Nghiên cứu bào chế và đánh giá tương đương sinh học viên phóng thích kéo dài chứa acid valproic và natri valproat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH PHÙNG CHẤT NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC VIÊN PHĨNG THÍCH KÉO DÀI CHỨA ACID VALPROIC VÀ NATRI VALPROAT Chuyên ngành:Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2017 Cơng trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ HẬU Phản biện 1: PGS.TS TRẦN VIỆT HÙNG Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN THIỆN HẢI Đại học Y dƣợc TP Hồ Chí Minh Phản biện 3: TS NGUYỄN THỊ CHUNG Hội Dƣợc học TP Hồ Chí Minh Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH vào hồi giờ, ngày 24 tháng 07 năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Khoa học Tổng hợp TPHCM - Thƣ viện Đại học Y Dƣợc TP HCM GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Acid valproic (AV) natri valproat (NV) sử dụng rộng rãi việc điều trị thể động kinh đơn giản phức tạp Với ưu điểm trội điều trị giảm liều dùng, tăng hiệu kiểm soát bệnh động kinh, dạng bào chế phóng thích kéo dài (PTKD) AV NV Thầy thuốc định nhiều điều trị động kinh rối loạn cảm xúc lưỡng cực Với tính chất đặc biệt loại dược chất (AV có dạng lỏng; NV có dạng rắn háo ẩm) việc bào chế dạng thuốc viên từ thành phần khó khăn thách thức cho nhà sản xuất dược phẩm Vì vậy, chưa có nơi nước sản xuất dạng viên phối hợp thành phần Đề tài “Nghiên cứu bào chế đánh giá tƣơng đƣơng sinh học viên phóng thích kéo dài chứa hoạt chất natri valproat acid valproic” chọn nghiên cứu với mục đích tạo sản phẩm thuốc có chất lượng hiệu điều trị tương đương để cung cấp nhu cầu điều trị bệnh động kinh Để thực thành công đề tài này, cần tập trung giải mục tiêu sau : Xây dựng công thức, quy trình bào chế viên PTKD chứa AV NV qui mơ phịng thí nghiệm Nâng cấp qui mơ sản xuất 20.000 viên, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng theo dõi độ ổn định sản phẩm Xác định tương đương sinh học so với thuốc đối chiếu Depakine Chrono 500 mg Ý nghĩa khoa học tính cấp thiết đề tài Bệnh động kinh bệnh lý mạn tính hệ thần kinh Theo WHO, tỷ lệ mắc bệnh động kinh Việt Nam chiếm khoảng % dân số, gần 60% trẻ em Bệnh động kinh gây ảnh hưởng sâu sắc đến chất lượng sống làm giảm đáng kể suất lao động người bệnh Dạng thuốc PTKD chứa dược chất AV NV có nhiều ưu điểm hiệu điều trị so với dạng bào chế cổ điển Vì vậy, nhu cầu sử dụng dạng thuốc ngày tăng cao, nguồn cung ứng lệ thuộc hoàn toàn vào nhập Việc nghiên cứu sản xuất nước chế phẩm có chất lượng hiệu trị liệu tương đương thuốc nhập góp phần giảm lệ thuộc vào nguồn cung ứng, giảm giá thành, nhờ giúp giảm đáng kể chi phí điều trị cho người bệnh Mặt khác, khía cạnh khoa học, thành cơng đề tài góp phần thúc đẩy phát triển ngành kỹ thuật bào chế dạng thuốc PTKD, cơng nghệ cịn mẻ khuyến khích phát triển Việt Nam Những đóng góp luận án Đóng góp kỹ thuật bào chế thuốc viên PTKD chứa dƣợc chất AV NV Luận án thành công nghiên cứu bào chế thuốc viên PTKD kết hợp hai dạng hóa học dược chất, có thành phần dạng lỏng (AV) kỹ thuật đơn sử dụng loại tá dược hút phổ biến (Aerosil) Đây cơng trình nghiên cứu bào chế kết hợp dược chất AV NV dạng viên PTKD lần cơng bố Việt Nam Đóng góp phƣơng pháp định lƣợng AV NV huyết tƣơng Phương pháp định lượng AV NV máu phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (UHPLC-MS/MS) cơng trình mới, lần thực công bố Việt Nam Kết tạo phương pháp có tính ứng dụng thực tiễn, để đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học cho chế phẩm chứa AV, NV hỗn hợp thành phần Đóng góp nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học thuốc chứa AV NV Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế phẩm viên PTKD chứa AV NV cơng trình mới, lần thực người tình nguyện Việt Nam Bố cục luận án Luận án gồm chương, 94 bảng, 12 hình, sơ đồ 32 biểu đồ, 118 tài liệu tham khảo, 11 Phụ lục Luận án gồm 149 trang : Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (26 