần, cắt miếng thạch kích thước 0,5 cm có chứa nấm đặt vào đĩa petri Các đĩa petri đặt tủđịnh ôn nhiệt độ 28°C Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm sau cấy 1, 2, 3, 5, ngày tính hiệu quảức chế (%) sau ngày Hiệu ức chế nấm vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite tính theo cơng thức Abbott:
HQƯC % =(1−D!"
DĐ")∗100
Trong đó: DTN: Đường kính tản nấm cơng thức thí nghiệm (cm) DĐC: Đường kính tản nấm mẫu đối chứng (cm)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đặc trưng nano bạc
Trên hình 2, đỉnh hấp thụ lượng đặc trưng bạc xuất vị trí có lượng 21,99 25,00 keV, coi đỉnh đặc trưng Agα Agβ bentonite Ngồi ra, phổ XRF cịn thể đặc trưng mẫu bentonite với xuất đỉnh MMT Kết quảđo phổ XRF chứng minh diện bạc vật liệu mang bentonite (Shameli et al., 2011; Santosa et al., 2011)
Đối với vật liệu khử trùng, kích thước hạt có ảnh hưởng lớn đến khả ức chế nấm vật liệu, kích thước hạt nhỏ diện tích bề mặt
lớn, khả tiếp xúc vật liệu tế bào nấm cao hiệu suất khử trùng lớn Kết quảđo TEM (Hình 3) cho thấy hạt nano bạc tạo thành có phân bố kích thước nằm khoảng - 90 nm, kết thu được giải thích cấu trúc MMT ảnh hưởng đến kích thước hạt bạc tạo thành, hạt bạc nằm cấu trúc lớp MMT có kích thước nhỏ so với hạt bạc nằm bề mặt MMT (Shameli et al., 2011)
Hiệu quả ức chế nấm vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite
Hiệu quả ức chế nấm R solani của vật liệu Ag/CTS/Bentonite
Hạch nấm R solani có khả tồn lâu đồng ruộng nguồn bệnh tồn lưu qua vụ
Ag/CTS/Bentonit e
Bentonite
Hình 2. Phổ huỳnh quang tia X vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite
(5)Tạp chí Cơng nghệ Sinh học15(2): 349-357, 2017 Trên mơi trường nhân tạo nấm có khả phát triển nhanh dễ dàng hình thành hạch nấm Việc hạn chế hình thành hạch nấm giúp giảm nguồn bệnh đồng ruộng quan trọng
việc phòng trừ nấm bệnh Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ bạc đến khả phát triển hạch nấm R solani khảo sát, kết thí nghiệm thể bảng hình
Bảng 1. Hiệu quảức chế nấm R solani vật liệu Ag/CTS/Bentonite
TT Công thức
Đường kính tản nấm (cm)
Số lượng hạch nấm/Đĩa
Hiệu quảức chế
(%)
Sau ngày Sau ngày
1 CT 1,80 6,30g 65,67 28,16h
2 CT 1,50 5,07f 55,67 42,19g
3 CT 0,97 4,23e 43,33 51,77f
4 CT 0,83 2,77d 15,67 68,42e
5 CT 0,53 2,53d 0,00 71,15d
6 CT 0,77 1,27c 0,00 85,52c
7 CT 0,73 0,93b 0,00 89,40b
8 CT 0,60 0,63a 0,00 92,82a
9 ĐC 3,53 8,77h 382,33 -
CV% 5,90 3,70 - 2,6
Ghi chú: Các chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) CT1 - Nồng độ bạc 20 ppm CT6 - Nồng độ bạc 200 ppm
CT2 - Nồng độ bạc 40 ppm CT7 - Nồng độ bạc 300 ppm CT3 - Nồng độ bạc 60 ppm CT8 - Nồng độ bạc 400 ppm
CT4 - Nồng độ bạc 80 ppm ĐC - Mẫu khơng có vật liệu Ag/CTS/Bentonite CT5 - Nồng độ bạc 100 ppm CV: Hệ số biến thiên
(6)
Tạp chí Cơng nghệ Sinh học15(2): 349-357, 2017 Kết khảo sát điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy, sau hai ngày ni cấy đường kính tản nấm nhỏ (0,63 cm) nồng độ nano bạc 400 ppm hiệu ức chế cao đạt 92,82% Nồng độ bạc khoảng 200 – 300 ppm có hiệu ức chế nấm từ 85,52 – 89,40%, nồng độ bạc 60 – 80 ppm có hiệu quảức chế trung bình 42,19 – 51,77%, nồng độ bạc 20 ppm có hiệu quảức chế thấp 28,16% so với đối chứng Số lượng hạch nấm trung bình cao công thức đối chứng (382,33 hạch nấm/đĩa) Ở nồng độ bạc 100 – 400 ppm có khả ức chế cao, khơng hình thành hạch nấm Các cơng thức cịn lại số lượng trung bình hạch nấm thấp, nồng độ bạc 80 ppm có trung bình 15,67 hạch nấm/đĩa, nồng độ bạc 60 ppm có 43,33 hạch nấm/đĩa, nồng độ bạc 40 ppm có 55,67 hạch nấm/đĩa nồng độ bạc 20 ppm có 65,67 hạch nấm/đĩa
Hiệu quả ức chế nấm F oxysporum của vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite
Khả ức chế nấm đánh giá thông qua
khả sinh trưởng nấm môi trường Hiệu ức chế nấm F oxysporum Ag/CTS/Bentonite đánh giá thí nghiệm thể ảnh hưởng nồng độ bạc đến sinh trưởng phát triển nấm F oxysporum Thí nghiệm gồm cơng thức, nhắc lại lần, theo dõi đường kính tản nấm sau 3, 5, ngày ni cấy, tính tốn hiệu ức chế công thức Abbott, kết quảđược thể bảng hình
Kết thí nghiệm cho thấy, hàm lượng bạc nồng độ khác có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm F oxysporum Bạc với nồng độ 20 – 100 ppm có khả ức chế nấm chưa cao, kích thước tản nấm sau ngày ni cấy lớn, đạt 7,07 – 8,33 cm, nồng độ bạc 200 – 300 ppm đường kính tản nấm 5,37 5,03cm Với nồng độ bạc 400 ppm có đường kính tản nấm nhỏ 2,93 cm Hiệu quảức chế nấm nồng độ bạc 20 – 100 ppm chỉđạt từ 5,34 – 19,66% Bạc với nồng độ từ 200 – 300 ppm có hiệu quảức chế trung bình 42,84%, nồng độ 400 ppm cho hiệu quảức chế nấm cao nhất, đạt 66,70%
Bảng 2.Ảnh hưởng nồng độ bạc đến sinh trưởng phát triển nấm F oxysporum.
TT Cơng thức Đường kính tản nấm (cm) Hiệu quảức chế
(%)
3 ngày 5 ngày 7 ngày
1 CT 4,17 5,60 8,33b 5,34h
2 CT 3,93 5,57 8,00c 9,09g
3 CT 3,73 5,40 7,57d 13,98e
4 CT 3,33 5,20 7,50d 14,77e
5 CT 3,23 4,83 7,07e 19,66d
6 CT 3,03 4,13 5,37f 38,98c
7 CT 2,67 3,90 5,03g 42,84b
8 CT 1,83 2,20 2,93h 66,70a
9 ĐC 4,27 5,83 8,80a -
CV% 2,6 2,2 2,2 6,7
Ghi chú: Các chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) CT1 - Nồng độ bạc 20 ppm CT6 - Nồng độ bạc 200 ppm
CT2 - Nồng độ bạc 40 ppm CT7 - Nồng độ bạc 300 ppm CT3 - Nồng độ bạc 60 ppm CT8 - Nồng độ bạc 400 ppm
(7)Tạp chí Cơng nghệ Sinh học15(2): 349-357, 2017
KẾT LUẬN
Tổng hợp vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite phương pháp khử sử dụng NaBH4 làm chất khử môi trường CTS biện pháp đơn giản đạt hiệu cao Các hạt nano bạc có dạng hình cầu phân bố kích thước hạt khoảng rộng 5-90 nm Vật liệu nano Ag/CTS/Bentonite tổng hợp nghiên cứu có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật F oxysporum và R solani Nano bạc với nồng độ 400 ppm có hiệu quảức chế nấm F oxysporum cao đạt 66,70%, hiệu quảức chế nấm R solani cao đạt 92,82% sau ngày nuôi cấy Nồng độ nano bạc khoảng 100 – 400 ppm có khả ức chế nấm R solani đến mức khơng hình thành hạch nấm
Vật liệu Ag/CTS/Bentonite cần tiếp tục khảo nghiệm số chủng nấm phân lập từ số loại khác để chứng minh phổ ức chế nấm thực vật nhằm sử dụng chất kháng nấm để kiểm soát loại nấm gây bệnh trồng
Lời cảm ơn:Nghiên cứu hồn thành khn khổ đề tài: “Nghiên cứu chế tạo vật liệu nanocomposite chứa nano bạc nhằm loại trừ tác hại của số loại nấm tồn lưu đất gây bệnh cho trồng để thay cho thuốc bảo vệ thực vật gây ô nhiễm môi trường”, mã số: VAST07.01/14-15 Tập thể tác giả chân thành cảm ơn Viện Hàn lâm
Khoa học Công nghệ Việt Nam tài trợ kinh phí thực hiện.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Baysal F, Benitez MS, Kleinhenz M, Miller SA, McSpadden Gardener BB (2008) Field management effects on damping-off and early season vigor of crops in a transitional organic cropping system Phytopathology 98: 562–570
Gopinath V, Velusamy P (2013) Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using Bacillus sp GP-23 and evaluation of their antifungal activity towards Fusarium oxysporum Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 106: 170–174
Jo YK, Kim BH, Jung G (2009) Antifungal activity of silver ions and nanoparticles on phytopathogenic fungi
Plant disease 93: 1037–1043
Kim KJ, Sung WS, Suh BK, Moon SK, Choi JS, Kim JG, Lee DG (2008) Antifungal Effect of Silver Nanoparticles on Dermatophytes J Microbiol Biotechnol 18: 1482–1484 Kim KJ, Sung WS, Suh BK, Moon SK, Choi JS, Kim JG, Lee DG (2009a) Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles on Candida albicans BioMetals 22: 235–242
Kim SW, Kim KS, Lamsal K, Kim YJ, Kim SB, Jung M, Sim SJ, Kim HS, Chang SJ, Kim JK, Lee YS (2009b) An in vitro study of the antifungal effect of silver nanoparticles on oak wilt pathogen Raffaeleasp J Microbiol Biotechnol 19: 760–764