trang), nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (39 trang), kết (65 trang), bàn luận (14 trang), kết luận kiến nghị (3 trang) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đã tập hợp trình bày cách có hệ thống tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài, gồm: tổng quan hệ thống trị liệu PTKD đường uống hệ thống PTKD khung matrix; tính chất lý hóa dược chất AV, NV; đặc điểm sinh học tác dụng trị liệu chế phẩm chứa AV, NV; nghiên cứu kỹ thuật bào chế viên PTKD chứa hoạt chất AV NV; phương pháp kiểm nghiệm hoạt chất chế phẩm dịch sinh học; nghiên cứu dược động học hiệu trị liệu thuốc chứa AV NV; tổng quan nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học thuốc CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu - Nguyên liệu AV (lô VA/12/002) NV (lô SV/13/006) Nhà sản xuất Chempifine, đạt tiêu chuẩn BP; chất chuẩn AV đạt tiêu chuẩn USP, chất chuẩn NV đạt tiêu chuẩn BP Các hóa chất thuốc thử nghiên cứu kiểm nghiệm nghiên cứu tương đương sinh học đạt tiêu chuẩn phân tích theo qui định DĐVN IV - Các tá dược sử dụng bào chế đạt tiêu chuẩn dược điển BP, USP, JP DĐVN IV có phiếu kiểm nghiệm 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu - Xây dựng thẩm định định lượng hoạt chất chế phẩm phương pháp HPLC, dựa chuyển đổi NV thành AV tự môi trường pha động - Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất hịa tan mơi trường HCl 0,1N môi trường pH 1,2; 4,5; 5,5 6,8 Trên sở này, khảo sát độ hòa tan động học GPHC viên đối chiếu, làm sở xây dựng tiêu độ hòa tan thiết kế bào chế sản phẩm nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng polyme tạo khung xây dựng công thức bào chế bản, tối ưu hóa cơng thức bố trí thí nghiệm bậc phương pháp tối ưu hóa tiến theo Gradient - Xây dựng quy trình bào chế viên nhân qui mơ phịng thí nghiệm phương pháp thực nghiệm Khảo sát ảnh hưởng yếu tố qui trình sản xuất (độ cứng viên) lên độ GPHC sản phẩm - Nâng cấp qui mô sản xuất lên cỡ lô 20.000 viên, đánh giá thông số qui trình thực nghiệm, kết hợp thẩm định thống kê để kiểm soát ổn định qui trình sản xuất - Nghiên cứu chọn polyme tỷ lệ sử dụng bao phim chống ẩm thực nghiệm Đánh giá ổn định thơng số qui trình bao phim phương pháp thống kê - Nghiên cứu tương đương hịa tan in vitro mơi trường pH 1,2; 4,5 6, dựa so sánh hệ số f2 44, 109 - Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm dựa kết thực nghiệm tham khảo tài liệu chung thuốc PTKD - Nghiên cứu độ ổn định tuổi thọ tiến hành theo hướng dẫn theo dõi độ ổn định Aesan 31 - Nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp định lượng AV huyết tương theo hướng dẫn EMEA 47 FDA 108 - Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học in vivo theo mơ hình thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều, thuốc, giai đoạn trình tự, đánh giá 02 tình trạng no đói 4, 30 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng cơng thức, quy trình bào chế viên PTKD chứa AV NV qui mơ phịng thí nghiệm 3.1.1 Xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng hoạt chất chế phẩm HPLC Đã xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất chế phẩm Phương pháp áp dụng vào tiêu chuẩn để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng sản phẩm (phụ lục 1) 3.1.2 Khảo sát độ GPHC thuốc đối chiếu - Đã xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất hòa tan môi trường thử (phụ lục 2,3,4 5), sở khảo sát độ hịa tan viên đối chiếu Kết trình bày bảng 3.2 (chi tiết phụ lục 6.1) - Đã xác định mơ hình động học GPHC từ viên đối chiếu, tn theo mơ hình Higuchi, có phương trình yˆ = 29,37 t - 17,69 - Đã dự kiến tiêu chuẩn độ hòa tan chế phẩm dựa kết khảo sát độ hòa tan viên đối chiếu tham khảo tài liệu qui định chung tiêu chuẩn độ hòa tan thuốc PTKD 62, gồm: + Môi trường HCl 0,1N :  10 % hoạt chất hịa tan sau 45 phút; + Mơi trường pH 5,5: Từ 10 - 35 % hoạt chất hòa tan sau giờ; 3565 % hoạt chất hòa tan sau ≥ 75 % hoạt chất hòa tan sau 12 Phương pháp thử tiêu độ hòa tan đưa vào tiêu chuẩn sở áp dụng để đánh giá sản phẩm nghiên cứu Bảng Độ hòa tan viên đối chiếu Depakine Chrono 500 mg Thời gian Độ hòa tan SD % Ghi Môi trường HCl 0,1 N (n = 18) 45 phút 3,55 0,58 Giờ 13,32 1,00 Giờ 22,58 1,28 Giờ 38,79 2,36 Giờ 54,84 3,22 Môi trường đệm pH Giờ 66,30 3,77 5,5 Giờ 10 77,5 5,61 Giờ 12 82,11 5,45 3.1.3 Nghiên cứu xây dựng công thức viên nhân - Đã khảo sát chọn polyme tạo khung GPHC với tỷ lệ 15% HPMC K15M , 2,5 % 5,0% với HPMC 615 - Đã xây dựng công thức gồm tá dược tạo khung HPMC K15 M, HPMC 615 tá dược khác (aerosil, PVP K30, dicanxi phosphat, talc magnesi stearat) - Đã khảo sát yếu tố ảnh hưởng với biến độc lập hàm lượng HPMC K15M (x1) HPMC 615 (x2), biến phụ thuộc y (độ hòa tan hoạt chất điểm giờ) phương pháp bố trí thực nghiệm bậc 1, mơ hình 22 (2 biến x mức) Kết xác định yếu tố ảnh hưởng hàm lượng HPMC K15M phương trình bậc biểu ˆ diễn phụ thuộc x1 y : y = 76,43 - 60,64 x1 (R2 = 0,99) - Đã tiến hành thực nghiệm tiến đến vùng tối ưu theo phương pháp tiến theo Gradient, với bước nhảy Sb1  - 0,72 (gồm thực nghiệm TN6, TN7, TN8, TN TN 10) - Đã xác định điểm tối ưu x1 = 17,16 % (hàm lượng HPMC K15 M 120 mg/viên), tương ứng hàm lượng HPMC 615 chọn 20 mg/viên (TN 9), độ hòa tan so với thuốc đối chiếu đạt f2 = 82,2 (Chi tiết phụ lục 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 6.6) - Đã kiểm chứng công thức tối ưu (TN 9) thực nghiệm (TN 11) Kết độ hịa tan sản phẩm kiểm chứng (TN 11) khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cơng thức tối ưu (TN 9) Ngoài ra, sản phẩm kiểm chứng (TN 11) đạt tương đương hòa tan so với thuốc đối chiếu, với hệ số f2 = 79,1 (chi tiết phụ lục 6.7) - Đã xác định mơ hình động học viên nhân (TN 11) theo mơ hình Higuchi, phương trình yˆ = 29,06 t -14,79 hệ số R2 = 0,998 3.1.4 Bao phim chống ẩm cho viên nhân 3.1.4.1 Khảo sát lựa chọn loại tá dược bao chống ẩm Nghiên cứu so sánh khả chống ẩm polyme ethyl cellulose (tỷ lệ dùng % so với khối lượng viên nhân), Eudragit E 100 (tỷ lệ % so với khối lượng viên nhân) Opadry AMB (tỷ lệ % so với khối lượng viên nhân) thực nghiệm Kết chọn Eudragit E 100 để bao phim chống ẩm cho sản phẩm 3.1.4.2 Khảo sát chọn tỷ lệ eudragit E 100 bao chống ẩm Đã đánh giá khả chống ẩm màng phim theo tỷ lệ eudragit E 100 mg/cm2, mg/cm2 mg/cm2 (tương ứng với 1,1 %; 2,2 % 3,3 % so với khối lượng viên nhân) Kết xác định tỷ lệ phù hợp mg/cm2 để bao phim chống ẩm 3.1.5 Xây dựng qui trình bào chế viên nhân qui mơ thí nghiệm 3.1.5.1 Thăm dị thơng số trọng yếu qui trình Thời gian sấy bột nguyên liệu (t1) Đã xác định thời gian sấy bột nguyên liệu (t1) từ 80 - 90 phút tủ sấy tĩnh, nhiệt độ sấy 700C (hàm ẩm bột yêu cầu  0,5%) Thông số trộn hỗn hợp bột nguyên liệu (t2) Kết xác định thời gian trộn đồng hỗn hợp bột nguyên liệu (t2) từ 10 - 20 phút máy trộn lập phương, tốc độ quay 30 vòng/phút (độ phân tán hàm lượng với CV % < %) Thời gian trộn bột kép (t3) Kết xác định thời gian trộn bột kép (t3) từ - phút máy trộn siêu tốc với tốc độ cánh trộn 150 v/phút cánh đảo 1500 v/phút (có độ phân tán hàm lượng với CV % < %) Thời gian sấy cốm (t4) Kết xác định thời gian sấy cốm (t4) từ 90 - 100 phút tủ sấy tĩnh nhiệt độ sấy 700C (hàm ẩm cốm đạt u cầu  1,5%) Thơng số trộn hồn tất (t5) Kết xác định thời gian trộn hoàn tất (t5) từ 10 - 20 phút máy trộn lập phương, với tốc độ quay 30 vịng/phút (có độ phân tán hàm lượng với CV % < %) Độ trơn chảy Kết khảo sát cho thấy cốm đạt yêu cầu độ trơn chảy từ tốt đến tốt, phù hợp để dập viên Đánh giá tính chất hạt Kết khảo sát cho thấy tỷ trọng hạt (cốm) có khác biệt, phân bố cỡ hạt phù hợp cho dập viên Đánh giá tính chất viên Viên nhân đạt yêu cầu khối lượng viên (KLVTB  %), độ cứng viên (120 + 20 N), độ mài mòn (< 0,3 %), độ hòa tan đạt tương Kiểm soát thống kê khối lượng viên trình dập viên Các kết thống kê cho thấy khối lượng trung bình viên giai đoạn lô, khối lượng trung bình viên lơ khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (chi tiết phụ lục 7.2, 7.3 7.4) Các biểu đồ kiểm soát phạm vi kiểm soát khối lượng viên lô P010214, P 020214 P030214 thể ổn định khối lượng viên q trình dập viên, khơng có giai đoạn vượt khỏi vùng giới hạn cảnh báo Các thông số kỹ thuật viên nhân lô nâng cấp Độ cứng, độ mài mòn viên nhân lô đạt yêu cầu qui định khác biệt có ý nghĩa thống kê lô (p > 0,05) Kết định lượng thử độ hịa tan viên nhân lơ nâng cấp Hàm lượng lô P 010214 P020214 P030614 103,8 %; 102,4 % 99,3 %, đạt yêu cầu tiêu chuẩn Độ hòa tan lơ trình bày bảng 3.48 (Chi tiết phụ lục 6.9, 6.10 6.11) Bảng 48 Kết thử độ hòa tan viên nhân lô nâng cấp Thời gian % hoạt chất hòa tan theo thời gian, n = 12 viên (giờ) Lô P010214 Lô P020214 Lô P030214 17,06 17,37 16,26 25,69 27,35 26,70 42,64 44,66 43,45 56,94 55,53 57,62 72,03 71,41 69,94 10 82,16 79,96 79,14 12 89,91 91,43 87,61 Từ bảng 3.48 cho thấy độ hịa tan viên nhân lơ nâng cấp tương đương (hệ số f2 > 75) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Khi so với viên nhân qui mơ phịng thí nghiệm, độ hịa tan viên nhân lơ nâng cấp khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Các kết cho thấy qui trình nâng cấp thành cơng Bao phim kiểm sốt qui trình giai đoạn bao phim Kết theo dõi thông số bao thể Biểu đồ 3.21 Thông số 80 70 60 50 Tốc độ nồi 40 tốc độ phun dịch Nhiệt độ mặt viên 30 Nhiệt độ cài đặt 20 10 0 30 60 90 120 150 180 Thơi gian (phút) Biểu đồ 3.21 Diễn biến thông số giai đoạn bao phim chống ẩm lô P010214 Qua biểu đồ Biểu đồ 3.21 cho thấy 30 phút đầu, thông số chưa ổn định giai đoạn hiệu chỉnh Từ phút thứ 30 kết thúc, thông số ổn định không cần hiệu chỉnh Q trình bao phim lơ P020214 P030614 có ổn định tương tự Kết đo độ hịa tan viên bao phim lơ P010214, P020214 P030614 trình bày Biểu đồ 3.24 (chi tiết phụ lục 6.12, 6.13 6.14) 100 90 % HC giải phóng 80 70 60 50 40 30 20 Lô P010214 Lô P020214 Viên đối chiếu Lô P030614 10 0 10 11 12 13 Thời gian (giờ) Biểu đồ 24 Đồ thị độ hịa tan viên bao phim lơ nâng cấp Qua biểu đồ 3.24 cho thấy độ hòa tan lơ đạt tiêu chuẩn tương đương hịa tan so với thuốc đối chiếu Viên bao phim viên nhân tương ứng lô đạt tương đương hịa tan, có hệ số f2 > 70 Hàm lượng hoạt chất lô nâng cấp đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn qui định Với chất lượng xác định cỡ lô sản xuất, sản phẩm từ lô nâng cấp sử dụng cho nghiên cứu độ ổn định tương đương sinh học 3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở Đã đề xuất tiêu chuẩn sở chế phẩm (chi tiết phụ lục 11) Tiêu chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương thẩm định áp dụng để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng sản phẩm nghiên cứu theo dõi độ ổn định 3.2.3 Đánh giá độ ổn định Các lô theo dõi độ ổn định gồm P 010214; P 020214 P 030614 Sản phẩm đóng chai thủy tinh 40 viên, miệng seal kín, hộp chai 3.2.3.1 Kết đánh giá độ ổn định theo phương pháp lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 + 2oC; độ ẩm tương đối 75 + 5%) Sản phẩm đạt độ ổn định sau tháng theo dõi Tuy nhiên, không dùng để dự đốn tuổi thọ thực nghiệm lơ P 010214 có giảm hàm lượng > 5,0 % so với thời điểm ban đầu (giảm 7,8 %) 31 3.2.3.3 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện theo dõi thực (nhiệt độ 30 + 2oC; độ ẩm tương đối 75 + 5%) Kết đánh giá cảm quan, hàm lượng lô sau 18 tháng theo dõi trình bày bảng 3.57 Bảng 57 Kết theo dõi điều kiện thực lô sản phẩm Tháng Cảm quan Hàm lượng (%) theo natri valproat P010214 P020214 P030614 P010214 P020214 P030614 Đạt Đạt Đạt 103,6 102,0 98,7 Đạt Đạt Đạt 102,2 97,5 99,1 Đạt Đạt Đạt 104,8 101,2 98,0 Đạt Đạt Đạt 102,4 100,4 97,4 12 Đạt Đạt Đạt 101,9 100,5 97,4 18 Đạt Đạt Đạt 101,4 100,8 100,0 Kết bảng 3.57 cho thấy sản phẩm đạt chất lượng theo tiêu chuẩn sau 18 tháng theo dõi Ở thời điểm tháng, lơ P020214 có hàm lượng thấp bất thường, ngun nhân sai số thơ kiểm nghiệm mẫu Với kết này, cộng thêm thời gian lưu mẫu (t0) độ ổn định lô sản phẩm 24 tháng 3.3 NGHIÊN CỨU TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC IN VIVO 3.3.1 Xây dựng thẩm định qui trình định lƣợng hoạt chất huyết tƣơng 3.3.1.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống Kết khảo sát tính tương thích hệ thống thu kết đáp ứng pic thời gian lưu lần phân tích độc lập có giá trị RSD % < %, cho thấy hệ thống đạt tương thích 3.3.1.2 Độ đặc hiệu Kết sắc ký mẫu huyết tương trắng cho thấy thời gian lưu AV chuẩn nội (IS) khơng có pic Mẫu huyết tương thêm AV nồng độ LLOQ (1g/ml) nội chuẩn (5 µg/ml) có pic đặc trưng AV IS, với đáp ứng pic (so với mẫu trắng) thời gian lưu AV > lần, thời gian lưu IS > 20 lần Các kết cho phép kết luận phương pháp sắc ký đạt tính đặc hiệu yêu cầu 3.3.1.3 Độ nhiễm chéo Kết đánh giá độ nhiễm chéo phương pháp thu kết : Tỷ lệ đáp ứng pic mẫu LLOQ/mẫu trắng thời gian lưu AV có giá trị > lần, thời gian lưu IS > 20 lần Với kết cho thấy phương pháp đạt yêu cầu độ nhiễm chéo 3.3.1.4 Ảnh hưởng mẫu Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu nồng độ LQC HQC có độ lặp lại tỷ số MFAV/MFIS nồng độ LQC với CV % = 11,9 %, nồng độ HQC với CV % = 12,4 % (đều  15 %) Kết luận mẫu không ảnh hưởng đến kết phân tích 3.3.1.5 Khoảng tuyến tính Kết xác định khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp từ 1- 100 µg/ml, với hệ số trọng số (weighting) 1/x2 3.3.1.6 Giới hạn định lượng (LLOQ) Kết phân tích cho thấy độ đạt giới hạn 80 - 120 % so với nồng độ thực; Độ xác có CV % < 20 %; Đáp ứng mẫu LLOQ > lần đáp ứng mẫu trắng thời gian lưu AV lớn 20 lần đáp ứng pic mẫu trắng thời gian lưu IS Với kết cho thấy nồng độ 1g/ml LLOQ phương pháp 3.3.1.7 Độ độ xác Kết phân tích mẫu kiểm tra cho thấy : - Độ ngày khác ngày từ 85 – 115 % - Độ xác (CV %) ngày khác ngày  15 % Với kết trên, cho phép kết luận phương pháp đạt độ độ xác yêu cầu 3.3.1.8 Độ độ xác phương pháp pha loãng Các kết thực nghiệm cho thấy tất nồng độ khảo sát (AC1, AC2 AC3) có độ khoảng 85 % - 115% so với giá trị thực, độ lặp lại có CV %  15 % Với kết cho thấy phương pháp đạt yêu cầu độ độ xác pha lỗng 3.3.1.9 Độ phục hồi Kết khảo sát mẫu LQC, MQC HQC cho thấy tỷ lệ thu hồi IS đạt 100,5 %, tỷ lệ thu hồi trung bình AV nồng độ đạt từ 99,6 – 104,8 % Giá trị CV % mẫu xử lý chiết tách không qua xử lý (pha mẫu)  10 % Với kết cho thấy phương pháp đạt độ phục hồi qui định 3.3.1.10 Độ ổn định Kết độ ổn định dung dịch mẫu khảo sát thu là: - Dung dịch nội chuẩn gốc dài ngày: 33 ngày nhiệt độ 2- 80C; - Dung dịch nội chuẩn làm việc: nhiệt độ phòng; - Mẫu huyết tương thời gian ngắn: nhiệt độ phòng; - Mẫu huyết tương thời gian dài: 53 ngày nhiệt độ - 350C+ 50C; -Mẫu huyết tương đông – rã: vòng; - Độ ổn định mẫu auto – sampler: 20 200C 3.3.2 Đánh giá tƣơng đƣơng hòa tan in vitro Tương đương độ hòa tan chế phẩm nghiên cứu (lô P030614) so với thuốc đối chiếu Depakine Chrono 500 mg (lô 3A780) thực môi trường pH 1,2; 4,5 6,8 (chi tiết phụ lục 6.15, 6.16, 6.17, 6.18, 6.19 6.20) Kết có f2 > 50, cho phép kết luận chế phẩm đạt tương đương hòa tan in vitro 3.3.3 Đánh giá tƣơng đƣơng sinh học In vivo 3.3.3.1 Thủ tục pháp lý Các thủ tục pháp lý cần thiết hoàn tất trước tiến hành trình đánh giá tương đương sinh học 3.3.3.2 Đánh giá tương đương sinh học tình trạng đói Xác định thơng số dược động học trung bình tình trạng đói Các thơng số DĐH trung bình 12 NTN uống thuốc thử thuốc đối chiếu tình trạng đói trình bày bảng 3.65 (Chi tiết phụ lục 10.4 10.5) Bảng 65 Các thông số dược động học TB 12 NTN dùng thuốc thử thuốc đối chiếu tình trạng đói Thơng số Cmax  SD AUC0-72  SD AUC0- SD Tmax (µg/ml) (µg.giờ/ml) (µg.giờ/ml) SD (giờ) Chế phẩm Thuốc thử Thuốc đối chiếu 41,3 6,7 1047,0 250,9 1120,3 289,7 Ke 8,61,3 0,0450,01 37,37,2 1018,0 237,1 1104,4 270,8 10,42,4 0,043 0,09 Kết bảng 3.65 cho thấy có Tmax có khác biệt rõ, thơng số dược động học trung bình cịn lại khác biệt thuốc Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến thơng số DĐH tình trạng đói Đã xác định yếu tố ảnh hưởng lên Cmax trình tự thử, cá thể thuốc; yếu tố ảnh hưởng lên AUC cá thể Các kết cho thấy yếu tố cá thể có ảnh hưởng nhiều đến sinh khả dụng AV Với giá trị CV % nhỏ, hệ số độ mạnh phép thử đạt giá trị cao (power > 99 %), dao động cá thể không lớn Điều phép kết luận thử nghiệm có độ lặp lại tốt So sánh Cmax , AUC, Tmax thuốc tình trạng đói Kết tóm tắt Cmax, AUC thuốc trình bày bảng 3.69 Bảng 3.69 Tóm tắt Cmax, AUC thuốc tình trạng đói Thơng Giá trị TB* Giá trị TB* số Tỷ lệ giá trị TB*thuốc Khoảng tin thuốc Thử thuốc đối chiếu thử/thuốc đối chiếu (%) cậy 90 % 40,803 36,699 111,2 103,75 % - 119,14 % AUC0-t 1018,556 992,057 102,7 97,04 % - 108,62 % AUC0- 1085,060 1073,094 101,1 95,61 % - 106,94 % Cmax * giá trị trung bình hình học Kết so sánh theo thống kê phi tham số cho thấy Tmax thuốc tình trạng đói khác khơng có ý nghĩa thống kê Kết luận tương đương sinh học tình trạng đói Dựa kết thu (bảng 3.69 Tmax không khác nhau) cho phép kết luận hai thuốc đạt tương đương sinh học in vivo theo hướng dẫn ASEAN 2004 tình trạng đói (phụ lục 10.13) 3.3.3.3 Đánh giá tương đương sinh học tình trạng no Các thơng số DĐH trung bình 12 NTN uống thuốc thử thuốc đối chiếu tình trạng no trình bày bảng 3.70 (Chi tiết phụ lục 10.10 10.11) Bảng 70 Thông số DĐH TB 12 NTN dùng thuốc thử thuốc đối chiếu tình trạng no Thơng số Cmax  SD AUC0-72  SD AUC0- SD Tmax SD Chế phẩm Thuốc thử Thuốc đối chiếu (µg/ml) (µg.giờ/ml) (µg.giờ/ml) (giờ) Ke 55,512,6 1330,5374,9 1441,8 429,3 7,61,3 0,0410,009 44,97,5 1391,0 337,5 1538,4426,6 10,62,1 0,0370,006 Qua Bảng 3.70 cho thấy thời gian đạt Cmax thuốc thử sớm thuốc đối chiếu đạt giá trị cao Tuy nhiên, AUC thuốc thử có giá trị thấp so với thuốc đối chiếu Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến thơng số DĐH tình trạng no Phân tích yếu tố ảnh hưởng cho thấy : ảnh hưởng lên Cmax cá thể thuốc; ảnh hưởng lên AUC (AUC0-72 AUC0-) cá thể So sánh Cmax, AUC Tmax thuốc thử tình trạng no Kết tóm tắt Cmax, AUC thuốc trình bày bảng 3.74 Bảng 3.74 Số liệu so sánh Cmax, AUC thuốc tình trạng no Thông số Giá trị TB* Giá trị TB Tỷ lệ giá trị TB* thuốc Khoảng tin thuốc Thử * thuốc đối chiếu thử/ thuốc đối chiếu (%) Cmax cậy 90 % 54,275 44,305 122,5 102,09 % - 133,89 % AUC0- t 1280,212 1352,195 94,7 82,69 % - 108,41 % AUC0- 1381,123 1482,909 93,1 80,57 % - 107,67 % * giá trị trung bình hình học Kết so sánh theo thống kê phi tham số cho thấy Tmax thuốc tình trạng no khác khơng có ý nghĩa thống kê Kết luận tương đương sinh học tình trạng no Dựa kết thu (bảng 3.74 Tmax không khác nhau) cho phép kết luận hai thuốc đạt tương đương sinh học in vivo theo hướng dẫn của DĐVN IV tình trạng no (phụ lục 10.14) CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN 4.1.1 Xây Định lƣợng hoạt chất chế phẩm Đề tài khảo sát chọn methanol làm dung mơi hịa tan mẫu thử, vừa giúp loại bỏ ảnh hưởng polyme thành phần, cịn giúp hịa tan dễ thành phần AV khó tan Phương pháp chuẩn bị mẫu thử theo cách đơn giản so với cách chuẩn bị mẫu thử chuyên luận viên PTKD divalproex natri USP 36 Về hệ pha động, đề tài khảo sát chọn pha động acetonitril – đệm phosphat pH 2,7 (55 : 45) chứng minh NV chuyển đổi thành AV hệ pha động trình phân tích Với hệ pha động chọn, có khác biệt so với pha động dùng định lượng divalproex natri USP 36 hay IP 2010 có điểm chung dựa chuyển đổi NV thành AV môi trường pH acid 4.1.2 Tiêu chuẩn độ hịa tan tốc độ phóng thích dƣợc chất Tiêu chuẩn độ hòa tan chế phẩm khảo sát xây dựng dựa kết đo độ hòa tan viên đối chiếu, kết hợp với tài liệu hướng dẫn chung độ hòa tan viên PTKD 62 Tiêu chuẩn độ hịa tan ngồi thời điểm 2, 12 giờ, có thêm thời điểm 45 phút môi trường HCl 0,1 N (tương ứng mơi trường dày) nhằm mục đích kiểm sốt tỷ lệ hoạt chất giải phóng để tránh nguy gây kích ứng dày dược chất (AV) 4.2 KỸ THUẬT BÀO CHẾ 4.2.1.Về kỹ thuật bào chế viên nhân Về phối hợp AV NV bào chế NV có độ tan cao, khơng thích hợp để bào chế dạng PTKD, AV có độ tan thấp hơn, có dạng lỏng nên khơng thích hợp cho bào chế dạng viên nén Tuy nhiên, kết hợp NV với AV tạo hỗn hợp dược chất có độ tan phù hợp cho thiết kế dạng PTKD Đề tài dùng aerosil, với dicanxi phosphat bột nguyên liệu NV để tạo thành hỗn hợp bột hút hiệu quả, kết hợp với kỹ thuật bào chế trộn, sấy, xay,…đã chuyển dạng lỏng AV thành hỗn hợp bột nguyên liệu cách dễ dàng, phù hợp để bào chế dạng thuốc viên Tỷ lệ sử dụng aerosil đề tài nghiên cứu phù hợp với kết công bố Phaechamud cộng (2010) 87 Vấn đề kết hợp polyme tạo khung Đề tài sử dụng kết hợp polyme tạo khung HPMC K 15M với HPMC 615 để kiểm sốt GPHC Chính phối hợp polyme có độ nhớt khác giúp khung kiểm soát hiệu GPHC, phù hợp cho dược chất có độ tan khác 24, 116 So với cơng trình Phaechamud cộng (2010), dùng HPMC K15M tạo khung, kết cho thấy khung có phối hợp thêm HPMC 615 đạt tương đương hòa tan cao so với khung dùng HPMC K15M (khung phối hợp polyme đạt f2 = 82,2 so với khung dùng HPMC K15M có f2 = 75,2) 4.2.2 Về nghiên cứu lựa chọn Polyme bao phim chống ẩm Bằng phương pháp đánh giá có đủ độ tin cậy, đề tài chọn Eudragit E 100 với tỷ lệ sử dụng phù hợp bao chống ẩm 4mg/cm2 So với cơng trình Phaechamud cộng (dùng eudragit L30- D55 bao chống ẩm với tỷ lệ 0,5 % so với khối lượng viên), việc dùng Eudragit E 100 với tỷ lệ 2,2 % bao chống ẩm có nhiều ưu điểm cho lớp bao phim dày hơn, có độ che phủ tốt hơn, tăng hiệu chống ẩm Ngồi ra, cịn thuận tiện vận chuyển, bảo quản, tồn trữ hay dễ dàng vệ sinh thiết bị bao phim 4.2.3 Về động học phóng thích hoạt chất từ chế phẩm Với phương trình động học thuốc đối chiếu thuốc thử yˆ = 29,37 t - 17,69 yˆ = 29,06 t - 14,79 cho thấy GPHC tn theo phương trình Higuchi, mơ tả phóng thích hoạt chất theo chế khuếch tán Kết cho thấy có tương đương mơ hình tốn học chế GPHC thuốc thử thuốc đối chiếu 4.2.4 Về vấn đề xây dựng thẩm định quy trình sản xuất Với cách tiếp cận có hệ thống, từ khảo sát thăm dị qui mơ phịng thí nghiệm qui mơ sản xuất nâng cấp cho thấy trình nghiên cứu thực bản, thơng số quy trình xây dựng sở khoa học đạt độ tin cậy Ngồi ra, có kết hợp thẩm định thực nghiệm với thẩm định thống kê áp dụng để đánh giá phù hợp ổn định thơng số qui trình 4.3 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƢƠNG ĐƢƠNG SINH HỌC 4.3.1 So sánh tƣơng đƣơng hòa tan so với thuốc đối chiếu Tương đương hòa tan thuốc thử thuốc đối chiếu môi trường thử nghiệm (pH 1,2; 4,5 6,8) với chênh lệch nhỏ độ hòa tan thời điểm đánh giá tất môi trường thử ( lệch  5,5 %) cho phép dự đốn thuốc thử thuốc đối chiếu có khả đạt tương đương sinh học cao 44 4.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học 4.3.2.1 Về xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất Phương pháp UHPLC-MS/MS phân tích hoạt chất huyết tương có ưu điểm có độ nhạy cao, giới hạn định lượng nhỏ (1g/ml), thời gian phân tích ngắn (khoảng phút/mẫu), thể tích tiêm mẫu (0,5 l) cho phép tiết kiệm lượng mẫu phân tích, thao tác chuẩn bị mẫu nhanh đơn giản so với số công trình nghiên cứu định lượng AV huyết tương công bố 72, 100 4.3.2.2 Về phương pháp xử lý mẫu Đề tài chọn phương pháp xử lý mẫu kết tủa protein với acetonitril với ưu điểm đơn giản, thời gian chuẩn bị mẫu nhanh, rút ngắn đáng kể thời gian phân tích Phương pháp xử lý chứng minh có tỷ lệ thu hồi đạt xấp xỉ 100,7 % 4.3.2.3 Về thời điểm lấy mẫu máu Các thời điểm lấy mẫu đánh giá nồng độ thuốc máu tiến hành mốc thời gian 0, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 24, 36, 48 72 giờ, với tổng số điểm 16 điểm thời điểm lấy mẫu cuối 72 hoàn toàn phù hợp với qui định theo hướng dẫn thử tương đương sinh học EMEA 47 FDA 108 4.3.2.5 Về nghiên cứu tương đương sinh học chế phẩm Kết nghiên cứu tình trạng đói no cho thấy có ảnh hưởng yếu tố cá thể lên thông số dược động (C max AUC) Sự dao động Cmax cho thấy trình hấp thu dược chất phụ thuộc nhiều vào điều kiện cá thể Trong tình trạng đói, biến thiên Cmax AUC cá thể nhỏ so với tình trạng no, điều cho thấy yếu tố thức ăn ảnh hưởng lên sinh khả dụng trình hấp thu dược chất AV NV 4.4 ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ TUỔI THỌ Sản phẩm ổn định sau tháng theo dõi điều kiện lão hóa cấp tốc Tuy nhiên, lơ P 010214 có giảm hàm lượng so với thời điểm ban đầu > 5% nên không dùng phương pháp ước tính tuổi thọ 31 Trong điều kiện theo dõi thực, lơ P 020214 có giảm hàm lượng bất thường thời điểm tháng Tuy nhiên, kết sai số thô Với kết ổn định sau 18 tháng theo dõi điều kiện thực, cộng thêm thời gian lưu mẫu trước đưa vào theo dõi độ ổn định (t0) tuổi thọ thực lô đạt 24 tháng KẾT LUẬN Luận án hoàn thành nội dung mục tiêu nghiên cứu đặt sau : Đã xây dựng cơng thức, qui trình bào chế viên nhân PTKD chứa AV NV qui mô phịng thí nghiệm Các kết cụ thể đạt : - Đã chuyển dạng AV từ lỏng thành bột rắn tá dược hút aerosil kỹ thuật bào chế đơn giản Trên sở đó, xây dựng quy trình bào chế hỗn hợp bột nguyên liệu đơn giản dễ dàng nâng cấp lên qui mô sản xuất lớn - Đã xác định công thức tối ưu cho GPHC gồm tá dược tạo khung HPMC K15M HPMC 615 tá dược khác - Đã chọn Eudragit E 100 tỷ lệ sử dụng mg/cm2 (tương đương 2,2 % kl/kl so với viên nhân) để bao phim chống ẩm - Đã xây dựng qui trình sản xuất qui mơ thí nghiệm 2000 viên/lơ với thông số xác định thực nghiệm Đã nâng lên qui mô 20.000 viên, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng theo dõi độ ổn định sản phẩm Các kết cụ thể đạt : - Đã sản xuất thử lô để thăm dị thơng số qui trình qui mơ nâng cấp xác định thông số phù hợp qui trình - Đã tiến hành sản xuất lô sản phẩm qui mô nâng cấp chứng minh qui trình đạt tính ổn định cần thiết - Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm Tiêu chuẩn Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương thẩm định, đưa vào áp dụng để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng sản phẩm - Đã theo dõi độ ổn định sản phẩm điều kiện lão hóa cấp tốc điều kiện thực lô nâng cấp Kết sản phẩm đạt độ ổn định 18 tháng điều kiện theo dõi thực Đã đánh giá tương đương sinh học chế phẩm Các kết đạt : - Đã xây dựng phương pháp UHPLC-MS/MS định lượng AV dịch sinh học đưa vào áp dụng đánh giá TĐSH chế phẩm - Đã đánh giá tương đương sinh học 12 NTN Kết sản phẩm nghiên cứu đạt tương đương sinh học so với thuốc đối chiếu KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu sở khoa học để xin cấp phép sản xuất sản phẩm qui mô hữu Đồng thời tiếp tục hướng nghiên cứu nâng cấp hoàn thiện qui mô sản xuất công nghiệp DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phùng Chất, Huỳnh Thanh Phong, Trương Phan Ngọc My, Lê Hậu, (2014), Nghiên cứu xây dựng cơng thức viên nén giải phóng kéo dài chứa acid valproic natri valproat, Tạp chí dược học, 454, tr 9-11, 25 Phùng Chất, Huỳnh Thanh Phong, Lê Hậu, (2014), Định lượng tổng lượng acid valproic natri valproat phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí dược học, 456, tr 34-37, 42 Phùng Chất, Huỳnh Thanh Phong, Nguyễn Đức Toàn, Lê Hậu, (2015), Thẩm định quy trình sản xuất viên nén natri valproat acid valproic phóng thích kéo dài qui mơ pilot, Tạp chí dược học, 470, tr 48-52, 79 Phùng Chất, Tạ Mạnh Hùng, Hoàng Văn Đức, Nguyễn Thị Dung, Lê Hậu,(2015), Nghiên cứu định lượng acid valproic huyết tương người phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, Tạp chí dược học, 473, tr 56-61 ... để đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học cho chế phẩm chứa AV, NV hỗn hợp thành phần Đóng góp nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học thuốc chứa AV NV Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế. .. Đã đánh giá tương đương sinh học chế phẩm Các kết đạt : - Đã xây dựng phương pháp UHPLC-MS/MS định lượng AV dịch sinh học đưa vào áp dụng đánh giá TĐSH chế phẩm - Đã đánh giá tương đương sinh học. .. điểm sinh học tác dụng trị liệu chế phẩm chứa AV, NV; nghiên cứu kỹ thuật bào chế viên PTKD chứa hoạt chất AV NV; phương pháp kiểm nghiệm hoạt chất chế phẩm dịch sinh học; nghiên cứu dược động học